Vi beskriver fremstillingen af tre prøveemner, og hvordan de kan bruges til at optimere og vurdere resultaterne af STORM mikroskoper. Ved hjælp af disse eksempler viser vi, hvordan at erhverve rå data og derefter behandle det at erhverve billeder super opløsning i celler på ca 30-50 nm opløsning.
STORM er et nyligt udviklet super-opløsning mikroskopi teknik med op til 10 gange bedre opløsning end standard fluorescens mikroskopi teknikker. Men da billedet er erhvervet i en meget anderledes måde end normalt, ved at opbygge et billede molekyle-by-molekyle, der er nogle store udfordringer for brugerne i at forsøge at optimere deres billede erhvervelse. For at støtte denne proces og få mere indsigt i, hvordan STORM arbejder vi præsenterer forberedelse af 3 prøveemner og metoden for at erhverve og behandling STORM billeder super-opløsning med typiske beslutninger af mellem 30-50 nm. Ved at kombinere de prøver med brug af de frit tilgængelige Rainstorm forarbejdning software er det muligt at opnå en hel del oplysninger om billedkvalitet og opløsning. Ved hjælp af disse målinger er det så muligt at optimere imagografiproceduren fra optikken, for prøveforberedelse, farvestof valg, bufferbetingelser og indstillinger billede erhvervelse. ViLSO viser eksempler på nogle almindelige problemer, der resulterer i dårlig billedkvalitet, såsom lateral afdrift, hvor prøven bevæger sig under erhvervelse og tæthed billede problemer resulterede i 'mislocalization' fænomen.
For nylig en række optiske mikroskopi teknikker er blevet udviklet, typisk kaldet super-opløsning mikroskopi eller Nanoscopy, der kan omgå diffraktionsgrænsen og generere billeder med opløsninger på 100 nm eller bedre 1,2. Siden annonceringen af super-opløsning mikroskopi som værende Nature Methods metode af året i 2008, har der været en stor udvikling af lokaliserings-baserede mikroskoper. For eksempel er der multi-farve applikationer 3-6, 3D implementeringer 7-12, og selv levende celle applikationer 5,13-17. Da disse systemer bliver kommercialiseret, og er nu på vej ud af optik laboratorier i hænderne på cellebiologer der sandsynligvis vil være en yderligere stigning i deres brug og anvendelse til biomedicinske spørgsmål.
En gren af denne familie er de lokaliserings-baserede metoder, der arbejder ved at opbygge et billede molekyle-by-molekyle. Jegn For at gøre dette, skal flertallet af de fluorescerende molekyler i prøven være slukket, så kun et par rumligt adskilte molekyler er aktive på én gang. Disse molekyler er derefter hurtigt tændes og slukkes, og mange billeder er taget, således at en betydelig del af befolkningen er afbildet for at afspejle den underliggende struktur med sub-diffraktion præcision. En række metoder er blevet offentliggjort, herunder GSDIM 18, PALM 19. fPALM 20 STORM 21 og RESOLFT 22.. Algoritmer, som måler positionen af et enkelt molekyle detektion kan derefter bruges til at lokalisere den faktiske position af molekylet med nøjagtigheder bedre end 20 nm under anvendelse af Gauss fitting 23, for eksempel rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26 palm3d 12 og regnvejr 27. Når billeddannelse celle eller andre biologiske prøver, som har en høj molekyle tæthed, er det derfor nødvendigt at tage mange tusinde rammer afdenne blinker, rumligt adskilt, signal for at billedet en betydelig andel af de mærkede molekyler.
Stokastisk optisk genopbygning mikroskopi (STORM) og stærkt relateret dSTORM og GSDIM metoder er lokaliserings-baseret super-opløsning metoder, som har vist sig at arbejde med kommercielt tilgængelige organiske farvestoffer 21. De har siden vist sig at være gældende for en række forskellige farvestoffer 28-30, hvilket gør metoden særlig attraktiv på grund af den specificitet og relative bekvemmelighed veletablerede immunolabeling tilgange til at udføre fluorescens mikroskopi. Følgelig er der nem adgang til en række farvestof-antistof-og farvestof-biomolekyle konjugater, som har potentialet til at blive anvendt i lokalisering baseret super-opløsning billeddannelse. Mens de generelle principper for storm og lignende fremgangsmåder er relativt enkel, og ved første øjekast hardware og prøveforberedelse synes relativt straightforward, er der en række trin i processen, der er afgørende for at opnå høj kvalitet, artifact-fri, billeder super-opløsning.
Som med alle mikroskopi teknikker processen kan opfattes i 3 vigtigste trin: først prøveforberedelse andet billede erhvervelse og for det tredje, billedbehandling og / eller billede analyse og fortolkning. Den ekstra opløsningsevne og metode til generering af billeder, super-opløsning ved hjælp af en lokalisering tilgang introducerer nogle nye problemer og overvejelser 31-33. Startende med prøveforberedelse, når der udføres immunolabeling, navnlig indirekte immunofluorescens, hvor en primær og sekundær antistof kombination anvendes, skal det bemærkes, at det fluorescerende farvestof kan være op til 20 nm fra molekylet af interesse. I tilfælde af mikrotubuli, resulterer dette i en diameter på 35-50 nm sammenlignet med en forventet mikrotubulus diameter på 25 nm 28,30. Desuden bør mærkningen tæthed mEET Nyquist kriterier for at generere et billede af høj kvalitet 14. For eksempel for en forventet billedopløsning på 20 nm langs en trådformede struktur bør der være et farvestof molekyle mindst hver 10 nm 27. Mens mange farvestoffer er blevet offentliggjort for at arbejde for lokalisering tilgange de samlede resultater af farvestoffet er en blanding af mindst fire vigtige kriterier, nemlig opdaget fotoner pr skift begivenhed (lysstyrken for hvert blink – lysere er bedre), ligevægten på -off duty cycle (kontrastforhold af farvestoffer i off versus på state – mere off er generelt bedre), fraktion overlevelse (en lav blegning sats er bedre), og antallet af koblingscyklusser (antallet af blink pr fluorophor – mere er bedre for høj opløsning, men 1 blink pr fluorofor kan være en fordel for molekyle optælling formål). Situationen kompliceres yderligere af det faktum, at disse egenskaber for en given farve kan variere i forskellige pufferbetingelser ogmed laser magt 28,29. Desuden, samt disse unikke STORM betragtninger billedkvalitet kan forbedres ved at optimere prøveforberedelse på samme måde som de mere traditionelle fluorescens mikroskopi teknikker for eksempel ved at minimere autofluorescens ved modifikation af fikseringen betingelser og anvendelse af quenching reagenser. Det er også vigtigt at minimere ikke-specifikt bundne fluoroforer, hvilket kan gøres ved at justere label koncentrationer, inkubationstider og blokerende og vasketrin.
Det andet trin i billedet Købet er også kritisk. De optimale indstillinger på mikroskopet, vil afhænge af farvestoffet, bufferbetingelser, mærkning tæthed og prøvetype, f.eks monolag på glas, celler eller vævsprøver. De vigtigste overvejelser er kamera eksponeringstid, stelnummer, indfaldsvinklen (TIRF, Hilo, Epi) og laser magt. Målet er at samle så mange lyse rumligt adskilte blinker så hurtigt som muligt. Hvis baggrunden is meget høje eller blinker ikke meget lyse, med andre ord det signal-til-støj-forholdet er dårlig, rekonstruktionsalgoritme vil ikke være i stand til at lokalisere de positioner, som præcist. Samt maksimere lokalisering præcision, dvs træfsikkerhed med hvert molekyle position kan måles billedkvalitet afhænger også af et stort antal lokaliseringer. Hvis der filmede et utilstrækkeligt antal molekyler af interesse enten på grund af dårlig mærkning effektivitet, overdreven fotoblegning eller en utilstrækkelig ramme nummer, så den resulterende super-opløsning vil være punktformet og diskontinuerlige som Nyquist kriterier ikke vil være opfyldt 14,27 .
Og endelig det tredje trin, billedbehandling, er særlig vigtig i forhold til standard fluorescens mikroskopi teknikker. Der er en vifte af frit og kommercielt tilgængelige algoritmer, hvilket både er en fordel i form af valg, og en ulempe, da det kan være forvirrende at vide which er mest hensigtsmæssigt at anvende. Hvis for eksempel de rå data er godt fordelte rumligt adskilte blinker derefter en enkelt molekyle montering algoritme kan være meget præcis og effektiv, for eksempel ved den sparsomme montering algoritmer til rådighed i regnvejr 27 rapidSTORM 24,25, palm3d 12 og QuickPALM 26 software . Hvis de rå data indeholder en masse overlappende signaler så algoritmer, som kan være mere passende omfatte DAOSTORM 34, 3B 35 og deconSTORM 36. Desuden er disse algoritmer indeholder tærskelværdier for forskellige kriterier såsom signal tæller, eller fotoner pr blink, samt forskellige billede display muligheder, såsom at visualisere med afrundede Gauss-funktioner eller som histogrammer med pixel gitre, hvor super-opløsning pixelstørrelse kan være vælges af brugeren. Alle disse muligheder ændre udseendet af det endelige billede og har konsekvenser for tolkning og analyse.
<p class="jove_content"Præsenterer vi> Derfor 3 prøveemner, som vil give den nye bruger med et udgangspunkt for farvestofbaseret lokaliserings-baseret super-opløsning eksperimenter, som for overskuelighedens skyld vil vi henvise til som STORM, og mere erfarne brugere mulighed for at yderligere at optimere deres eksperimenter. For det første er det muligt at coate overfladen af glas med et fluorescerende lag af dextran-dye konjugat. Det giver en hurtig og enkel måde at fastslå, at mikroskopet, farvestof og buffer arbejder på at generere blinkende fluorescerende signal. Metoden kan derefter udvides ved at sammenligne middelværdier lokalisering præcision og antal målinger genereret af Rainstorm at optimere buffer betingelser, indstillinger Image Acquisition og afprøve forskellige farvestoffer. For det andet, præsenterer vi en simpel protokol for at forberede actinfilamenter på glas, som let kan mærkes ved hjælp phalloidin-dye konjugater. Disse giver ideelle strukturer til at tage målinger af resolution 27 og typisk den fulde bredde halv maksimum (FWHM)af en glødetråd gives som en empirisk vurdering af resolution 37. Det skal bemærkes, at opløsning varierer mellem prøver og mellem billeder i den samme prøve, fordi opløsningen i lokalisering baseret super-opløsning mikroskopi er en funktion af fluorofor lysstyrke, baggrundsstøj og lokalisering densitet 27 og disse er ikke nødvendigvis konstant i hele prøven. Actin filamenter bruges til at demonstrere mulige artefakter såsom mislocalizations og drift, og hvordan de kan identificeres med software funktioner i regnvejr. Desuden beskriver vi brugen af fluorescerende referencemærker markører til både måle og korrekt drift. Og for det tredje, at farvningen af celler med epidermal vækstfaktor (EGF)-farvning af konjugater er beskrevet. Globaliseringsfonden yder en nyttig indikator for super-opløsning billedkvalitet, fordi en del af receptoren på celleoverfladen gennemgår endocytose via vesikler, der er sub-diffraktion mellemstore strukturer ca 50-150 nmeter i diameter 27,38,39.Vi viser med nogle enkle prøver og den frit tilgængelige behandling software Rainstorm er det muligt at optimere STORM super-opløsning billeddannelse. Disse værktøjer og metoder vil give nyttige udgangspunkter for nye brugere og måder for erfarne brugere at øge tilliden til deres mikroskoper og deres brug af dem til at studere biologiske og cellulære strukturer med hidtil usete detaljer. Ved hjælp af en kombination af prøver med kendte eller velforståede strukturer og en algoritme, der kan producere en række nyttige billedkvalitet målinger, såsom gennemsnitlige præcision skøn, lokalisering nummer og histogrammer viser det er muligt at forbedre billedkvaliteten og at have større tillid i STORM imaging proces. Der er ingen one-size fits all tilgang til erhvervelse af data, da der er en række forskellige kommercielle og selvbyggede mikroskop konfigurationer, der kan anvendes. Desuden er der mange Prøveforberedelse og Image Acquisition skridt, som kan få indflydelseENCE det endelige billede derfor have softwareværktøjer og prøver er afgørende for at forstå og optimere STORM billedkvalitet.
Derudover disse protokoller kan give nyttige og mindre tvetydige måder fejlfinding eventuelle problemer, der måtte opstå. For eksempel dextran prøve er en meget nyttig måde at identificere, hvis der er nogen laserstråle forskydning eller ujævn belysning af prøven. Hvis der er bekymring for, at skifte buffer kan ikke arbejder en meget simpel visuel test for at se om der er nogen "blinker" vil hjælpe. Actin filamenter er en nyttig måde at måle opløsning ved hjælp af FWHM sammenligninger samt fremhæve afdrift og mislocalization artefakter. Dog skal det bemærkes, at som lokaliserings-baseret super-opløsning metoder kan være fluorofore tæthed følsom trods af de andre medvirkende faktorer, såsom eksponeringstider, frame rates, laser beføjelser og den måde, billedet er behandlet, er det umuligt at tildele en beslutning til etsærligt mikroskop og antage, at alle billeder vil have denne resolution. Hvad der er muligt, er imidlertid at måle forskellige aspekter af opløsning, såsom gennemsnitlig localization præcisionsniveau lokalisering nummer og drive 27. Selv hvis Referencemærkernes markører ikke kan indarbejdes i hvert forsøg, de kan, i det mindste, anvendes til at karakterisere et mikroskop, dets miljø og bedre forstå driftsmæssige overvejelser såsom hvor meget tid der kræves for at nå termisk ligevægt efter opstart. Samt korrektion for lateral afdrift kan referencemærker markører anvendes til at karakterisere og korrigere for aksial afdrift, selv om dette kræver brug af et astigmatisk linse og en feedback-mekanisme til at korrigere prøven position, mens billederne bliver overtaget 43. Kommercielle super-opløsning systemer vil normalt omfatte en form for stabilitet kontrol eller fokus-låsemekanisme, som kan være en mere praktisk løsning til at korrigere fokus afdrift.
Der enre alternativer til ikke-specifikt at belægge glasset med dextran, såsom anvendelse af farvestoffer direkte eller andre konjugatmolekyler, såsom sekundære antistoffer. En begrænsning af disse metoder er, at antallet af molekyler, der er bundet til glas, som ikke er kendt. Alternative trådformede strukturer, der er blevet brugt omfatter mikrotubuli 28 og DNA 21. Men kombinationen af meget lille størrelse og praktiske kommercielt tilgængelige reagenser gøre actin et attraktivt alternativ, især da afstandskravet af divergerende eller forgrenede filamenter også kan være en nyttig måling af systemets ydeevne 27..
Der er plads til yderligere udvikling af prøver, på trods af de seneste fremskridt på dette område 28,29,46,47. Især multi-farve imaging præsenterer en række udfordringer i alle 3 vigtigste aspekter af billedbehandling, prøve mærkning Image Acquisition (hardware) og software (billedbehandling og justering). Der har en væreten række publikationer vedrørende disse aspekter 4-6, og det er derfor klart, at relevante prøver og metoder er afgørende for at skabe og pålideligt fortolkningen af disse typer af billeder. Faktisk, for nylig blev det vist, at dSTORM kunne bruges til at tage to farvebilleder af og løse, den meget symmetrisk karakter af det nukleare kompleks pore og forfatterne foreslog, at dette ville være en ideel måde at vurdere resultaterne af kromatisk aberration korrektioner 45. En anden interessant tilgang er brugen af DNA-origami til at skabe en nanoruler, som skaber mulighed for positionering fluorophores ved specifikke sub-diffraktion afstande fra hinanden 46. Dette giver en måde at vurdere opløsning og gøre distance. Det endelige mål er dog at anvende disse super-opløsning teknikker til ikke-idealiserede prøver, såsom celler, som er komplekse tredimensionelle strukturer. I dette tilfælde, en kombination af mere grundig forståelse af tHan teknik kombineret med softwareværktøjer, at støtte brugeren i at erhverve data, behandling, det på passende måder, og give billedet målinger vil sandsynligvis være det ultimative svar. 28,29,47,48
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender finansiering fra kemiske og biologiske Metrologi program af den britiske National Measurement kontor. Vi takker Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi og Eric Rees for teknisk råd og forslag. Vi takker Miklos Erdelyi, Eric Rees og Max Ryadnov for nyttige kommentarer og diskussioner om dette manuskript.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
*Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
Table 1. Materials & Equipment | |||
[header] | |||
PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
EGF – Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
Formaldehyde – 10% solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
Table 2. Reagents |