Prøverne, til Optimering STORM Super-opløsning Microscopy

Summary

Vi beskriver fremstillingen af ​​tre prøveemner, og hvordan de kan bruges til at optimere og vurdere resultaterne af STORM mikroskoper. Ved hjælp af disse eksempler viser vi, hvordan at erhverve rå data og derefter behandle det at erhverve billeder super opløsning i celler på ca 30-50 nm opløsning.

Abstract

STORM er et nyligt udviklet super-opløsning mikroskopi teknik med op til 10 gange bedre opløsning end standard fluorescens mikroskopi teknikker. Men da billedet er erhvervet i en meget anderledes måde end normalt, ved at opbygge et billede molekyle-by-molekyle, der er nogle store udfordringer for brugerne i at forsøge at optimere deres billede erhvervelse. For at støtte denne proces og få mere indsigt i, hvordan STORM arbejder vi præsenterer forberedelse af 3 prøveemner og metoden for at erhverve og behandling STORM billeder super-opløsning med typiske beslutninger af mellem 30-50 nm. Ved at kombinere de prøver med brug af de frit tilgængelige Rainstorm forarbejdning software er det muligt at opnå en hel del oplysninger om billedkvalitet og opløsning. Ved hjælp af disse målinger er det så muligt at optimere imagografiproceduren fra optikken, for prøveforberedelse, farvestof valg, bufferbetingelser og indstillinger billede erhvervelse. ViLSO viser eksempler på nogle almindelige problemer, der resulterer i dårlig billedkvalitet, såsom lateral afdrift, hvor prøven bevæger sig under erhvervelse og tæthed billede problemer resulterede i 'mislocalization' fænomen.

Introduction

For nylig en række optiske mikroskopi teknikker er blevet udviklet, typisk kaldet super-opløsning mikroskopi eller Nanoscopy, der kan omgå diffraktionsgrænsen og generere billeder med opløsninger på 100 nm eller bedre ^1,2. Siden annonceringen af ​​super-opløsning mikroskopi som værende Nature Methods metode af året i 2008, har der været en stor udvikling af lokaliserings-baserede mikroskoper. For eksempel er der multi-farve applikationer ^3-6, 3D implementeringer ^7-12, og selv levende celle applikationer ^5,13-17. Da disse systemer bliver kommercialiseret, og er nu på vej ud af optik laboratorier i hænderne på cellebiologer der sandsynligvis vil være en yderligere stigning i deres brug og anvendelse til biomedicinske spørgsmål.

En gren af ​​denne familie er de lokaliserings-baserede metoder, der arbejder ved at opbygge et billede molekyle-by-molekyle. Jegn For at gøre dette, skal flertallet af de fluorescerende molekyler i prøven være slukket, så kun et par rumligt adskilte molekyler er aktive på én gang. Disse molekyler er derefter hurtigt tændes og slukkes, og mange billeder er taget, således at en betydelig del af befolkningen er afbildet for at afspejle den underliggende struktur med sub-diffraktion præcision. En række metoder er blevet offentliggjort, herunder GSDIM ^18, PALM ^19. fPALM ²⁰ STORM ²¹ og RESOLFT ^22.. Algoritmer, som måler positionen af et enkelt molekyle detektion kan derefter bruges til at lokalisere den faktiske position af molekylet med nøjagtigheder bedre end 20 nm under anvendelse af Gauss fitting ^23, for eksempel rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ²⁶ palm3d ¹² og regnvejr ^27. Når billeddannelse celle eller andre biologiske prøver, som har en høj molekyle tæthed, er det derfor nødvendigt at tage mange tusinde rammer afdenne blinker, rumligt adskilt, signal for at billedet en betydelig andel af de mærkede molekyler.

Stokastisk optisk genopbygning mikroskopi (STORM) og stærkt relateret dSTORM og GSDIM metoder er lokaliserings-baseret super-opløsning metoder, som har vist sig at arbejde med kommercielt tilgængelige organiske farvestoffer ^21. De har siden vist sig at være gældende for en række forskellige farvestoffer ^28-30, hvilket gør metoden særlig attraktiv på grund af den specificitet og relative bekvemmelighed veletablerede immunolabeling tilgange til at udføre fluorescens mikroskopi. Følgelig er der nem adgang til en række farvestof-antistof-og farvestof-biomolekyle konjugater, som har potentialet til at blive anvendt i lokalisering baseret super-opløsning billeddannelse. Mens de generelle principper for storm og lignende fremgangsmåder er relativt enkel, og ved første øjekast hardware og prøveforberedelse synes relativt straightforward, er der en række trin i processen, der er afgørende for at opnå høj kvalitet, artifact-fri, billeder super-opløsning.

Som med alle mikroskopi teknikker processen kan opfattes i 3 vigtigste trin: først prøveforberedelse andet billede erhvervelse og for det tredje, billedbehandling og / eller billede analyse og fortolkning. Den ekstra opløsningsevne og metode til generering af billeder, super-opløsning ved hjælp af en lokalisering tilgang introducerer nogle nye problemer og overvejelser ^31-33. Startende med prøveforberedelse, når der udføres immunolabeling, navnlig indirekte immunofluorescens, hvor en primær og sekundær antistof kombination anvendes, skal det bemærkes, at det fluorescerende farvestof kan være op til 20 nm fra molekylet af interesse. I tilfælde af mikrotubuli, resulterer dette i en diameter på 35-50 nm sammenlignet med en forventet mikrotubulus diameter på 25 nm ^28,30. Desuden bør mærkningen tæthed mEET Nyquist kriterier for at generere et billede af høj kvalitet ^14. For eksempel for en forventet billedopløsning på 20 nm langs en ​​trådformede struktur bør der være et farvestof molekyle mindst hver 10 nm ^27. Mens mange farvestoffer er blevet offentliggjort for at arbejde for lokalisering tilgange de samlede resultater af farvestoffet er en blanding af mindst fire vigtige kriterier, nemlig opdaget fotoner pr skift begivenhed (lysstyrken for hvert blink – lysere er bedre), ligevægten på -off duty cycle (kontrastforhold af farvestoffer i off versus på state – mere off er generelt bedre), fraktion overlevelse (en lav blegning sats er bedre), og antallet af koblingscyklusser (antallet af blink pr fluorophor – mere er bedre for høj opløsning, men 1 blink pr fluorofor kan være en fordel for molekyle optælling formål). Situationen kompliceres yderligere af det faktum, at disse egenskaber for en given farve kan variere i forskellige pufferbetingelser ogmed laser magt ^28,29. Desuden, samt disse unikke STORM betragtninger billedkvalitet kan forbedres ved at optimere prøveforberedelse på samme måde som de mere traditionelle fluorescens mikroskopi teknikker for eksempel ved at minimere autofluorescens ved modifikation af fikseringen betingelser og anvendelse af quenching reagenser. Det er også vigtigt at minimere ikke-specifikt bundne fluoroforer, hvilket kan gøres ved at justere label koncentrationer, inkubationstider og blokerende og vasketrin.

Det andet trin i billedet Købet er også kritisk. De optimale indstillinger på mikroskopet, vil afhænge af farvestoffet, bufferbetingelser, mærkning tæthed og prøvetype, f.eks monolag på glas, celler eller vævsprøver. De vigtigste overvejelser er kamera eksponeringstid, stelnummer, indfaldsvinklen (TIRF, Hilo, Epi) og laser magt. Målet er at samle så mange lyse rumligt adskilte blinker så hurtigt som muligt. Hvis baggrunden is meget høje eller blinker ikke meget lyse, med andre ord det signal-til-støj-forholdet er dårlig, rekonstruktionsalgoritme vil ikke være i stand til at lokalisere de positioner, som præcist. Samt maksimere lokalisering præcision, dvs træfsikkerhed med hvert molekyle position kan måles billedkvalitet afhænger også af et stort antal lokaliseringer. Hvis der filmede et utilstrækkeligt antal molekyler af interesse enten på grund af dårlig mærkning effektivitet, overdreven fotoblegning eller en utilstrækkelig ramme nummer, så den resulterende super-opløsning vil være punktformet og diskontinuerlige som Nyquist kriterier ikke vil være opfyldt ^14,27 .

Og endelig det tredje trin, billedbehandling, er særlig vigtig i forhold til standard fluorescens mikroskopi teknikker. Der er en vifte af frit og kommercielt tilgængelige algoritmer, hvilket både er en fordel i form af valg, og en ulempe, da det kan være forvirrende at vide which er mest hensigtsmæssigt at anvende. Hvis for eksempel de rå data er godt fordelte rumligt adskilte blinker derefter en enkelt molekyle montering algoritme kan være meget præcis og effektiv, for eksempel ved den sparsomme montering algoritmer til rådighed i regnvejr ²⁷ rapidSTORM ^24,25, palm3d ¹² og QuickPALM ²⁶ software . Hvis de rå data indeholder en masse overlappende signaler så algoritmer, som kan være mere passende omfatte DAOSTORM ^34, 3B ³⁵ og deconSTORM ^36. Desuden er disse algoritmer indeholder tærskelværdier for forskellige kriterier såsom signal tæller, eller fotoner pr blink, samt forskellige billede display muligheder, såsom at visualisere med afrundede Gauss-funktioner eller som histogrammer med pixel gitre, hvor super-opløsning pixelstørrelse kan være vælges af brugeren. Alle disse muligheder ændre udseendet af det endelige billede og har konsekvenser for tolkning og analyse.

<p class="jove_content"Præsenterer vi> Derfor 3 prøveemner, som vil give den nye bruger med et udgangspunkt for farvestofbaseret lokaliserings-baseret super-opløsning eksperimenter, som for overskuelighedens skyld vil vi henvise til som STORM, og mere erfarne brugere mulighed for at yderligere at optimere deres eksperimenter. For det første er det muligt at coate overfladen af ​​glas med et fluorescerende lag af dextran-dye konjugat. Det giver en hurtig og enkel måde at fastslå, at mikroskopet, farvestof og buffer arbejder på at generere blinkende fluorescerende signal. Metoden kan derefter udvides ved at sammenligne middelværdier lokalisering præcision og antal målinger genereret af Rainstorm at optimere buffer betingelser, indstillinger Image Acquisition og afprøve forskellige farvestoffer. For det andet, præsenterer vi en simpel protokol for at forberede actinfilamenter på glas, som let kan mærkes ved hjælp phalloidin-dye konjugater. Disse giver ideelle strukturer til at tage målinger af resolution ²⁷ og typisk den fulde bredde halv maksimum (FWHM)af en glødetråd gives som en empirisk vurdering af resolution ^37. Det skal bemærkes, at opløsning varierer mellem prøver og mellem billeder i den samme prøve, fordi opløsningen i lokalisering baseret super-opløsning mikroskopi er en funktion af fluorofor lysstyrke, baggrundsstøj og lokalisering densitet ²⁷ og disse er ikke nødvendigvis konstant i hele prøven. Actin filamenter bruges til at demonstrere mulige artefakter såsom mislocalizations og drift, og hvordan de kan identificeres med software funktioner i regnvejr. Desuden beskriver vi brugen af ​​fluorescerende referencemærker markører til både måle og korrekt drift. Og for det tredje, at farvningen af ​​celler med epidermal vækstfaktor (EGF)-farvning af konjugater er beskrevet. Globaliseringsfonden yder en nyttig indikator for super-opløsning billedkvalitet, fordi en del af receptoren på celleoverfladen gennemgår endocytose via vesikler, der er sub-diffraktion mellemstore strukturer ca 50-150 nmeter i diameter ^27,38,39.

Protocol

Bemærk: I hele denne protokol, er tips og forslag fundet efter visse trin. Notationen "* 1" angiver, at note 1 er relevant for denne specifikke skridt, og så videre. 1.. Fluorescent Dextran Coating of Glass Tilsæt 200 pi af 0,01% poly-L-lysin-opløsning til hver brønd på en 8-kammer dækglas og inkuberes i 10 min. Fjern med en pipette til at sikre, at ingen er væske tilbage. Opløs dextran-Alexa 647 * 1 i henhold til producentens anvisninger for at skabe en 2 mg / ml stamopløsning. Fra dette, fortyndes 0.25 pi i 25 pi afioniseret vand for at skabe en løsning, 20 ug / ml. At skabe en høj tæthed belægning af dextran-Alexa 647 løsning fortyndes 20 ml af opløsningen 20 mg / ml i alt 200 pi de-ioniseret vand. For en halvhårde opløsning fortyndes 2 pi i 200 ul deioniseret vand (1:10.000 fortynding fra det oprindelige stamopløsning). For en lavdensitet opløsning fortyndes 0.2 pi i 200 ul deioniseret vand (1:100.000 fortynding fra det oprindelige stamopløsning). Tilsæt 200 ul af de fortyndede dextran-Alexa 647 løsninger til hver brønd og inkuberes i 10 min. Længere inkubationstider kan anvendes, hvilket kan resultere i en tættere dextran coating. Fjern og vask med H2O tre gange * 2 Note 1: Andre dextran-dye konjugater kan anvendes. Ukonjugeret dextran kan også konjugeres til farvestoffer, hvis det ønskes kombinationer ikke er kommercielt tilgængelige. Note 2: De samme dextran kamre kan reimaged over en periode på uger, selv om ensartetheden af fluorescens kan falde. Opbevaring ved 4 ° C i fravær af enhver buffer anbefales. 2. Fluorescerende actinfilamenter på glas Tilsæt 200 pi af 0,01% poly-L-lysin til hver brønd af kammeret og inkuber i 10 min * 3. Rebevæge sig med en pipette til at sikre, at ingen væske tilbage. Tilføj 90 pi generel actin buffer (rekonstitueret i henhold til producentens anvisninger) til hvert kammer. Tilsæt 10 ul 10 uM præformerede actin filament-opløsning og 1 pi phalloidin-Alexa 647 (0,2 enheder, når de opløses i 1,5 ml methanol ifølge producentens anvisninger) og pipettér forsigtigt op og ned for at blande. Der inkuberes i 30 min * 4. Note 3: Øge mængden af glødetråden løsning inden resultaterne kammer færre filamenter binder til poly-L-lysin belagt glas. Note 4: inkubationstider på op til 48 timer ved 4 ° C er blevet testet med gode resultater. Actin glødetråd billedkvaliteten forringes, når et kammer har været udsat for at skifte buffer, så det ikke anbefales at bruge den samme prøve mere end én dag. 3. Mikrosfærepræparater fluorescerende perler som Fiducial Markers <li> Fortyndes 1 ml af TetraSpeck perler i 200 pi PBS og blandes. Tilsæt de fortyndede perler i et imaging kammer og vente 15 min * 5. Fjern opløsningen og vaskes 3 gange med PBS forud for billeddannelse. Note 5 – fortynding og inkubationstid kan justeres for at opnå forskellige tætheder af perler. Denne protokol typisk resulterer i mellem 3-10 perler pr 20,5 mM x 20,5 mM field-of-view. 4.. Epidermal vækstfaktor cellefarvning Kultur HeLa-celler i imaging kamre til ca 80% konfluens i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin-opløsning. Fjern kulturmediet, og vask med PBS. Derefter tilsættes 500 pi 4% formaldehyd-opløsning (4 ml 10% formaldehyd-opløsning, 1 ml 10X PBS, 5 ml vand) i 10 min. Fjern formaldehyd og vaskes 3 gange med PBS. Lad ikke cellerne til at forblive dRy og altid bruge PBS buffer løsninger for at undgå hypotonisk stress. ADVARSEL – formaldehyd er ekstremt giftigt. Sørg for, at egnede handsker, øjenbeskyttelse og kitler er slidte. Tjek de lokale retningslinjer for bortskaffelse af formaldehyd. Opløs EGF-Alexa 647 i overensstemmelse med producentens anvisninger for at skabe en 50 ug / ml stamopløsning. Tilsæt 2 pi af denne stamopløsning til 200 pi 0,1% BSA-opløsning (i PBS). Fjern PBS fra cellerne, tilsæt EGF-opløsning og inkuberes i 30 minutter. Fjern-opløsning og vaskes tre gange med PBS før tilsætning af et blokerende opløsning af 0,1% BSA (i PBS) i 15 min. Fjern denne og vask yderligere 3 gange med PBS før billeddannelse. 5.. Skifte Buffer Forberedelse Gør et enzym stamopløsning (A) med 10 pi af katalase (20 ug / ml), 20 ul 1 M Tris (2-carboxyelthyl) phosphin, hydrochlorid (4 mM), 2,5 ml glycerol (50%), 125 pi1 M KCl (25 mM), 100 pi 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg glucoseoxidase (1 mg / ml) og gå op til volumen på 5 ml med diH20. Dette er tilstrækkeligt til at gøre 100 x 50 pi alikvoter, som kan lagres ved -20 ° C, og som anvendes i op til 1 år. ) Lav en glucose stamopløsning (B) med 4 g glucose (100 mg / ml), 4 ml glycerol (10%) og 36 ml diH20. Dette er tilstrækkeligt til at gøre 100 x 400 pi portioner, som kan opbevares ved – 20 ° C, og som anvendes i op til 1 år. Lav et reduktionsmiddel stamopløsning (C) med 113,6 mg MEA-HCI (1M) og 1 ml DIH 2 0. Brug frisk eller lave 10 x 100 pi portioner, som kan lagres ved -20 ° C, og som anvendes i op til 1 måned (må ikke nedfryses igen portioner). Lige før billedbehandling, blande enzymet (A), glucose (B) og reducerende middel (C) stamopløsninger sammen i forholdet 50 ul, 400 ul, 100 ul og der fyldes op til 1 ml med PBS * 6. Denne buffer vil nu fjerne oxygen og have en reducerende miljø (100 mM MEA-HCI) * 7. Den endelige pH-værdi bør være i området fra 6,0 til 8,5 (tilpasning er normalt ikke nødvendigt) * 8. Note 6 – denne buffer er egnet til anvendelse med carbocyanine-baserede farvestoffer, såsom Cy5 og Alexa 647. Note 7 – de endelige enzymkoncentrationer er 50 ug / ml (5 enheder / ml) af glucoseoxidase og 1 ug / ml (40-60 enheder / ml) af katalase. Den enzymatiske aktivitet (enheder) er givet ved leverandørerne og kan variere. Beregningerne for katalase antage, at 1 mg / ml slutkoncentration efter trin 5.4 vil indeholde 50 enheder af enzym. Forskellige puffersammensætninger, herunder lignende oxygenopfangende bestanddele kan findes 21,30,40. For en oversigt over buffer-og farvestof kombinationer se referencer 28,29. Glycerin og TCEP er nødvendige for langtidsopbevaring ved -20 ° C. Note 8 – hvis imaging actinfilamenter tilføje 2 mM MgCl2 og 0,2 mM ATP at hjælpe med at stabilisere than filamenter. 6.. Mikroskop Erhvervelse af STORM data (ved hjælp af Alexa 647 farvestof) Tænd STORM / PALM mikroskop, fortrinsvis mindst 3 timer før billeddannelse til at tillade en termisk ligevægt, der skal nås. Imaging før dette har en øget risiko for afdrift. Sæt imaging kammer i mikroskopbordet prøveholderen. Sørg for, at prøven er fast i holderen og er flad. Fjern PBS fra imaging kammer og derefter fylde til toppen med skift buffer. Placer forsigtigt et dækglas over toppen af ​​kammeret, og sørg for, at der ikke er bobler på alle, og at hele kammeret er dækket. Fyld op med ekstra buffer eller PBS, hvis eventuelle bobler ses ellers buffer præstationer kan falde. ADVARSEL – for at minimere risikoen for lateral og aksial afdrift af prøven i forhold til målsætningen linse anbefales det, at prøven og bufferen er overladt til ligevægttil stuetemperatur i mindst 15 minutter før billeddannelse. Find en fluorescerende struktur af interesse, der skal afbildes. Vælg den ønskede vinkel af belysning, i dette tilfælde, en TIRF eller meget skrå vinkel anbefales som dette forbedrer signal-støj-forholdet ved at minimere ud-af-fokus lys, som især er til gavn for celleprøver. Tag en henvisning diffraktionsbegrænset billede af strukturen før STORM billeddannelse. Forøg excitation laser (med en passende excitationsbølgelængde på ca 640 nm) til en høj effekt, svarende til ca 2 kW / cm 2, mens billeddannelse med kameraindstillinger af 10 msek eksponering og en cyklustid på omkring 50 Hz (frames per sekund) . Når fluoroforer har skiftet til en sparsom blinkende mønster (sandsynligvis inden for 10 sekunder for de fleste prøver) * 9 indsamle 10.000 rammer. Note 9 – 10.000 frames er velegnet til den her beskrevne prøvermen det kan være nødvendigt at øge rammenummeret til 50.000 eller mere for andre prøver. 7.. Rekonstruktion Super-Resolution billeder fra Raw data (ved hjælp Rainstorm) Åbn rainSTORM.m fil fra Matlab og køre (Figur 1A). I regnvejr (Figur 1B) vælge det billede fil, der skal analyseres ved hjælp af knappen Gennemse. Dette bør være en. Tif-fil (ImageJ kan bruges til at konvertere andre filtyper i et tif format). Alter pixel bredde til at matche de rå data i mikroskop system, der anvendes til at erhverve data * 10. Lad de andre værdier til standard. Note 10 – En typisk EMCCD kamera har en pixelstørrelse på 16 um, så på et system med et 100X objektiv pixelstørrelsen på billedet vil være 160 nm. På kommercielle systemer pixelstørrelse er normalt vises i softwaren. Pixel størrelser varierer mellem 100 nm og 160 nm for de fleste localization mikroskoper. Tryk på knappen 'Proces Images' og vente, indtil en foreløbig billede vises. Varigheden af behandlingen afhænger af filstørrelsen computer specifikationer og antallet af ansøgerlande blinker inden for de rå data * 11. Note 11 – 10.000 frame sekvenser af actin og data EGF tog 23 sek og 25 sek til at behandle henholdsvis bruger en pc med en Intel Xeon E5420 CPU. Brug den samme computer uden en parallel behandling værktøjskasse i Matlab, eller med en computer uden multiple core behandling, tider var 66 sek og 81 sek hhv. For at generere en opdateret super-opløsning trykke 'Åbn Anmelder' knappen og et andet vindue vises (Figur 1C). Tryk på knappen 'Kontrast' for at ændre det viste billede som ønsket (figur 1D). I nogle tilfælde, hvor billedet er meget mørk den maksimale værdi skal være nedsat. Brug reviewer vindue (Figur 1C) til at generere brugbare billedkvalitet målinger og forfine super-resolution image yderligere. Sæt de første tre kvalitetskontrolparametre til værdier på 4.000, 0,1 og 0,8-2,0 henholdsvis * 12. Opdater tællinger pr foton værdi, som bør enten være baseret på en foton kalibrering måling eller ved hjælp af foton-kurve kalibreringskurve angivne værdier af kameraet producenten for en bestemt EM gevinst indstilling. Dette er afgørende for at opnå nøjagtig præcision og opløsning målinger * 13. Note 12 – Signal Tæller afviser blinker baseret på kriterier lysstyrke. Jo højere værdi, jo lysere blink må være at blive accepteret som en lokalisering i det endelige billede. Det kan være nødvendigt at ændre afhængigt foton output af farvestof og eksponeringstid og følsomhed af kameraet. Tolerance afviser blinker, hvis der er en betydelig kvadraters fejl mellem signal og monteret Gauss dvs double toppe. PSF Sigma Range afviser blinker, hvis monteret bredde PSF ligger uden for dette interval, kan sige et snævrere område skal bruges til at afvise out-of-fokus signaler og store aggregerede klatter af konstant fluorescens. Ved hjælp af en bredere vifte kan resultere i mislocalization artefakter forekommer i det endelige billede. I praksis anbefales det at udføre den første kvalitetskontrol ved hjælp af lokalisering præcision cutoff parameter. Note 13 – for mere om opløsning målinger se referencer 23,27. I korte træk ved at kende antallet af fotoner, der produceres af hver blinke, er det muligt at beregne lokalisering præcision af hver lokalisering og dermed udlede samlet betyde præcision skøn for hele billedet. Brug af en Andor ixon DU-897E med en gevinst indstilling på 200 greverne pr Photon værdi er 9,04. Alter lokalisering præcision cutoff (figur 1C) til afvejning mellem optimering gennemsnitlige localization precision mod lokalisering nummer i det endelige billede. Værdier på 30-50 nm anbefales afhængigt af kvaliteten af ​​de data, og prøven. Både histogrammer og info.txt filer kan bruges til at informere denne beslutning (figur 1F og 1G). Rekonstruktionen skalafaktor (figur 1C) standard er 5, hvilket vil generere pixels super-opløsning på 32 nm, under forudsætning af, at pixel bredde i de originale billeder er 160 nm. Hvis de rå billeder har en pixelstørrelse på 100 nm vil producere billeder super-opløsning med pixels på 20 nm. Øg skala faktor til at producere mindre super-opløsning pixels i det endelige billede * 14. Note 14 – Opløsning af lokalisering mikroskopi afhænger udjævning kræves for visualisering (dvs. pixelstørrelse et simpelt histogram rekonstruktion) samt lokalisering præcision. I praksis bør genopbygningen pixelstørrelse generelt være mindre end lokaliseringpræcision (se Mean Precision Vurdering metrisk i info tekstfil – trin 6.11 og 6.12). I dette tilfælde tab af opløsning på grund af genopbygningen pixelstørrelse vil være lille 23,27. For eksempel den gennemsnitlige præcision estimater i række og kolonne retning i figur 4E er 16,1 nm og 16,2 nm. En pixel størrelse på 16 nm er blevet anvendt til at visualisere disse data (genopbygning skalafaktor 10 med en original Pixelbredden på 160 nm). Ændre grænsen frame interval (Figur 1C) for at begrænse genopbygningen til delmængder af de rå data, for eksempel [2001-inf] ville udelukke de første 2.000 rammer af rådata. Tryk på 'Kør Anmelder' knappen (Figur 1C) til at generere en opdateret super-opløsning (Figur 1E). Tryk på "Vis Histograms 'knappen (figur 1C), for at kunne vise billedkvalitet målinger (figur 1F) * 15. </ol> Note 15 – Grafen i øverste højre afbilder antallet af accepterede lokaliseringer mod kamera ramme nummer og Thompson Localization Præcisering histogram i nederste højre (figur 1F) kan bruges til at informere lokalisering præcision cutoff gennemgang mulighed. For eksempel ville bruge en 50 nm cutoff udelukke alle lokaliseringer med dårligere præcision fra at blive medtaget i den endelige super-opløsning. Tryk på knappen 'Gem billede' i korrekturlæseren (figur 1C) for at gemme alle disse data * 16. Note 16 – Mellem 3 og 5 filer kan gemmes afhængigt af de valgte (sum billede, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists) muligheder, se figur 1G. Stormen behandlede billede vises med modificeret kontrast og farve kort. Den STORMdataImage er et gråskalabillede, hvor grå-niveauet for hver pixel lig følelsesløsis af lokaliseringer, der blev identificeret i det. Efter en gennemgang af data (f.eks info.txt fil og histogrammer) tilbagevenden til trin 7,6 og gentage de efterfølgende trin med forskellige korrekturlæser parametre, hvis det ønskes. Hvis du trykker på 'Gem billede' i trin 7.11 overskriver tidligere gemte data. 8.. Box Tracking og Drift Correction (ved hjælp Rainstorm) Følg trin 7,1-7,9 at generere et billede på den normale måde. Tryk på 'Box Tracking-knappen i korrekturlæser (figur 1C), og klik og træk en boks over fiducielle markør eller struktur af renter på revideret billede. Vent et nyt billede vises, som vil vise de "Boxed positioner« (se figur 6B, 6C og 6F for eksempler). Gem dette billede, hvis det ønskes. Hvis objektet af interesse er et referencepunkt markør så glider korrektion kan udføres ved at klikke på 'Set Anchor' knappen efterfulgt af "Subtarmkanalen Drift 'knappen. Til sidst klik på 'Kør Anmelder' igen for at generere et nyt STORM billede, som nu vil have alle lokaliseringer korrigeres i henhold til fiducial markør positioner. Perlen positioner slettes fra den endelige revideret billede. Hvis der er andre referencemærker markører inden den endelige drift korrigerede billede, kan disse fjernes ved at trykke på 'Box Tracking', 'Slet Boxed' og derefter 'Kør Anmelder' så mange gange som ønsket.

Representative Results

Dextran En vellykket belægning af dextran skal producere en fluorescerende monolag. Ved den høje koncentration bør dette fremstå relativt ensartet. Ved lavere koncentrationer vises sparser (figur 2A). Mange STORM / PALM mikroskoper har mulighed for at ændre vinklen på belysningen fra epifluorescens til TIRF. Når du bruger et full frame kamera visning, for eksempel ved 512 x 512 pixels på en typisk EMCCD kamera, skal observeres en jævn belysning. Hvis der er nogen striber eller out-of-fokus regioner kan dette indikere, at prøven bør genindsættes i prøveholderen med frisk olie på den objektive linse. Alternativt kan det indikere et problem med mikroskopet. Ved køb af super-opløsning rådata det billeddannende laser bør øges ved magten til ca 2 kW / cm 2. Der vil være et udbrud af fluorescens efterfulgt af blinke som fluoroforer drives imidlertidige mørke stater. Ved høj dextran tætheder de blinker er tilbøjelige til at overlappe hinanden, især i nærheden af begyndelsen af opkøbet billedet (video 1). På mellemlang og lave tætheder disse blinker bør være sparsom, dvs rumligt adskilt, og i fokus med nogen indlysende baggrund (se frames 2.000, 5.000 og 8.000, figur 2A, Videos 2 og 3). Under billedet erhvervelse fase, ved konstant laserbelysning, vil antallet af blink aftage med tiden (sammenlign ramme 2.000 med ramme 8.000 i den høje prøve tæthed, figur 2A). Den væsentligste forskel mellem de forskellige billeder af de forskellige dextran koncentrationer (høj, middel og lav) super-opløsning er det faldende antal lokaliseringer (figur 2A og 2B). Med andre ord er koncentrationen af ​​de fluorescerende molekyler, antallet af blink i de rå data, og antallet af lokaliseringer har en proportional sammenhæng. Dette forhold,er imidlertid ikke en simpel lineær som ved meget høj molekyle tætheder softwaren er i stand til med succes at lokalisere molekyler (sammenlign de røde og blå linjer, figur 2C). Grunden til dette er, at den høje koncentration er det ikke muligt for behandling software til at passe de positioner vha. Gaussisk montering algoritme hvor blink er ikke-sparse. Da blinker falde gennem erhvervelse fase på grund af fotoblegning softwaren kan passe mere og mere af de blinker som de bliver sparsomme (figur 2A og 2C). Desuden kan de enkelte farvestofmolekyler blinke og dermed lokaliseres mere end én gang 28,41,42. Et almindeligt problem, når billeddannelse nogen af ​​disse prøver, men især med høj densitet dextran en, kan være forekomst af lyse, men ufokuserede fluorescerende tåge, der synes at være hurtigt diffunderer under STORM billede erhvervelse fase. Dette adskiller sig fra de høje kontrast fluoroforer påoverfladen af glasset, som kan ses at blinke (figur 3A, Video 5). Disse udsendte fluorescerende molekyler kan forebygges eller fjernes ved at øge antallet af vasketrin med PBS før tilsætning af skift puffer eller ved tilsætning af frisk skifte puffer til kammeret (figur 3B, Video 6). Behandling og sammenligning af data fra hvert billede sekvens resulterer i meget forskellige billeder super-opløsning, der har et fald i både antallet af lokaliseringer og den præcision, hvormed de kan monteres af softwaren til at lokalisere blinker (figur 3C, 3D, 3E og 3F). Actinfilamenter Fabriksfremstillet actinfilamenter kan ses fast på overfladen af glasset diffraktionsbegrænset imaging (figur 4A-4C). Hvis antallet af filamenter forekommer meget lav, så kan en længere inkubationstid anvendes eller et fald i mængden af ​​actinendeløse løsning hjælper også. Valg af enlige relativt lyse filamenter (figur 4D) snarere end sammenfiltrede områder resulterer i bedre kvalitet billeder. Under købet fase bør lyse områder i fokus blinker ses langs længden af filamentet (Video 7). Sparsomme blinkende skal ses i købet fasen og efterfølgende i de behandlede data der bør være en tynd endeløse (Figur 4E), og lokaliseringer pr rammen skal et gradvist fald (Figur 4F), i modsætning til i figur 3E. Hvis blinker er ikke sparsom, eller hvis softwaren ikke er i stand til at lokalisere molekyler, en mere subtil artefakt, der kaldes en mislocalization 32, kan medføre. Dette opstår, når softwaren gennemsnit position to overlappende molekyler og lokalisering er positionen midtvejs mellem dem. En indikation af, at der ikke har været et betydeligt antal overlappende bliNKS og dermed mislocalizations, er, at den gennemsnitlige præcision skøn skal være den samme i de rækker og kolonner retninger, altså horisontalt og vertikalt, hvor der er mislocalizations disse ville have fundet sted langs længden af glødetråden, produceret en større end normal blink ( dvs. spredt over flere pixels), som dermed ville være blevet lokaliseret med mindre nøjagtighed i en af retningerne. Det er nemmest at se, hvor der er en enkelt actin glødetråd i billedbehandling område, og det ligger vandret eller lodret. I dette tilfælde STORM mikroskop, opnåede en gennemsnitlig nøjagtighed på 16 nm i begge retninger. Dette resulterer i en præcision grænse, et mål for effektiv billedopløsning på omkring 34 nm. Disse målinger er leveret af Rainstorm 27, men som vi har en trådformede struktur ensartet diameter, 7 nm med den meget lille phalloidin-Alexa 647 etiket, vi kan træffe en foranstaltning af FWHM at estimere opløsning af billedet. Ved drakanten en lige linje gennem filamentet af den super-opløsning i ImageJ (figur 4G), ved hjælp af plottet profilfacilitets (fig. 4H) og efterfølgende udførelse af en Gauss fit (fig. 4I) FWHM beregnes som 43,2 nm. Når du forsøger denne måling anbefaler vi, at pixelstørrelse skal matche eller være lidt mindre end den gennemsnitlige præcision estimat for billede (se info.txt fil Figur 1G). I dette tilfælde blev 16 nm pixel benyttes til at rekonstruere et billede. To relaterede problemer kan opstå med STORM, hvor de blinkende fluorophores blive ikke-sparsomme, dvs enkelte molekyler inden for ca 250 nm blink på samme tid, og derfor signalerne overlapper hinanden. Den første er, at afhængigt af den algoritme og kvalitetskontrol kriterier, den anvender, de blinker ikke kan lokaliseres på alle. Dette resulterer i billeder, super-opløsning med få eller ingen lokaliseringer. Det andet problemmislocalizations opstår, når de to blink forekom tilstrækkeligt tæt på hinanden til at fremstå som et enkelt blink. I dette tilfælde stilling i det endelige billede repræsenterer et gennemsnit af de to. For flere detaljer om denne se reference 32. I begge tilfælde kan dette ske med meget høj densitet prøver, utilstrækkelig laser magt eller med skift buffer problemer. Dette problem er tydeligt, hvor en række af actinfilamenter forgrening og / eller krydser hinanden (figurerne 5A-D, Video 9). Ved behandling af delmængder af frames, og sammenligne de første og de sidste 5.000 billeder kan vi se en anden resulterende billede. I super-opløsning ved hjælp af de første 5.000 frames (figur 5C) kan vi se, at der er mange lokaliseringer i midten af billedet, men ved brug af de sidste 5.000 frames, meget få af disse er synlige, og vi står tilbage med kun filamenter, om end noget usammenhængende på grund af det lave antal af lokaliseringer i image (figur 5D). Hvis der er mistanke for høj blinker tæthed sammenligning af billeder med lokalisering per frame data tyder på, at dette problem forekommer, i det første sæt af frames er der et gennemsnitligt antal lokaliseringer pr ramme på over 10 i forhold til det sidste sæt rammer, hvor det er cirka 4 (figur 5E). For at minimere sandsynligheden for mislocalizations forekommende er det ideelt at have så få lokaliseringer per billedfelt som muligt, men hvis der er et stort antal molekyler, der skal afbildes, dvs en høj tæthed prøve kræver dette, at et stort antal erhvervelse rammer tages der fører til et andet problem i STORM mikroskopi der er afdrift. Lateral Drift – actinfilamenter og Referencemærker Markers Drift opstår, når prøven bevæger sig i forhold til målet linse gennem dataopsamling fase. Det er vanskeligt eller umuligt at se During billedet erhvervelse fase, især hvis det er lateral snarere end aksial, eller medmindre det bliver specielt måles, da det er typisk mindre end 50 nm i løbet af adskillige minutter for relativt stabile mikroskop-systemer. Men i rekonstruerede billeder af kendte strukturer såsom actinfilamenter med veldefineret struktur, kan det påvises i billeder, super-opløsning. Det første tegn på, at lateral drift kan have forekommet, er, at strukturen er større end forventet (figur 6A, Video 8), for eksempel med en relativt stor FWHM sammenlignet med præcision limit data fra regnvejr, i dette tilfælde 90 nm sammenlignet med 67 nm. Men en bedre måde at detektere glidning ved at sammenligne lokaliseringer som en funktion af tiden, dvs at se, om de lokaliseringer i de senere rammer er forskudt i forhold til de i starten rammer. Dette kan tydeligt ses i tilfælde af actinfilamenter, der er meget lille og ensartet struktur, nårvises med en farvekode ved hjælp af boksen sporing funktion i Rainstorm (figur 6B og 6C). Drift er et velkendt problem, og der er en række strategier, der kan bruges til at minimere det 19 eller rette det efter købet enten via referencemærker markører 21,43 eller krydskorrelationer 44. For at måle afdrift og korrigere for det, kan fluorescerende perler på 100 nm i diameter anvendes som referencemærker markører (figur 6D). Fordi de er små og lyse deres position nøjagtigt kan måle ved hjælp Gaussisk montering algoritmer, såsom regnvejr. I et eksempel, hvor der er relativt alvorlig afdrift cirka 100 nm i løbet af 3 min 10 sek under erhvervelse fase (figur 6E), samme boks sporing funktion kan anvendes til at farvekode og bekræfte, at afdrift opstod (figur 6F ). Da alle fire perler i dette eksempel viser næsten identiske afdrift er det possible at vælge en af dem, i dette tilfælde perle 2, at bruge som reference og trække afdrift fra de andre perler (Figur 6G). Ved at tilføje referencemærker markører til en biologisk prøve af interesse så bliver det muligt at måle og korrigere enhver tendens, hvor den underliggende struktur er ukendt eller langt mere variabel end en actin filament eller en fluorescerende kugle. Epidermal vækstfaktor Endelig kan EGF-farvede HeLa-celler anvendes til at give et realistisk eksempel billedopløsning i celler (Figur 7A, Video 10). Disse celler er relativt ligetil at billedet, som de skal have hovedparten af ​​EGF-fluorescens i planet af fokus på celleoverfladen i tæt nærhed til dækglas. Den mindre lyse region i centrum svarer til positionen af ​​kernen. TIRF belysning kan forbedre billedkvaliteten ved at eliminere ud-af-fokus fluorescens kommer fra dele af cellen membrane ikke i umiddelbar nærhed af glas (ca. 150 nm indtrængen i celler). Zoomet i områder af interesse i diffraktionsbegrænset billede er typisk utydelig (figur 7B og 7C), men på billeder af de super-opløsning bør der være en blanding af klynger og lejlighedsvise isolerede enkelt pixel (figur 7D-7F). Disse vil repræsentere enten receptorer isoleret EGF på celleoverfladen eller muligt en lille mængde af ikke-specifik binding. Klyngerne vil være ca 100 nm i diameter og er tilbøjelige til at svare til danner gruber og vesikler, vejen via hvilken EGF er overvejende nedreguleret og endocytose. Typiske gennemsnitlige præcision skøn er omkring 20 nm for denne type af prøven med en nøjagtighed grænse på omkring 45 nm. Det skal bemærkes, at denne præcision grænse mål for effektiv opløsning ikke tager højde etiket størrelse, eller enhver tendens, der kan måles med referencemærker markører, men er stadig noticeable af "komet haler" på klynger eller ved hjælp af boksen sporing funktionen som skitseret i figur 6 og beskrevet i protokol afsnit 8.. Component Slutkoncentration Catalase 1 ug / ml (50 enheder) Glukose 40 mg / ml Glucoseoxidase 50 ug / ml Glycerin 12,50% KCl 1,25 mM MEA-HCI 100 mM TCEP 200 uM Tris 1 mM Tabel 3. Switching puffer Typiske Acquisition Indstillinger Value Pixel størrelse (nm) </td> 160 Eksponeringstid (ms) 10 Gain 200 Ramme størrelse (pixels) 128 x 128 Cyklus tid (fps) 52,5 Frame nummer 10.000 640 nm laser effekttæthed (kW / cm 2) 2 Tabel 4.. Acquisition-indstillinger Figur 1. STORM Billede Genopbygning Brug regnvejr. (A) Åbning Rainstorm indefra MATLAB. (B) Rainstorm grafisk brugergrænseflade (GUI). (C) Rainstorm Anmelder GUI. (D) Juster kontrasten vindue. (E) STORM billede efter gennemgang og justering kontrast. (F) Hanstograms billedkvalitet målinger. (G) Filer genereret efter at trykke på knappen Gem billede i korrekturlæser GUI. Klik her for at se større figur . Figur 2.. (A) Diffraction begrænset (DL) billeder viser forskellige koncentrationer af dextran før STORM billeddannelse. Super-opløsning (SR) billede rekonstruktioner har en pixelstørrelse på 25 nm. 10.000 billeder blev opsamlet med en 128 x 128 pixel stel størrelse og de enkelte billeder vises fra denne sekvens (2.000, 5.000, 8.000). Erhvervet med en 10 msek eksponeringstid på 52,5 billeder per sekund. Billeder har en pixelstørrelse på 160 nm. For klarhed i visning af en 0,1% pixel mætning kontrast ekstraudstyr blev anvendt ved hjælp ImageJ. Den gennemsnitlige præcisionskøn er 28 nm (høj), 24 nm (medium) og 16 nm (lav) for de forskellige dextran billeder. Lokalisering tætheder er 724 per um 2 (høj), 526 per um 2 (medium) og 13 pr um 2 (lav). (B) Graf, der viser et gennemsnit af tre 10.000 rammesekvenser for hver koncentration af dextran. Fejllinjer viser standardafvigelsen. (C) Graf plotte antallet af accepterede lokaliseringer pr ramme ved hjælp af en rullende 100 ramme gennemsnit. Klik her for at se større figur . Figur 3. Dårlig kvalitet Dextran data. (A) Diffraction begrænset ramme fra en 15.000 frame STORM sekvens. Bemærk den diffuse fluorescerende uklarhed hen over billedet. Dette skyldes fluoropho res diffunderer gennem mediet. 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. (B) Det samme som (A) efter bufferen var blevet ændret. Bemærk den forbedrede kontrast som ubundne fluoroforer er blevet vasket væk. (C) En super-opløsning genopbygning svarende til de indsamlede i (A) data. Identiske billede størrelse, men med pixels på 25 nm. Den gennemsnitlige præcision estimat er 35 nm. (D) En super-opløsning genopbygning svarende til de indsamlede i (B) data. Identiske billede størrelse, men med pixels på 25 nm. Den gennemsnitlige præcision estimat er 30 nm. (E) Graf plotte antal godkendte lokaliseringer per frame, ved hjælp af en rullende 100 ramme gennemsnit. Den røde linje svarer til STORM sekvens (A & C), hvor der er en høj baggrund. Den blå linje viser data svarende til (B & D), hvor baggrunden er lav. (F) Graf, der viser den accepterede lokalisering antal for billederne, der svarer til høj (C) og lav (D) baggrundsdata.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se større figur. Figur 4.. Typisk Actin data. (AC) diffraktionsbegrænset billeder af actinfilamenter før tilsætning skifte puffer og STORM billeddannelse. Variable længder af filamenter kan ses. Meget lyse filamenter er ofte flere glødetråde filtrede sammen. Pixel størrelse er 160 nm. (D) en diffraktionsbegrænset billede af et enkelt actin filament. (E) STORM billede (0,1% kontrastforbedring anvendes i ImageJ). Fra en 10.000 frame sekvens med en 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Pixelstørrelsen er 16 nm. Den gennemsnitlige præcision estimat er 16 nm. (F) Graf plotte antallet af accepterede lokaliserings pr ramme, ved hjælp af en rullende 100 ramme gennemsnit. (G) Et zoomet i region af actin filamenter fra (E) før kontrast ekstraudstyr med en gul linje profil trukket over. (H) Et plot profil udsigt fra den gule linje på tværs actin filament. Dannet i ImageJ. (I) en Gauss fit af plottet profil ved hjælp af kurvetilpasning værktøj i ImageJ. Standardafvigelsen, d, blev ganget med 2,35 for at få en FWHM måling af 43,2 nm. Klik her for at se større figur . Figur 5. Mislocalized actin filamenter. (A) diffraktionsbegrænset actin filament. 160 nm pixels. (B) STORM billede af actin filament vist i (A). Fra et 20.000 rammesekvens med en 128 x 128 pixel frame størrelse, en 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Stormen pixelstørrelse er 16 nm. Alle 20.000 frames blev behandlet. Den gennemsnitlige præcision estimat er 17 nm. (C) Som (B), men med kun de første 5000 billeder af de 20.000 frame sekvens behandles. Den gennemsnitlige præcision estimat er 18 nm. (D) Som (B), men med kun de sidste 5.000 billeder af de 20.000 frame sekvens behandles. Den gennemsnitlige præcision estimat er 17 nm. (E) Graf over lokaliseringer per frame data fra fuld 128 x 128 pixel ramme visning. Figur 6. Lateral Drift. (A) STORM billede af en actin filament rekonstrueret fra en 10.000 frame sekvens med en 64 x 64 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og træffes på 64,6 billeder per sekund. Stormen pixelstørrelse er 32 nm. Den gennemsnitlige præcision skøn er32 nm. (B), der vises en storm billedet ved hjælp af 'Box Tracking "-funktion i regnvejr. Lokaliseringer vises med en farve, der svarer til rammen antallet af da de blev købt, for eksempel, lokaliseringer fra tidligt i rækkefølge erhvervelse er blå, lokaliseringer fra sent i rækkefølge købet er røde. De fordrevne farver indikerer, at afdrift har fundet sted. (C) en indzoomet region (A), der vises ved hjælp af boksen Tracking-funktionen i regnvejr. De fordrevne farver indikerer drift har fundet sted. (D) En diffraktion begrænset billede af fire 100 nm fluorescerende perler, som kan anvendes som referencemærker markører. Pixelstørrelse 160 nm. Numbers 1-4 viser beskåret og zoomet enkeltvis perler. (E) Hver fluorescerende perle, der svarer til (D) rekonstrueret i regnvejr fra en 10.000 frame sekvens med en 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Stormen pixelstørrelse er 5 nm. Den gennemsnitlige præcision skøn er 7 nm. (F) Perler, der svarer til (D) og (E),vises ved hjælp af 'Box Tracking "-funktionen. De fordrevne farver indikerer drift har fundet sted. (G) Ved hjælp perle nummer 2 som reference, er perler 1, 3 og 4 vises efter "Fratræk Drift"-funktion, der anvendes i regnvejr. Sammenligning med (E) viser, at den laterale afdrift er blevet korrigeret. Stormen pixelstørrelse er 5 nm. Klik her for at se større figur . Figur 7. Typisk EGF data. (A) Diffraction begrænset billede af en del af en HeLa celle fokuseret på den basale celleoverfladen. Gule felter angiver zoomet i områder af interesse vist i (B) & (C). (B), der er zoomet ind diffraktion begrænset billede fra regionen nær kanten af ​​cellen (rubrik B). (C) Zoomet i diffraktion begrænset billede fra region under kernen (rubrik C). (D) STORM billede svarende til (A). Fra en 10.000 frame sekvens med en 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Stormen pixelstørrelse er 25 nm. Den gennemsnitlige præcision estimat er 21 nm. (E) STORM billede svarende til feltet E (D). (F) STORM billede svarende til feltet F (D). (G) lokaliseringer per frame data fra (D). Klik her for at se større figur . . Videoer 1-4 Videos svarer til figur 2A med varierende dextran koncentrationer: 1 = høj, 2 = middel, 3 = lav, 4 = ingen). 10.000 frame sekvenser med 128 x 128 pixel modulstørrelser, er erhvervet med en 10 msek eksponeringstid på 52,5 billeder per sekund. Klik her for at se video 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> video 2, video 3 , video 4 Videoer 5-6. Videoer svarer til figur 3 A & B. Video 5 er forvask og video 6 er post-vask efter ubundne fluoroforer er blevet fjernet. 15.000 rammesekvenser ved hjælp af en 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Klik her for at se video 5 , video 6 . Video 7.. Video, der viser den rå frame sekvens, der blev behandlet for at generere STORM billedet i figur 4E. 10.000 frame sequence med en 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Klik her for at se video 7 . Video 8.. Video, der viser den rå frame sekvens, der blev behandlet for at generere STORM billedet i figur 5B. 20.000 frame sekvens med en 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Klik her for at se video 8 . Video 9. Video, der viser den rå frame sekvens, der blev behandlet for at generere STORM billedet i figur 6A. 10.000 frame sekvens med en 64 x 64 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og træffes på 64,6 billeder per sekund. Click her for at se video 9. Video 10. Video, der viser den rå frame sekvens, der blev behandlet for at generere STORM billedet i figur 7D. 10.000 frame sekvens med en 128 x 128 pixel rammestørrelse, 10 msek eksponeringstid og erhvervet på 52,5 billeder per sekund. Klik her for at se video 10 .

Discussion

Vi viser med nogle enkle prøver og den frit tilgængelige behandling software Rainstorm er det muligt at optimere STORM super-opløsning billeddannelse. Disse værktøjer og metoder vil give nyttige udgangspunkter for nye brugere og måder for erfarne brugere at øge tilliden til deres mikroskoper og deres brug af dem til at studere biologiske og cellulære strukturer med hidtil usete detaljer. Ved hjælp af en kombination af prøver med kendte eller velforståede strukturer og en algoritme, der kan producere en række nyttige billedkvalitet målinger, såsom gennemsnitlige præcision skøn, lokalisering nummer og histogrammer viser det er muligt at forbedre billedkvaliteten og at have større tillid i STORM imaging proces. Der er ingen one-size fits all tilgang til erhvervelse af data, da der er en række forskellige kommercielle og selvbyggede mikroskop konfigurationer, der kan anvendes. Desuden er der mange Prøveforberedelse og Image Acquisition skridt, som kan få indflydelseENCE det endelige billede derfor have softwareværktøjer og prøver er afgørende for at forstå og optimere STORM billedkvalitet.

Derudover disse protokoller kan give nyttige og mindre tvetydige måder fejlfinding eventuelle problemer, der måtte opstå. For eksempel dextran prøve er en meget nyttig måde at identificere, hvis der er nogen laserstråle forskydning eller ujævn belysning af prøven. Hvis der er bekymring for, at skifte buffer kan ikke arbejder en meget simpel visuel test for at se om der er nogen "blinker" vil hjælpe. Actin filamenter er en nyttig måde at måle opløsning ved hjælp af FWHM sammenligninger samt fremhæve afdrift og mislocalization artefakter. Dog skal det bemærkes, at som lokaliserings-baseret super-opløsning metoder kan være fluorofore tæthed følsom trods af de andre medvirkende faktorer, såsom eksponeringstider, frame rates, laser beføjelser og den måde, billedet er behandlet, er det umuligt at tildele en beslutning til etsærligt mikroskop og antage, at alle billeder vil have denne resolution. Hvad der er muligt, er imidlertid at måle forskellige aspekter af opløsning, såsom gennemsnitlig localization præcisionsniveau lokalisering nummer og drive ^27. Selv hvis Referencemærkernes markører ikke kan indarbejdes i hvert forsøg, de kan, i det mindste, anvendes til at karakterisere et mikroskop, dets miljø og bedre forstå driftsmæssige overvejelser såsom hvor meget tid der kræves for at nå termisk ligevægt efter opstart. Samt korrektion for lateral afdrift kan referencemærker markører anvendes til at karakterisere og korrigere for aksial afdrift, selv om dette kræver brug af et astigmatisk linse og en feedback-mekanisme til at korrigere prøven position, mens billederne bliver overtaget ^43. Kommercielle super-opløsning systemer vil normalt omfatte en form for stabilitet kontrol eller fokus-låsemekanisme, som kan være en mere praktisk løsning til at korrigere fokus afdrift.

Der enre alternativer til ikke-specifikt at belægge glasset med dextran, såsom anvendelse af farvestoffer direkte eller andre konjugatmolekyler, såsom sekundære antistoffer. En begrænsning af disse metoder er, at antallet af molekyler, der er bundet til glas, som ikke er kendt. Alternative trådformede strukturer, der er blevet brugt omfatter mikrotubuli ²⁸ og DNA ^21. Men kombinationen af meget lille størrelse og praktiske kommercielt tilgængelige reagenser gøre actin et attraktivt alternativ, især da afstandskravet af divergerende eller forgrenede filamenter også kan være en nyttig måling af systemets ydeevne ^27..

Der er plads til yderligere udvikling af prøver, på trods af de seneste fremskridt på dette område ^28,29,46,47. Især multi-farve imaging præsenterer en række udfordringer i alle 3 vigtigste aspekter af billedbehandling, prøve mærkning Image Acquisition (hardware) og software (billedbehandling og justering). Der har en væreten række publikationer vedrørende disse aspekter ^4-6, og det er derfor klart, at relevante prøver og metoder er afgørende for at skabe og pålideligt fortolkningen af disse typer af billeder. Faktisk, for nylig blev det vist, at dSTORM kunne bruges til at tage to farvebilleder af og løse, den meget symmetrisk karakter af det nukleare kompleks pore og forfatterne foreslog, at dette ville være en ideel måde at vurdere resultaterne af kromatisk aberration korrektioner ^45. En anden interessant tilgang er brugen af DNA-origami til at skabe en nanoruler, som skaber mulighed for positionering fluorophores ved specifikke sub-diffraktion afstande fra hinanden ^46. Dette giver en måde at vurdere opløsning og gøre distance. Det endelige mål er dog at anvende disse super-opløsning teknikker til ikke-idealiserede prøver, såsom celler, som er komplekse tredimensionelle strukturer. I dette tilfælde, en kombination af mere grundig forståelse af tHan teknik kombineret med softwareværktøjer, at støtte brugeren i at erhverve data, behandling, det på passende måder, og give billedet målinger vil sandsynligvis være det ultimative svar. ^28,29,47,48

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Imaging chamberglass	Fisher	CBR-166-390E	Sample preparation
Inverted Microscope	Olympus	IX71	* See below for alternatives
100 X TIRF Objective Lens	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* See below for alternatives
EMCCD Camera	Andor	iXon 897	* See below for alternatives
640 nm laser	Toptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes
LabVIEW	National Instruments		*Acquisition software (controlling hardware)
PC	Dell		Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing
ImageJ			Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM	Laser Analytics Group (Cambridge) software		http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Example of self-built STORM/PALM microscopes			Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes			Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes
			Table 1. Materials & Equipment
			[header]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
General actin buffer	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Preformed-actin filaments	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Phallodin-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)	Invitrogen	T-7279	3.1
HeLa cells	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Pen/Step	Invitrogen	15070063	4.1
Plastic dishes	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF – Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldehyde – 10% solution EM grade	Polysciences	04018-1	4.2
Catalase	Sigma	C100	5.1
Glucose oxidase	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glucose	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Glycerin	Sigma	G2289	5.1; 5.2
			Table 2. Reagents