Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Summary

Intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt att avbilda olika biologiska processer i levande djur. I denna artikel presenteras en detaljerad metod för avbildning av dynamiken i subcellulära strukturer, såsom de sekretoriska granuler, i salivkörtlarna hos levande möss.

Abstract

Här beskriver vi ett förfarande för att avbilda subcellulära strukturer i levande gnagare som baseras på användning av konfokal intravital mikroskopi. Som en modell organ använder vi salivkörtlarna hos levande möss eftersom de ger flera fördelar. För det första kan de lätt exponeras för att möjliggöra tillträde till optik, och stabiliseras för att underlätta minskningen av rörelseartefakter på grund av hjärtslag och andning. Detta underlättar avsevärt bildbehandling och spåra små subcellulära strukturer. För det andra, de flesta av de cellpopulationer i spottkörtlarna är åtkomlig från ytan av organet. Detta möjliggör användning av konfokal mikroskopi, som har en högre spatial upplösning än andra tekniker som har använts för in vivo imaging, såsom två-foton-mikroskopi. Slutligen kan spottkörtlar lätt manipuleras farmakologiskt och genetiskt, vilket ger ett robust system för att undersöka biologiska processer på molekylär nivå.

I denna studie fokuserar vi på ett protokoll för att följa kinetiken av exocytos av sekretoriska granuler i acinarceller och dynamiken i den apikala plasmamembranet där de sekretoriska granula smälter vid stimulering av beta-adrenerga receptorer. Specifikt använde vi en transgen mus som samar uttrycker cytosolic GFP och ett membran riktade peptid smält med det fluorescerande proteinet tandem-Tomat. Däremot kan de förfaranden som vi används för att stabilisera och bild spottkörtlarna utvidgas till andra musmodeller och kopplad till andra metoder för att märka in vivo cellkomponenter, som möjliggör visualisering av olika subcellulära strukturer, såsom endosomer, lysosomer, mitokondrier, och aktin cytoskelettet.

Introduction

Under de senaste två decennierna tillkomsten av levande mikroskopi och användning av fluorescerande proteiner har lett till genombrott på varje cellulär process tänkbara, därmed öka kunskaperna om cellbiologi ^1. Detta fält har gynnats oerhört från användningen av däggdjurscellkulturer som är extremt kraftfulla modellsystem, i synnerhet när det gäller experimentella manipulationer. Men de är inte ofta ger en sann bild av biologi komplexa flercelliga organismer ^2. Denna fråga har börjat ta itu med utvecklingen av intravital mikroskopi (IVM) som har öppnat dörren för att utreda viktiga biologiska frågor inom områden som neurobiologi, immunologi och tumörbiologi ^3. Hittills har de flesta av de studier som bygger på IVM har utförts på de nivåer av vävnader och enskilda celler, utan att ge någon information om dynamiken i subcellulära fack. Nyligen, vårt laboratorium och andras har utvecklat IVM tekniker som kan imaging subcellulära strukturer i levande gnagare ^{4-7, 13-15} och möjliggör farmakologiska och genetiska manipulationer in vivo. Detta tillvägagångssätt har använts av oss att studera membran trafficking in vivo, och mer specifikt endocytos och reglerad exocytos ^6,7.

Vår experimentella modellsystem bygger på att exponera, stabilisera och avbildning av submandibular spottkörtlar (SGS) i sövda gnagare. Valet av SGS som modell organ för IVM beror på det faktum att de körtlar är lättillgängliga genom att utföra en mindre operation, kan externaliserats utan att äventyra deras fysiologi, och stabiliseras för att minska rörelseartefakter på grund av hjärtslag och andning. Dessutom kan SGs selektivt manipuleras genetiskt genom injektion antingen virala eller icke-virala baserade vektorer genom saliv kanalen ^8,9. Slutligen SGS är exokrina körtlar består av polariserad epithElial celler, som bildar acini och trummorna, myoepitelceller, och en komplex population av stromala celler. Av denna anledning, de är en utmärkt modell för att studera exocytos, endocytos, genleverans och aktincytoskelettet, såsom framgår av våra nya studier ^10, och erbjuder möjligheten att studera aspekter av cellbiologi såsom cell polaritet, celldelning, cell- cell korsningar och jonkanaler.

I denna uppsats beskriver vi i detalj ett bildprotokoll för att uppnå subcellulära upplösning i epitel av SGS i en levande mus. Specifikt visar vi hur bilden de sekretoriska granulerna i körtelcellerna i SGS under reglerad exocytos. Som tidigare visats, vid stimulering med agonister av beta-adrenerg receptor, de sekretoriska granulerna smälta samman med det apikala plasmamembranet och så småningom kollapsa, frigöra deras innehåll in i acinar canaliculi ^6. Vårt mål är att ge grundläggande verktyg för utredarna med minimal erfarenhet av kirurgiska procedurer och djurhantering, så att de framgångsrikt kan utföra IVM på en subcellulär upplösning. Eftersom den mest utmanande delen i IVM är beredningen av djur, här fokuserar vi på beskrivningen av de grundläggande kirurgiska ingrepp som utnyttjas för att avslöja och immobilisera SGS utan att äventyra deras funktion. När det gäller förfaranden för att märka subcellulära strukturer, flera strategier, såsom systemisk leverans av fluorescerande prober, användning av transgena djur, eller en kombination av båda, har beskrivits på annan plats ^7,11.

Protocol

Del 1: Mikroskop och Beredning av Imaging Setup

1. Varje inverterat konfokalmikroskop bör vara lämplig för IVM. I denna studie var en Olympus IX81 inverterat mikroskop, utrustat med en FluoView-1000 laserskanning konfokala enhet användes. För att uppnå bästa möjliga upplösning, är användning av höga NA-mål, till exempel vatten-immersion UPLSAPO 60x/1.20 NA, och oljeimmersions Plan-Apo 60x/1.42 NA rekommenderas. Olja nedsänkning mål är effektivare insamling och även om de kräver användning av ett täckglas mellan vävnaden och det mål, de ger en bättre bildkvalitet när de används för bildområden inom 15-20 nm från ytan. Dessutom har användningen av olja eliminerar oro för vattenavdunstning under längre avbildning sessioner. För att upprätthålla temperaturen och luftfuktigheten bör mikroskopet vara helt innesluten och förses med varm och fuktig luft. Alternativt djuret, mikroskop scenen ochMålet måste värmas på något annat sätt. Exempelvis kan kemiska värmekuddar användas för djuret och scenen, och särskilt utformade objektiva värmare kan användas för målet (Figur 1A). Målet Värmaren ska vara påslagen 30 minuter innan proceduren. Notera: När värmedynor är använda för att hålla djuret varmt en gasbinda har att placera in mellan kudden och huden. Huden måste övervakas för brännskador.
2. De schablonGång i de flesta av de kommersiellt tillgängliga konfokala mikroskop har en öppning som används för att infoga olika hållare som används för att passa diabilder, petriskålar och plattor av olika storlekar. För att kunna utföra IVM, en standard skede Insats för 35 mm Petriskålar är inverterat upp och ned, täckt med ett 40 mm glasskiva, vilken därefter är fäst medelst högvakuum silikonfett eller maskeringstejp (Figur 1A). En anpassad insatsen kan även tillverkas av 3 mm tjock aluminiumplåt. Glasytan är sedan cleaned med 70% etanol och dras med en Kimwipe.
3. Tillverkning en anpassad hållare för SGS immobilisering (stabilisator). Syftet med innehavaren är att stabilisera SGS på plats och stelt par dem till scenen och täckglas. Hållaren kan vara tillverkad av en 60 mm plastpetriskål. För det första är botten av skålen bryts bort från väggarna och skärs i rektanglar av ca 15 x 10 mm. Sedan är kanterna rundade och polerade med fint sandpapper. Fyra distanser (1,5-2 mm) byggs genom att ta bort gummi tips av 1 ml spruta kolvar. Genom att använda fint sandpapper, ytan av distansorganen och de fyra hörnen på plaststycket är polerade. Distanserna limmas sedan med hjälp av gelé superlim, och senare jämnas med hjälp av fint sandpapper på en plan yta. Observera, att för äldre djur, kan storleken på hållarna och distanserna måste ökas för att rymma lite större körtlar.
4. Framställning av den optiska kopplings gel. 0,3% Carbomer-940 (Tabell 2)-gel framställs genom att värma upp 100 ml av ultrarent vatten och upplösning av 5,47 g D-sorbitol. Därefter tillsättes 0,3 g Carbomer-940 tillsätts. Bägaren ska täckas och placerades på en omrörningsvärmeplattan (lägsta värmefixering) under flera timmar eller tills alla karbomer klumpar är helt lösta. Slutligen är Trietanolamine droppvis under lätt omröring, tills ett pH av ca 7,4 uppnås. Gelén förvarades vid 4 ° C ^13.

Del 2: Djur och anestesi

1. Innan du utför några experiment med djur, bör de protokoll skall godkännas av den lokala djuromsorg och etisk kommitté. Huvudsakligen bör forskare vara väl utbildade för att utföra kirurgiska ingrepp och bör rådgöra med sin lokala djurvård kommitté eller institution veterinär innan du fortsätter med proceduren.
2. I denna studie, en musmodell (GFP / mTomato-mus) härleds genom att korsa FVB möss som uttrycker lösliga GFP (GFP-mus) with C57B6 möss som uttrycker en membran riktad peptid smält med det fluorescerande proteinet tandem-Tomat (mTomato-mus) ⁶ användes. Notera: Det brukar ta 20-30 minuter för djuret att bli helt sövd och förberedd för avbildning
3. Möss är inrymt i en kontrollerad miljö i djurfaciliteten och tilläts acklimatisera sig under en vecka före experimentet. Detta steg är nödvändigt för att avbilda SGS eftersom eventuella nöd leder till förbättrad sekretoriska aktivitet ^12. Vatten och mat tillhandahålles ad libitum. Manlig från 2 -5 månader används för avbildningsexperiment (20-30 g).
4. Före anestesi, väga djuren att bestämma lämplig dos av bedövningsmedel.
5. Eftersom stress som administration av injicerbara anestetika kan försämra den sekretoriska aktiviteten av SGS, framkalla pre-anestesi vid isofluran inandning, följt av injektion av bedövningsmedel. I detta syfte placera mössen mycket försiktigt in i förångaren kammaren, ochslå på syrgasflödet (800-900 mm Hg). Ställ in isofluran nivå till 3% för att starta före anestesiinduktion.
6. När djuren är medvetslös, injicera en blandning av 100 mg / kg ketamin och 20 mg / kg xylazin i peritonealhålan (25 G-nål). Anestetika nygjord genom att späda 100 mg / ml xylazin till 20 mg / ml i saltlösning och sedan blanda det med ketamin. Denna blandning späddes ytterligare 1:01 med saltlösning och en lämplig mängd injicerats baserat på djurets vikt. Denna utspädning hjälper till att förebygga oavsiktlig överdos. Observera att blandningen förlorar sin effektivitet efter 20 min.
7. Observera djuren för tecken på vakenhet och injicera mer anestetisk blandning om de kommer ut från anestesi (ca 75% av den initiala dosen inom 45 minuter efter den första injektionen, och 50% per timme senare). Kontrollera djupet av anestesi var 15 min genom att klämma tassen och observera svaret. OBS: Alltid administrera oftalmologiska salva för att förebyggatorra ögon.
8. Bedövningsmedel framkalla hypotermi, vilket kan påverka reproducerbarhet av experimenten och hälsan hos djuret. Därför bör möss hållas under lampans värme eller på en uppvärmd dyna för hela den tid av experimentet. Notera: lampans värme bör vara minst 12-18 inches från djuret för att förhindra bränning
9. Kroppstemperaturen hos djuren som ska övervakas med en termometer utrustad med en rektal temperatursond.

Del 3: Animal Kirurgi och positionering för Intravital mikroskopi

1. Förbered arbetsytan med alla kirurgiska instrument (tabell 1) som ska vara ren och steril.
2. Raka nacken på musen med en elektrisk klippmaskin. Torka den ventrala sidan av halsen område på sövda musen med en gasväv svamp indränkt i 70% etanol. Torka överskottet med en Kimwipe.
3. Med tråkig böjda pincett lyft upp en liten bit av huden vid mittlinjen (cirkalan vid den nedre änden av de yttre tuggmusklerna) och gör ett litet snitt (Figur 1B).
4. Sätt saxen i öppningen och separera huden från den underliggande vävnaden genom att öppna skärbladen. Undvik att skada den underliggande körtelvävnad, genom att peka saxen upp mot undersidan av huden. Upprepa detta steg flera gånger tills huden är separerat från de djupare vävnaderna (figur 1B).
5. Med sax, skär ut en remsa av lossade huden ca 3 mm bred och 10 mm lång. Huden bör klippas så att öppningen börjar nära basen av SGS där nerven, kanalen och blodkärlen ansluter körteln till resten av kroppen. Efter rengöring sårområdet, kommer den resulterande öppningen vara ovalt och mäter ungefär 8 x 12 mm. Båda SGs kommer att synas efter öppningen (Figur 1B).
6. Med en spruta tillämpa den optiska kopplings gel in i mitten av den skurna och torka den motutsidan med steril gasbinda. Rena bitar gasväv bör användas för varje duk för att förhindra införandet av hår eller blod in i den exponerade vävnaden. Upprepa detta tills allt blod och löst hår tas bort.
7. Använda # 7 pincett, separera bindväven bort från höger submandibular gland hela vägen till botten av packboxen (alternativt detta protokoll kan användas på vänster SGS). Först, hitta spetsen av SG och greppa bindväv några millimeter ovanför spetsen av körteln. Riv bindväven runt körteln utan att skada parenkymet. (Figur 1B). När körteln är utsatt, försiktigt separera bindväv från körteln. Om blödning uppstår, tvätta blodet bort med koksaltlösning. Se till att alla den bindväv separeras och den körtel är helt exponerad. Håll glanden fuktig genom att applicera optisk koppling gel regelbundet.
8. Innan föra djuret till mikroskopet, placera en tjock bit gasväv och heat packa på mikroskop scenen för att upprätthålla en temperatur av 38 ± 2 ° C. Temperaturen för den kemiska värmeförpackningen kan justeras efter storleken på snitten som utsätter den inre påsen till atmosfären. Gauze ger viss isolering av värmepaketet från metallstadiet. Täck toppen av värmepåse med en tunn bit gasbinda samt.
9. Placera djuret på sin sida (höger sida för rätt körtel) och på gasväv. Placera djuret med submandibular salivkörteln placerad i mitten av täckglas (Figur 1C).
10. Djuret bör säkras och stabiliseras i detta läge innan immobilisera körteln. Placera en bit maskeringstejp på den ventrala sidan av den främre högra tassen av musen. Haka framtänderna på musen med en siden sutur (Figur 1C, infälld). Skapa vissa spänningar mellan silkestråd och tassen och fäst dem på scenen genom att maskeringstejp. SG skall vila naturligt i mitten avtäckglas. Huvudet och bröstkorgen bör dessutom stabiliseras genom plastkilar som kan kopplas till scenen.
11. Placera en liten bit av linsrengörings vävnad över körteln (Figur 1C). Förläng körteln något och placera en anpassad hållare över körteln. Tätt par stabilisatorn till scenen med maskeringstejp. Koppling kan förbättras med en metallklämma som är ansluten till fasen (Figur 1C). Tension och skarpa vinklar bör undvikas eftersom de kan äventyra blodflödet. Omedelbart efter stabiliseringen inspektera blodflödet antingen genom att undersöka körteln visuellt (det bör behålla rosa färg) eller genom epifluorescens. I GFP / m-tomat-mus, kan brutto förändringar av blodflödet lätt utvärderas eftersom både blodkärl och flera av blodceller är märkta med m-tomat.
12. Täck djuret med gasbinda och en uppvärmd dyna. Mät temperaturen hos den exponerade körtel med användning av en termometer utrustad wed ett litet flexibelt termoelementsond placeras i kontakt med en sida av den exponerade körteln.

Del 4: Imaging Parametrar

1. Använda epifluorescens belysning fokus på ytan av körteln genom att antingen använda GFP eller RFP filteruppsättningen. Hitta ytan av SG, och bedöma blodflödet i kapillärerna och den övergripande morfologin hos vävnaden. Tecken på vävnadsskada innefattar membranblåsbildning eller uppkomsten av stora vakuoler.
2. Bedöma stabiliteten i vävnaden antingen via epifluorescence eller genom förinskanna markerade området. En stabil beredning är väsentligt, eftersom de flesta av de rörelseartefakter inte kan tas bort eller korrigeras för efterbearbetning dataanalys. Om beredningen inte är stabil, är justeringar krävs.
3. För att hitta den rätta fokalplanet bild körtlar i pre-scanning (1X zoom), och gradvis flytta målet mot täckglas tills körtelstrukturer, de sekretoriska granuler och pLasma membran blir tydligt (Figur 2).
4. De avbildningsparametrar för tidsförlopp beror på det individuella experimentet. Till bilden dynamiken i sekretoriska granuler använda en skanningshastighet på 0,5-2 sek / ram, och 256 x 256 pixlar med en 0,2 ^ m / pixel rumslig skala (synfält på approximativt 50 | im x 50 um). För att på bästa sätt visualisera granulat och plasmamembranet, bör den optiska tjockleken ställas in mellan 0,9 till 1,2 um. För att excitera GFP och tandem-tomat, kan man använda en våglängd på 488 nm och 561 nm, respektive. Toppeffekten ligger runt 0,5 mW för 488 nm och 1 mW för 561 nm. Detta säkerställer minimal fotoblekning.
5. Detektor inställningar måste justeras för att bibehålla signalen inom det dynamiska området och beror på ljusstyrkan på provet.
6. När alla parametrar är inställda, kan avbildning startas. Först, ta en ögonblicksbild av synfältet som ska användas som en referenspunkt. Medanimaging i tid förfaller, kan drivande av vävnaden i XY och Z inträffa. Detta kan manuellt kompenseras genom att justera skanningsområdet och läget Z. Justeringarna bör göras successivt och i små steg för att undvika artefakter. Dessutom kan referensbilden användas för att bestämma om fotoblekning sker. Om betydande fotoblekning upptäcks (mer än 15-20% minskning av fluorescens), minska lasereffekt med 0,1 mW.
7. För att stimulera exocytos, injicera subkutant 0,1 mg / kg av en nyligen beredd lösning av isoproterenol i saltlösning. Exocytos utlöses cirka 1 minut efter injektionen. Sekretoriska granuler fixerar med plasmamembranet kommer att upptäckas av en ökning av GFP fluorescens runt granulerna och spridningen av tandem-Tomat-peptider i sina begränsande membran (Figur 3). Vi rekommenderar att förvärva 3-4 time-lapse-sekvenser i samma område, 10 min vardera.
8. Efter avbildning session, avliva anesthetized animaliska _CO2 inhalation i en dödshjälp kammare (10-12 mm Hg i 10 min).

Representative Results

I GFP / mTomato mus, acini framstå som klart distinkta strukturer, vilka uttrycker cytosoliskt GFP och membran inriktade tandem-Tomat peptid (fig 2, streckade linjer). I enskilda acini är acinarceller avgränsas av tandem-Tomat peptid. GFP detekteras också i kärnan som är klart synliga inuti acinar-celler (figur 2, pilar). Cytosoliskt GFP är undantagna från de sekretoriska granuler som visas som mörka runda blåsor på cirka 1-1,5 um i diameter (Figur 2, infällda, pilspetsar). Att visualisera exocytiska händelser, fokuserar vi på ett område av plasmamembranet som anrikas i sekretoriska granuler (Figur 3, asterisk). Efter subkutan injektion av 0,1 mg / kg isoproterenol, observerar vi en ökning i nivåerna av GFP-fluorescens i närheten av några av de sekretoriska granulerna som är i nära anslutning till plasmamembranet (figur 3, gröna pilar). Som previously visas dessa granuler är sammansmälta med plasmamembranet och rekrytera en tjock aktin meshwork som behåller den cytoplasmatiska GFP ^6. Dessutom, efter fusion med plasmamembranet, diffunderar tandem-Tomat peptiden in de begränsande membranen i sekretoriska granuler (Figur 3, röda pilar). Efter 30 till 40 sek de sekretoriska granulerna gradvis kollapsa och deras begränsande membran är integrerade i det apikala plasmamembranet.

Figur 1. Mikroskop inrättas, kirurgiska ingrepp och djur positionering. A. Ett stadium insats utformad för att hålla 35 mm Petriskålar är täckt med ett 40 mm täckglas. Insatsen placeras i mikroskopets objektbord, som är förvärmd med upphettade dynor (orange ovaler) och en uppvärmd lampa. Målet är pre -Värms med en objektiv värmare (temperatur set: 38 ° C). B. Kirurgiska ingrepp för att exponera spottkörtlarna. Använd en ren sax, görs ett snitt i huden över nackområdet. Saxen är införda i öppningen för att separera huden från den underliggande vävnaden. Huden avlägsnades sedan, och bindväven är försiktigt dras av från en av körtlarna med en pincett. C. Djuret placeras på sin sida på den förvärmda stadiet och glanden försiktigt dras och placeras i mitten av täckglas . De framtänder är anslutna till scenen med silkestråd (infälld). En liten bit av rengöring vävnad är inklämt mellan genomföringen och organhållaren. Orgeln hållaren sedan stabiliseras med en klämma som fästs på scenen med maskeringstejp (grön).

oad/50558/50558fig2.jpg "/>
Figur 2. Representativ bild av en avbildning område av spottkörtlarna i en levande GFP / mTomato mus. Acini är snyggt fram i GFP-kanalen (grön streckad linje). Enskilda celler avgränsas av td-Tomat peptid som är lokaliserad vid plasmamembranet (röd streckad linje). GFP är lokaliserad i cytoplasman och kärnor (pilar), men inte av de sekretoriska granulerna (inlägg, pilspetsar). Bar, 10 | im.

Figur 3. Representant tidsföljd visar exocytos av sekretoriska granuler vid injektion av 0,1 mg / kg av isoproterenol. Sekretoriska granuler avbildades nära plasmamembranet (asterisk). Efter fusion med plasmamembranet, nivåerna av GFP runt sekretoriska granulats öka avsevärt (gröna pilar) och td-Tomat peptiden diffunderar in i deras begränsande membran (röda pilar). De sekretoriska granulae långsamt kollapsa och deras membran är integrerade i det apikala plasmamembranet. Bar, 5 | im.

Tabell 1. Material

Tabell 2. Instrument

Discussion

Hittills subcellulära strukturer har avbildas mestadels i in vitro (dvs. cellkulturer) eller ex vivo (dvs. orgel-kulturer, vävnadssnitt, acinära preparat) modellsystem som ofta inte rekapitulera egenskaper intakta levande vävnader ^6. I detta avseende den metod som presenteras här är ett stort genombrott, eftersom det gör det möjligt att avbilda dynamiken i en specifik membran trafficking steg (dvs. reglerad exocytos) i levande möss.

Detta protokoll utgör ett betydande framsteg med avseenden till andra förfaranden som är avsett för avbildning in vivo i SGS eller andra organ i kroppen hålighet ^10,11,13-15. Några av våra tidigare studier utfördes på råttor som är mer motståndskraftig mot kirurgiska ingrepp, har större organ, och en minskad hjärtfrekvens jämfört med möss. Även om förfarandena i möss är svårare att ställa in, de ger flera Advantages inklusive möjligheten att använda ett bredare spektrum av sjukdomsmodeller, transgena och knockout djur. Dessutom har denna metod framgångsrikt minimerat rörelseartefakter, vilket ger en bättre kontroll över trycket appliceras på de exponerade organ vilket minskar riskerna för: i) minskning av blodflödet, ii) skada vävnaden arkitekturen, och iii) försämrar den normala funktionen av orgeln. Detta är ett stort problem som vi löst genom att eliminera hinder som genereras av organhållaren och införa en stabilisator ^10,11.

En av de mest kritiska stegen i detta protokoll är att hålla rätt temperatur i både djuret och i den exponerade orgel. I själva verket framkallar anestesi svår hypotermi och bibehålla en lämplig kroppstemperatur minskar avsevärt risken för död före slutförandet av experimentet. Dessutom byter den exponerade orgeln snabbt värme med den yttre miljön under både den kirurgiska procedures och avbildning. Eftersom den lokala minskningen av temperaturen kraftigt bromsa kinetiken för de exocytiska steg, är det viktigt att förhindra att den med hjälp av värmelampa, målet värmaren, och genom att hålla körteln fuktig med antingen kopplingsgelen eller varm koksaltlösning. Fullständig inneslutning av mikroskopet med en miljökammare är också bra lösning för reglering av temperaturen. Ett annat viktigt steg är att uppnå en lämplig balans mellan stabilisering och underhåll av blodflödet. Faktum är att i en beredning som inte är ordentligt stabiliserad, är det mycket svårt att följa kinetiken för de sekretoriska granuler vars storlekar är i mikron. Å andra sidan, en minskning av blodtillförseln resulterar i bildningen av stora vakuoler eller en signifikant inhibering av reglerad exocytos. För att uppnå denna balans är det viktigt att ständigt övervaka blodflödet och leta efter tecken på cellskada under applicering av trycket att stabilisera orgeln.

Även för denna studie har vi valt en transgen mus som möjliggör samtidig fantasing av de sekretoriska granuler och det apikala plasmamembranet, kan de förfaranden som beskrivs här utökas för att studera flera andra intracellulära processer. Detta kan åstadkommas genom användning av fluorescensmärkta molekyler som märka specifika cellulära strukturer och kan administreras antingen systemiskt eller direkt på SGS. Alternativt har nya modeller transgena möss som uttrycker fluorescerande taggade molekyler utvecklats, till exempel glukostransport Glut4, F-aktin markör LifeAct, kärnkrafts markör histonen 2B musen och autophagy markören LC3-GFP. Slutligen kan den grundläggande strategi som vi har utvecklat för att immobilisera och bild SGS vid hög upplösning vara potentiellt utvidgas till andra organ (t.ex. pankreas, lever, njure och mjölkkörtlar) genom att införa några modifikationer i storleken eller formen hos stabilisatorn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)	Braintree Scientific	190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter	Hazard Technology	PDDT
Heat lamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight	World Precision Instruments	5003708-12
#7 curved tip tweezers	World Precision Instruments	14187
Microscissors	World Precision Instruments	503365
Black Braided Silk suture #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gauze sponges 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Lens cleaning tissue	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476