Summary
מיקרוסקופיה Intravital היא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים שונים בבעלי חיים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מפורטת להדמית הדינמיקה של מבני subcellular, כגון גרגרי ההפרשה, בבלוטות הרוק של עכברים חיים.
Abstract
כאן אנו מתארים הליך למבני subcellular תמונה במכרסמים חיים המבוססים על השימוש במיקרוסקופ intravital confocal. כאיבר מודל, אנו משתמשים בבלוטות הרוק של עכברים חיים מכיוון שהם מספקים מספר יתרונות. ראשית, הם יכולים להיחשף בקלות כדי לאפשר גישה לאופטיקה, והתייצבו כדי להקל על ההפחתה של ממצא התנועה בשל פעימות לב ונשימה. זה מקל באופן משמעותי הדמיה ומעקב אחר מבני subcellular קטנים. שנית, רוב אוכלוסיות התאים של בלוטות הרוק נגישים מפני שטח של האיברים. זה מאפשר השימוש במיקרוסקופיה confocal שיש לו רזולוציה מרחבית גבוהה יותר מטכניקות אחרות שהיה בשימוש במשך in vivo הדמיה, כגון שני פוטונים במיקרוסקופ. לבסוף, ניתן להשפיע על בלוטות רוק בקלות פרמקולוגית וגנטי, ובכך לספק מערכת חזקה כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ברמה מולקולרית.
במחקר זה אנו מתמקדים בפרוטוקול נועד לעקוב קינטיקה של exocytosis של גרגרי הפרשה בתאי acinar ואת הדינמיקה של קרום הפלזמה הפסגה שבו גרגרי הפרשת הפתיל על גירוי של קולטנים בטא adrenergic. באופן ספציפי, השתמשנו בעכבר מהונדס שישתף מבטא GFP cytosolic ופפטיד ממוקד קרום התמזגו עם חלבון טנדם-עגבניות ניאון. עם זאת, הנהלים ששמשנו לייצוב תמונה ובלוטות הרוק יכולים להיות מורחבים לדגמי עכבר אחרים ומצמידים את גישות אחרות לתווית רכיבים סלולריים in vivo, המאפשר ההדמיה של מבני subcellular שונים, כגון endosomes, lysosomes, מיטוכונדריה, ו שלד התא אקטין.
Introduction
בשני העשורים האחרונים כניסתו של מיקרוסקופיה חי והשימוש בחלבוני ניאון הובילו לפריצות דרך משמעותיות בכל תהליך סלולארי ניתן להעלות על הדעת, ובכך לקדם את ההבנה של ביולוגיה של תא 1 שלנו. תחום זה נהנה מאוד מהשימוש בתרביות תאים של יונקים שהן מערכות מודל חזקות מאוד, במיוחד כאשר מדובר במניפולציות ניסיוני. עם זאת, הם לא לעתים קרובים לספק ייצוג אמיתי של הביולוגיה של אורגניזמים רב תאיים מורכבים 2. בעיה זו החלה להיות מטופל על ידי הפיתוח של מיקרוסקופיה intravital (IVM) שפתחה את הדלת לבירורן של שאלות ביולוגיות מרכזיות בתחומים כמו נוירוביולוגיה, אימונולוגיה וגידול ביולוגיה 3. עד כה, רוב המחקרים המבוססים על IVM בוצעו ברמות של רקמות ותאים בודדים, מבלי לספק כל מידע על הדינמיקה של תאי subcellular. לאחרונה, המעבדה ואחרת שלנוים פיתחו טכניקות IVM מסוגלים מבני subcellular הדמיה במכרסמים חיים 4-7, 13-15 ומאפשרים מניפולציות תרופתי וגנטיות בגוף חי. גישה זו נוצלה בעבר על ידי לנו ללמוד סחר קרום in vivo, ובאופן ספציפי יותר אנדוציטוזה ומוסדרת exocytosis 6,7.
מערכת המודל הניסויית שלנו מבוססת על חשיפה, ייצוב והדמית בלוטות רוק submandibular (SGS) של מכרסמים בהרדמה. הבחירה של SGS כאיבר מודל לIVM היא בשל העובדה שהבלוטות נגישות בקלות על ידי ביצוע ניתוח קטן, יכול להיות מוחצן מבלי להתפשר על הפיסיולוגיה שלהם, והתייצב כדי להפחית את חפצי התנועה בשל פעימות לב ונשימה. בנוסף, SGS ניתן להשפיע באופן סלקטיבי מבחינה גנטית על ידי הזרקת וקטורים מבוססים או ויראלי או לא ויראלי דרך צינור רוק 8,9. לבסוף, SGS הם בלוטות אקסוקרינית מורכבות מepith המקוטבתאי elial, המהווים את acini והצינוריות, תאי myoepithelial, ואוכלוסייה מורכבת של תאי סטרומה. מסיבה זו, הם מודל מצוין ללמוד exocytosis, אנדוציטוזה, מסירת גן, ושלד תא אקטין, מודגש כמו במחקרים האחרונים שלנו 10, ומציע את ההזדמנות ללמוד היבטים של ביולוגיה של תא, כגון קוטביות תא, חלוקת תא, תא צמתים תא, ותעלות יונים.
במאמר זה אנו מתארים בפירוט פרוטוקול הדמיה להשגת הרזולוציה subcellular באפיתל של SGS של עכבר חי. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד תמונת גרגרי ההפרשה בתאי acinar של SGS במהלך exocytosis המוסדר. כפי שניתן לראות בעבר, על גירוי עם אגוניסטים של הקולטן בטא adrenergic, גרגרי הפרשה להתמזג עם קרום הפלזמה הפסגה ויתמוטטו בהדרגה, משחררים את התוכן שלהם לcanaliculi acinar 6. המטרה שלנו היא לספק את הכלים הבסיסיים לחוקרים עם מ 'ניסיון inimal בפרוצדורות כירורגיות וטיפול בבעלי חיים, כך שהם יכולים לבצע בהצלחה IVM ברזולוציה subcellular. מאז החלק המאתגר ביותר בIVM הוא ההכנה של בעל החיים, כאן אנו מתמקדים בתיאור של פרוצדורות כירורגיות הבסיסיות שמנוצלות לחשוף ולשתק את SGS מבלי להתפשר על התפקוד שלהם. ובאשר לנהלים לתייג מבני subcellular, מספר אסטרטגיות, כגון משלוח מערכתי של בדיקות ניאון, שימוש בבעלי החיים מהונדסים, או שילוב של שניהם, כבר תאר במקום אחר 7,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
חלק 1: מיקרוסקופים והכנת תוכנית ההתקנה של ההדמיה
- כל מיקרוסקופ confocal ההפוך צריך להיות מתאים לIVM. במחקר זה מיקרוסקופ אולימפוס IX81 הפוך, מצויד ביחידת confocal סריקת לייזר FluoView-1000 היה בשימוש. כדי להשיג את הפתרון הטוב ביותר האפשרי, השימוש במטרות NA גבוהים, כגון מים טבילת UPLSAPO 60x/1.20 NA, וטבילת שמן Plan-Apo 60x/1.42 NA מומלץ. יש מטרות שמן טבילת יעילות איסוף גבוהה יותר ולמרות שהם דורשים את השימוש של coverslip בין הרקמה והאובייקטיבית, הם מספקים איכות הדמיה טובה יותר כאשר משתמשים בו לאזורי תמונה בתוך 15-20 מיקרומטר מהמשטח. בנוסף, השימוש בשמן מבטל את הדאגה לאידוי מים במהלך פגישות הדמיה ארוכות יותר. על מנת לשמור על הטמפרטורה והלחות, מיקרוסקופ צריך להיות סגור לחלוטין ומסופק עם אוויר חם וhumidified. לחלופין, בעלי החיים, הבמה מיקרוסקופ, ומטרה חייבת להיות מחוממת באמצעים אחרים. לדוגמא, רפידות חום כימי יכולות לשמש לבעלי החיים ועל הבמה, ותנורים אובייקטיביים שתוכננו במיוחד יכולים לשמש למטרה (איור 1 א). דוד המטרה צריך להיות מופעל ביום 30 דקות לפני שמתחיל את ההליך. הערה: כאשר רפידות החום הן שימוש כדי לשמור על בעלי החיים לחמם גזה יש למקם בין הכרית והעור. העור צריך להיות במעקב לכוויות.
- יש שלבים סטנדרטיים ברוב המיקרוסקופים confocal הזמינים מסחרי פתיחה שמשמשת להוספת המחזיקים שונים המשמשים כדי להתאים שקופיות, צלחות פטרי, וצלחות בגדלים שונים. על מנת לבצע IVM, להוסיף שלב סטנדרטי ל35 מ"מ צלחות פטרי הוא הפוך במהופך, מכוסה בשקופיות זכוכית 40 מ"מ, המובטחת לאחר מכן על ידי גריז ואקום הגבוה סיליקון או סרטי הדבקה (איור 1 א). הוספה מותאמת אישית יכולה גם להיות מיוצרת מ 3 מ"מ צלחת אלומיניום עבה. משטח הזכוכית אז CLeaned עם 70% אתנול וסחב עם Kimwipe.
- ייצור בעל מותאם אישית לקיבוע SGS (מייצב). מטרתו של בעל היא לייצב את SGS במקום ונוקשה זוגם לבמה וcoverslip. בעל יכול להיות עשוי מצלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מ. ראשית, החלק התחתון של המנה הוא שבור מן הקירות וחתוכים למלבנים של 15 x על 10 מ"מ. לאחר מכן, הקצוות מעוגלים ומלוטש באמצעות נייר זכוכית עדינה. ארבעה מפרידי (1.5-2 מ"מ) בנויים על ידי הסרת הטיפים הגומי של בוכנות מזרק 1 מיליליטר. על ידי שימוש בנייר זכוכית עדינה, את פני השטח של מפרידי וארבע פינות של פיסת הפלסטיק מלוטש. לאחר מכן מפרידי מודבקים באמצעות דבק מגע דביק, ולאחר מכן החליקו באמצעות נייר זכוכית עדינה על משטח שטוח. שים לב, כי לבעלי חיים ישנים יותר, בגודל של בעלים והמפרידים עשויים להיות מוגבר כדי להכיל את הבלוטות מעט גדולות יותר.
- הכנת ג'ל הצימוד האופטי. 0.3% קרבומר-940 (ג'ל טבלה 2) הוא הוכן על ידי החימום של מים טהורים 100 מיליליטר והמסת 5.47 גרם של D-סורביטול. לאחר מכן, 0.3 גרם של קרבומר-940 מתווספים. הכוס צריכה להיות מכוסה והניחה על צלחת ערבוב חמה (הגדרת חום הנמוכה ביותר) לכמה שעות או עד שכל גושי קרבומר מתמוססים לחלוטין. לבסוף, Trietanolamine מתווסף ירידה מבחינת תוך ערבוב בעדינות, עד שיגיע ה-pH של כ 7.4. ג'ל מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס 13.
חלק 2: בעלי חיים ובהרדמה
- לפני ביצוע כל ניסויים בבעלי חיים, צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת פרוטוקולי הטיפול בבעלי החיים ואתיקה המקומית שלך. חשוב מכך, חוקרים צריכים להיות מאומנים כראוי לביצוע פעולות כירורגיות וכדאי להתייעץ עם הוועדה המקומית שלהם טיפול בבעלי חיים או וטרינר מוסד לפני שתמשיך עם ההליך.
- במחקר זה, מודל של עכברים (GFP / mTomato עכבר) הנגזר על ידי חציית עכברי FVB להביע GFP מסיס wi (GFP-העכבר)עכברי C57B6 ה לבטא פפטיד ממוקד קרום התמזגו עם חלבון טנדם-עגבניות ניאון (mTomato עכבר) 6 היה בשימוש. הערה: זה בדרך כלל לוקח 20-30 דקות לבעלי החיים כדי להיות בהרדמה מלאה והכין עבור הדמיה
- עכברים הם שוכנו בסביבה מבוקרת במתקן בעלי החיים ומותרים להסתגל במשך שבוע אחד לפני הניסוי. צעד זה הוא הכרחי עבור ההדמיה SGS שכן כל תוצאות מצוקה בפעילות הפרשה משופרת 12. מים ומזון כרצונך מודעה שסופקו. זכרים מ2 -5 חודשים ישנים משמשים לניסויי הדמיה (20-30 גר ').
- לפני ההרדמה, לשקול את בעלי החיים כדי לקבוע את המינון הנכון של חומר הרדמה.
- מאז המתח המושרה על ידי ממשל של הרדמה בזריקות עלול לפגוע בפעילות הפרשה של SGS, לגרום טרום הרדמה על ידי שאיפת isoflurane, ואחרי ההזרקה של חומרי הרדמה. למטרה זו, הנח את העכברים בעדינות לתוך תא האידוי, ולהדליק את זרימת החמצן (800-900 מ"מ כספית). הגדר את רמות isoflurane עד 3% כדי להתחיל את האינדוקציה טרום הרדמה.
- ברגע שהבעלים החיים הם חסרי הכרה, להזריק תערובת של 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו xylazine 20 מ"ג / קילוגרם לתוך חלל הצפק (25 מחט G). הרדמה הם מוכנים טריים על ידי דילול 100 מ"ג / מיליליטר xylazine ל20 מ"ג / מיליליטר בתמיסת מלח ולאחר מכן לערבב אותו עם קטמין. תערובת זו היא מדוללת יותר 1:01 עם מי מלח וכמות מתאימה מוזרקת המבוססת על המשקל של בעלי החיים. דילול זה מסייע במניעה מנת יתר מקרי. שים לב שהתערובת מאבדת את האפקטיביות שלה אחרי 20 דקות.
- שים לב לבעלי החיים לסימנים של ערות ולהזריק תערובת הרדמה יותר אם הם יוצאים מההרדמה (כ 75% מהמינון הראשוני בתוך 45 דקות לאחר הזריקה הראשונה, ו50% כל שעה לאחר מכן). בדוק את עומק ההרדמה כל 15 דקות על ידי צובט את הכפה וההתבוננות בתגובה. שים לב: תמיד לנהל משחת עיניים כדי למנועיובש בעיניים.
- הרדמה לגרום להיפותרמיה, אשר יכול להשפיע על שחזור של הניסויים ואת בריאותם של בעלי החיים. לכן, צריכים להיות כל הזמן עכברים תחת מנורת החום או על משטח מחומם לכל תקופת הניסוי. הערה: מנורת החום צריכה להיות לפחות 12-18 סנטימטר מבעלי החיים כדי למנוע שריפה
- טמפרטורת הגוף של בעלי החיים צריכה להיות במעקב עם מדחום מצויד בבדיקת טמפרטורה רקטלית.
חלק 3: ניתוח בעלי חיים ומיקום למיקרוסקופי Intravital
- הכן את סביבת העבודה עם כל מכשירי הניתוח (טבלת 1) שצריכה להיות נקי וסטרילי.
- לגלח את אזור הצוואר של העכבר עם גוזז חשמלי. נגב את הצד הגחוני של אזור הצוואר של העכבר הרדים עם ספוג גזה הספוג ב70% אתנול. ייבש את העודפים עם Kimwipe.
- עם פינצטה מעוקלת המשעממת להרים את חתיכה קטנה של עור בקו האמצע (approximately בקצה התחתון של שרירי masseter), ולעשות חתך קטן (איור 1).
- הכנס את המספריים לתוך הפתח ולהפריד את העור מהרקמה הבסיסית על ידי פתיחת להבי מספריים. להימנע מניזק לרקמת הבלוטות הבסיסית על ידי הצבעה את המספריים לכיוון החלק התחתון של העור. חזור על פעולה זו מספר פעמים עד שהעור מופרד מהרקמות העמוקות יותר (איור 1).
- בעזרת מספריים, חותך את רצועת עור רפוי רחב כ -3 מ"מ ו10 מ"מ ארוך. העור צריך להיות חתוך כך שהפתיחה מתחילה ליד הבסיס של SGS שבו העצב, את הצינור ואת כלי הדם לחבר את הבלוטה לשאר הגוף. לאחר ניקוי אזור הפצע, הפתיחה שנוצרה תהיה בצורת אליפסה ולמדוד בערך 8 x 12 מ"מ. שני SGS יהיה גלוי לאחר הפתיחה (איור 1).
- עם מזרק להחיל את הג'ל הצימוד האופטי לאמצע לחתוך ולנגב אותו לכיווןבחוץ עם גזה סטרילית. יש להשתמש בחתיכות נקיות של גזה לכל אחד למחות כדי למנוע כניסתה של שיער או דם לתוך הרקמה חשופה. חזור על פעולה זו עד שכל שיער הדם ורופפים הוסר.
- באמצעות # 7 פינצטה, להפריד את רקמת חיבור מבלוטת submandibular צודקת כל הדרך לבסיס של הבלוטה (לחלופין פרוטוקול זה יכול לשמש גם על SGS מהשמאל). ראשית, למצוא את הקצה של SG ולתפוס את רקמת חיבור כמה מילימטרים מעל הקצה של הבלוטה. לקרוע את רקמת חיבור סביב הבלוטה מבלי לפגוע parenchyma. (איור 1). ברגע שהבלוטה חשופה, בעדינות להפריד את רקמת חיבור מבלוטת. אם דימום מתרחש, לשטוף את הדם משם עם מי מלח. ודא כי כל רקמות חיבור מופרדות והבלוטה חשופה באופן מלא. שמור את הבלוטה לחה על ידי יישום ג'ל צימוד אופטי באופן קבוע.
- לפני הבאת בעלי החיים למיקרוסקופ, הנח חתיכה עבה של גזה וheaלא לארוז לבמה מיקרוסקופ כדי לשמור על טמפרטורה של 38 ± 2 ° C. הטמפרטורה של חבילת החום הכימי יכולה להיות מותאמת על ידי הגודל של הקיצוצים החושפים את הכיס הפנימי לאווירה. גזה מספקת כמה בידוד של חבילת חום משלב המתכת. מכסה את החלק העליון של חפיסת החום עם פיסת הגזה דקה גם כן.
- מניחים את החיה בצד שלה (צד ימין לבלוטה מימין) ועל גבי הגזה. מקם את החיה עם בלוטת רוק submandibular ממוקמת באמצע של coverslip (איור 1 ג).
- בעלי החיים צריכים להיות מאובטחים והתייצבו בעמדה זו לפני לשתק את הבלוטה. מניחים פיסת נייר דבק בצד הגחון של הכפה הקדמית הימנית של העכבר. הוק החותכות של העכבר על ידי תפר משי (איור 1 ג, הבלעה). יצירת מתח מסוים בין חוט המשי והכפה ולצרף אותם אל הבמה על ידי מיסוך קלטת. SG צריך להיות במנוחה באופן טבעי באמצעcoverslip. הראש ובית החזה צריך להיות התייצבו בנוסף ידי טריזי פלסטיק שיכול להיות מצמידים את הבמה.
- מניחים חתיכה קטנה של עדשת ניקוי רקמות מעל הבלוטה (איור 1 ג). להאריך את הבלוטה מעט ומניח את בעל מותאם אישית על הבלוטה. חוזקה כמה המייצב לבמה בסרט דבק. צימוד ניתן לשפר על ידי מהדק מתכת המחובר לבמה (איור 1 ג). יש להימנע מזוויות מתח וחדים כמו שהם עלולים לפגוע בזרימת הדם. מייד לאחר ההתייצבות לבדוק את זרימת הדם או על ידי בדיקת הבלוטה חזותית (שהוא צריך לשמור על צבע ורוד) או על ידי epifluorescence. בעכבר ה-GFP / m-עגבניות, שינויי ברוטו של זרימת הדם ניתן להעריך בקלות שכן הן כלי הדם וכמה תאי הדם מסומנים עם m-עגבניות.
- כסה את בעל החיים עם גזה ומשטח לוהט. למדוד את הטמפרטורה של הבלוטה נחשפה באמצעות מדחום המצויד wה-i תרמי בדיקה גמישה קטנה שהונחה במגע עם צד אחד של הבלוטה חשופה.
חלק 4: פרמטרי הדמיה
- באמצעות מיקוד תאורת epifluorescence על פני השטח של הבלוטה על ידי או באמצעות GFP או מערכת סינון RFP. מצא את פני השטח של SG, ולהעריך את זרימת הדם בנימים ואת המורפולוגיה הכוללת של הרקמה. סימנים של נזק לרקמות כוללים blebbing קרום או את המראה של וקואולות גדולה.
- להעריך את היציבות של הרקמה או דרך epifluorescence או על ידי מראש סריקת האזור שנבחר. הכנה יציבה היא חיונית, שכן רוב חפצי התנועה לא ניתן להסיר או לתקן בניתוח נתונים שלאחר עיבוד. אם ההכנה היא לא יציבה, התאמות נדרשות.
- כדי למצוא את תמונת מטוס מוקד הנכונה הבלוטות במצב טרום סריקה (זום 1X), ולעבור בהדרגה לכיוון האובייקטיבי coverslip עד מבני acinar, גרגרי הפרשה וpקרום lasma להיות נראה בבירור (איור 2).
- הפרמטרים ההדמיה לזמן לשגות תלויים בניסוי הבודד. לתמונת הדינמיקה של גרגרי הפרשה להשתמש במהירות סריקה של 0.5-2 שניות / מסגרת, ו256 x 256 פיקסלים עם קנה מידה מרחבי 0.2 מיקרומטר / פיקסל (שדה ראיה של כ 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר). על מנת להמחיש בצורה אופטימלית את הגרגירים וקרום הפלזמה, העובי האופטי צריך להיות מוגדר בין 0.9-1.2 מיקרומטר. כדי לעורר את ה-GFP והבד בבד-העגבניות, אפשר להשתמש באורך גל של 488 ננומטר ו561 ננומטר, בהתאמה. החשמל בשעתי השיא מוגדר סביב 0.5 mW לננומטר 488 וmW 1 לננומטר 561. זה מבטיח photobleaching המינימלי.
- הגדרות הגלאי צריכים להיות מותאמות כדי לשמור על האות בתוך הטווח הדינמי ותלויה בבהירות של הדגימה.
- ברגע שכל הפרמטרים מוגדרים, ניתן להתחיל הדמיה. ראשית, לקחת תמונת מצב של שדה הראייה שישמש כנקודת התייחסות. בעודהדמיה בזמן לשגות, היסחפות של הרקמה בXY ו-Z עלולה להתרחש. זה יכול להיות מתוגמל באופן ידני על ידי התאמת אזור הסריקה ואת מיקום Z. ההתאמות צריכות להיעשות בהדרגה ועל ידי מרווחים קטנים כדי להימנע מחפצים. יתר על כן, תמונת הייחוס יכול לשמש כדי לקבוע אם photobleaching מתרחש. אם photobleaching המשמעותי מזוהה (ירידה יותר מ 15-20% בקרינה), להפחית את כוח הלייזר על ידי 0.1 mW.
- כדי לעורר exocytosis, להזריק תת עורי 0.1 מ"ג / קילוגרם של פתרון מוכן טרי של isoproterenol בתמיסת מלח. Exocytosis מופעל כ 1 דקות לאחר ההזרקה. גרגרי הפרשה פיוזינג עם קרום הפלזמה יזוהו על ידי גידול של הקרינה ה-GFP סביב הגרגירים ודיפוזיה של פפטידים טנדם-העגבניות לתוך ממברנות הגבלה שלהם (איור 3). אנו ממליצים לרכוש 3-4 רצפי הזמן לשגות באותו האזור, 10 דקות כל אחד.
- לאחר פגישת ההדמיה, להרדים את anesthetized בעלי חיים משאיפת CO 2 בתא המתת חסד (10-12 מ"מ כספית עבור 10 דקות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעכבר ה-GFP / mTomato, acini מופיע מבנים כנבדלים באופן ברור, שמבטאים GFP cytosolic ופפטיד טנדם-עגבניות ממוקדות קרום (איור 2, קו שבור). בacini הבודד, תאי acinar מסומנים בפפטיד טנדם-עגבניות. GFP הוא גם זוהה בגרעינים שנראים בבירור בתוך תאי acinar (איור 2, חיצים). GFP cytosolic מוחרג מגרגירי הפרשה המופיעים שלפוחית כהה מעגלית של כ 1-1.5 מיקרומטר קוטר (איור 2, הבלעה, ראשי חץ). כדי להמחיש את אירועי exocytic, אנו מתמקדים באזור אחד של קרום הפלזמה כי הוא מועשר בגרגירי הפרשה (איור 3, כוכבית). לאחר ההזרקה תת עורית של 0.1 isoproterenol מ"ג / קילוגרם, אנו צופים עלייה ברמות של הקרינה ה-GFP סביב כמה גרגרי הפרשה שנמצאים בסמיכות לקרום הפלזמה (איור 3, חיצים ירוקים). כמו previously הראה, גרגרים אלה התמזגו עם קרום הפלזמה ולגייס meshwork אקטין עבה ששומר על ה-GFP cytoplasmic 6. בנוסף, לאחר מיזוג עם קרום הפלזמה, פפטיד טנדם-העגבניות מתמוסס לתוך קרום הגבלה של גרגרי הפרשה (איור 3, חיצים אדומים). אחרי 30-40 שניות גרגרי הפרשה יתמוטטו בהדרגה והקרומים הגבלה שלהם משולבים בקרום הפלזמה הפסגה.
איור 1. מיקרוסקופ להגדיר, הליכים כירורגיים, ומיצוב של בעלי חיים. א להכניס שלב נועד להחזיק 35 מ"מ צלחות פטרי מכוסה coverslip 40 מ"מ. הכנס יוצב בבמת מיקרוסקופ שהיא מראש חימם עם רפידות מחוממות (אליפסות כתומות) ומנורה מחוממת. המטרה היא מראש מחומם עם דוד אובייקטיבי (סט טמפרטורה: 38 מעלות צלזיוס). נהלים ב כירורגי כדי לחשוף את בלוטות הרוק. בעזרת מספריים נקיים, מבצע חתך בעור מעל לאזור הצוואר. המספריים מוכנסים בפתח כדי להפריד את העור מהרקמה הבסיסית. העור לאחר מכן הוסר, ורקמת החיבור הוא קילף בעדינות מאחד הבלוטות באמצעות פינצטה. ג החיה ממוקמת בצדו על הבמה המחוממת מראש והבלוטה היא משכה בעדינות והניחה באמצע coverslip . החותכות מחוברות לבמה עם חוט משי (הבלעה). פיסה קטנה של רקמת ניקוי עדשה היא דחוקה בין הבלוטה ובעל האיברים. בעל האיבר לאחר מכן התייצב עם מהדק כי הוא מאובטח על הבמה בנייר דבק (ירוק).
oad/50558/50558fig2.jpg "/>
איור 2. תמונה מייצגת של אזור הדמיה של בלוטות הרוק של עכבר ה-GFP / mTomato חי. Acini הם יפה מודגשים בערוץ ה-GFP (קו שבור ירוק). תאים בודדים מסומנים בפפטיד TD-העגבניות שהוא מקומי בקרום הפלזמה (קו אדום שבורה). GFP הוא מקומי בציטופלסמה והגרעינים (חיצים), אבל לא נכלל בגרגרי ההפרשה (הבלעה, ראשי החץ). בר, 10 מיקרומטר.
איור 3. נציג רצף זמן מראה את exocytosis של גרגרי הפרשה על זריקה של 0.1 מ"ג / קילוגרם של isoproterenol. גרגרי הפרשה היו צילמו קרובים לקרום הפלזמה (הכוכבית). לאחר איחוי עם קרום הפלזמה, הרמות של ה-GFP סביב גרגר הפרשהים להגדיל באופן משמעותי (חיצים ירוקים), ופפטיד TD-העגבניות מתמוסס לתוך הקרומים שלהם הגבלה (חיצים אדומים). גרגרי הפרשה יקרסו לאט ובקרומים שלהם משולבים בקרום הפלזמה הפסגה. בר, 5 מיקרומטר.
טבלת 1. חומרים
טבלה 2. מכשירים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עד כה מבני subcellular כבר צילמו בעיקר במבחנה (תרביות תאים כלומר) או in vivo (כלומר איבר תרבויות, פרוסות רקמה, הכנות acinar) מערכות מודל לשעבר שלעתים קרובות אינו לשחזר את המאפיינים של רקמות גרו בשלמותה 6. מבחינה זו, הגישה המוצגת כאן מייצגת פריצת דרך משמעותית שכן הוא מאפשר הדמיה הדינמיקה של שלב ספציפי קרום סחר (exocytosis המוסדר כלומר) בעכברים חיים.
פרוטוקול זה מייצג התקדמות משמעותית עם בחינות להליכים אחרים המיועדים להדמית vivo של SGS או לאיברים אחרים בחלל הגוף 10,11,13-15. חלק מהמחקרים הקודמים שלנו בוצעו בחולדות, כי הם עמידים יותר לפרוצדורות כירורגיות, יש איברים גדולים יותר, וקצב לב מופחת בהשוואה לעכברים. אמנם, בהליכים שבעכברים הם יותר קשים להגדיר, הם מספקים כמה אדוהntages כולל האפשרות להשתמש בספקטרום רחב יותר של דגמי מחלה, מהונדס ובעלי חיים בנוקאאוט. בנוסף, גישה זו ממוזערת הצלחת ממצא התנועה, ומספק שליטה טובה יותר על הלחץ המופעל על האיברים החשופים וכך להקטין את הסיכונים של: א) הפחתת זרימת הדם, ii) נזק למבנה הרקמה, וג) לפגוע בתפקוד התקין של האיבר. זהו חשש עיקרי שפתרנו על ידי ביטול המגבלה שנוצרה על ידי בעל האיברים ומציג מייצב 10,11.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא לשמור על הטמפרטורה הנכונה, הן בבעלי החיים והן באיברים החשופים. ואכן, הרדמה גורמת היפותרמיה קשה ושמירה על טמפרטורת הגוף המתאימה מפחיתה באופן משמעותי את הסיכוי למוות לפני השלמת הניסוי. יתר על כן, האיברים שנחשפו במהירות מחליפים חום עם הסביבה החיצונית במהלך שני proc כירורגית edures וההדמיה. מאז ההפחתה המקומית של טמפרטורה קשה להאט את קינטיקה של צעדי exocytic, זה הוא חיוני כדי למנוע את זה על ידי שימוש במנורת החום, דוד האובייקטיבי, ועל ידי שמירה על הבלוטה לחה או עם ג'ל הצימוד או מי מלח חמים. מארז מלא של מיקרוסקופ עם תא סביבתי הוא גם פתרון טוב לשליטה על הטמפרטורה. עוד צעד קריטי הוא כדי להשיג את האיזון הראוי בין הייצוב ותחזוקה של זרימת הדם. ואכן, בהכנה שלא התייצבה כמו שצריך, זה מאוד קשה לעקוב קינטיקה של גרגרי הפרשה גדלים שנמצאים בטווח מיקרון. מצד השני, הירידה של תוצאות אספקת דם להיווצרות של וקואולות גדולה או עיכוב משמעותי של exocytosis המוסדר. כדי להשיג איזון זה חשוב כל הזמן לפקח על זרימת הדם ולבדוק סימנים של נזק לתאים בעת החלת הלחץ כדי לייצב את האיברים.
ss> שתי המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הם = "jove_content" המהירות של רכישה ואת העומק של הדמיה. למרות שיש לי המיקרוסקופים confocal מבוסס גלונומטר רזולוציה של זמן מספיק כדי לדמיין את הקריסה ההדרגתית של גרגרי הפרשה, הם לא מאפשרים בעקבות אירועים מראש היתוך ומיזוג המתרחשים בסדר הגודל של אלפיות שנייה. היבט זה יכול להיות שיפור עם השימוש במיקרוסקופי דיסק מסתובב או סריקה מיקרוסקופי לייזר מצוידים בסורקי תהודה. במונחים של עומק, מיקרוסקופיה confocal מגבילה את הרכישה ל30-50 מיקרומטר הראשון מתחת לפני השטח של בלוטות הרוק. זה מאפשר לשכבת ההדמיה 1 מבני acinar, ואינו מאפשר הדמיה צינוריות הרוק. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש במיקרוסקופ שני פוטונים שמבטיח הדמיה עד לעומק של 100-150 מיקרומטר, אם כי על חשבון הרזולוציה מרחבית.
אמנם למחקר זה יש לנו נבחר עכבר מהונדס המאפשר Imagi בו זמניתננוגרם של גרגרי הפרשה וקרום הפלזמה הפסגה, ניתן להאריך את ההליכים המתוארים כאן כדי ללמוד כמה תהליכים תאיים אחרים. זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש במולקולות מתויגות fluorescently שתווית מבנים תאיים ספציפיים ויכולים להינתן גם באופן מערכתי או ישירות על SGS. לחלופין, מודלים עכבר מהונדסים חדשים להביע מתויגות fluorescently מולקולות פותחו, כגון GLUT4 תחבורת גלוקוז, LifeAct סמן ה-F-אקטין, עכבר 2B היסטון סמן הגרעיני, וסמן autophagy LC3-GFP. לבסוף, האסטרטגיה הבסיסית שפיתחנו כדי לשתק ותמונת SGS ברזולוציה גבוהה יכולה להיות פוטנציאל הרחיבה לאיברים אחרים (לדוגמא לבלב, כבד, כליות, ובלוטות החלב) על ידי הצגה כמה שינויים בגודל או צורה של המייצב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2" x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 | |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., et al. Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. Najman, S. , Intech. (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
