हम तीन नमूने परीक्षण की तैयारी और कैसे वे अनुकूलन और तूफान सूक्ष्मदर्शी के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन. इन उदाहरणों का प्रयोग हम कच्चे डेटा हासिल करने और फिर लगभग 30-50 एनएम संकल्प की कोशिकाओं में सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए यह प्रक्रिया करने के लिए दिखा.
तूफान मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक से करने के लिए 10 गुना बेहतर संकल्प के साथ एक हाल ही में विकसित सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक है. छवि एक छवि अणु दर अणु को इमारत से सामान्य की तुलना में एक बहुत अलग तरह से प्राप्त कर लिया है लेकिन, जैसा कि उनकी छवि अधिग्रहण का अनुकूलन करने की कोशिश में उपयोगकर्ताओं के लिए कुछ महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं. इस प्रक्रिया में सहायता और तूफान हम 3 नमूने परीक्षण की तैयारी और 30-50 एनएम के बीच के विशिष्ट प्रस्तावों के साथ सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने और प्रसंस्करण तूफान की कार्यप्रणाली पेश कैसे काम करता है में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए. आज़ादी से उपलब्ध आंधी प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ परीक्षण के नमूने के संयोजन से यह छवि गुणवत्ता और संकल्प के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्राप्त करने के लिए संभव है. इन मीट्रिक का उपयोग करके यह तैयारी, डाई चुनाव, बफर की स्थिति, और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स नमूने के लिए, प्रकाशिकी से इमेजिंग प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए तो संभव है. हम एकऐसी छवि अधिग्रहण और घनत्व के दौरान नमूना चाल 'mislocalization' घटना में उत्पन्न समस्याओं से संबंधित जहां पार्श्व बहाव के रूप में गरीब छवि गुणवत्ता में परिणाम है कि कुछ सामान्य समस्याओं का lso शो उदाहरण हैं.
हाल ही में ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक की एक सीमा आमतौर पर विवर्तन सीमा बाईपास और 100 एनएम या 1,2 बेहतर के संकल्प के साथ छवियों को उत्पन्न कर सकते हैं जो सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी या nanoscopy, के रूप में भेजा, विकसित किया गया है. 2008 में वर्ष की प्रकृति के तरीके पद्धति होने के रूप में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की घोषणा के बाद से, स्थानीयकरण आधारित सूक्ष्मदर्शी के विकास का एक बड़ा सौदा किया गया है. उदाहरण के लिए, बहु रंग अनुप्रयोगों 3-6, 3 डी implementations 7-12, और यहां तक कि सेल रहते अनुप्रयोगों 5,13-17 कर रहे हैं. इन प्रणालियों सेल जीव के हाथों में प्रकाशिकी प्रयोगशालाओं से बाहर का वाणिज्यीकरण किया जा रहा है और अब अपनी राह बना रहे हैं इसके अलावा, जैव चिकित्सा सवाल उनके उपयोग और आवेदन में एक और वृद्धि होने की संभावना है.
इस परिवार की एक शाखा एक छवि अणु दर अणु को इमारत से काम जो स्थानीयकरण आधारित विधियों है. मैंकेवल कुछ स्थानिक से पृथक अणुओं किसी एक समय में सक्रिय हैं तो ऐसा करने के लिए n आदेश, नमूना के भीतर फ्लोरोसेंट अणु के बहुमत बंद किया जाना चाहिए. इन अणुओं फिर तेजी पर और बंद कर रहे हैं और आबादी का एक महत्वपूर्ण हिस्सा उप विवर्तन परिशुद्धता के साथ आधारभूत संरचना को प्रतिबिम्बित करने के लिए imaged है कि इतने सारे छवियों ले रहे हैं. दृष्टिकोण की संख्या GSDIM 18, पाम 19, fPALM 20, तूफान 21 और RESOLFT 22 सहित प्रकाशित किया गया है. एक अणु का पता लगाने की स्थिति को मापने के एल्गोरिदम कि तो उदाहरण के लिए rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 palm3d और आंधी 27, गाऊसी फिटिंग 23 का उपयोग करते हुए 20 एनएम से बेहतर precisions साथ अणु की वास्तविक स्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल या एक उच्च अणु घनत्व है जो अन्य जैविक नमूने, जब इमेजिंग, यह फ्रेम के हजारों के कई लेने के लिए इसलिए जरूरी हैयह spatially अलग, निमिष छवि के क्रम लेबल अणुओं का एक महत्वपूर्ण अनुपात में संकेत.
Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) और अत्यधिक संबंधित dSTORM और GSDIM तरीकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों जैविक 21 के साथ काम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है जो स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प तरीकों, कर रहे हैं. वे के बाद से क्योंकि विशिष्टता और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित immunolabeling दृष्टिकोण के सापेक्ष सुविधा की कार्यप्रणाली विशेष रूप से आकर्षक बना देता है जो विभिन्न रंगों की एक संख्या 28-30 पर लागू होना दिखाया गया है. नतीजतन, स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प इमेजिंग में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है जो डाई एंटीबॉडी और डाई बायोमोलिक्यूल conjugates, की एक श्रृंखला के लिए आसान पहुँच उपलब्ध है. तूफान और समान दृष्टिकोण के सामान्य सिद्धांतों अपेक्षाकृत सरल हैं, और पहली नजर में हार्डवेयर और नमूना तैयार अपेक्षाकृत रणनीति लगते Whilstightforward, उच्च गुणवत्ता, artifact मुक्त, सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो इस प्रक्रिया में कदम की एक संख्या हैं.
सभी माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ के रूप प्रक्रिया 3 मुख्य चरण में सोचा जा सकता है: पहला, दूसरा नमूना तैयार करने, छवि अधिग्रहण और, तीसरे, छवि प्रसंस्करण और / या छवि विश्लेषण और व्याख्या. अतिरिक्त बिजली को हल करने और एक स्थानीयकरण आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर सुपर संकल्प छवियों पैदा करने की विधि कुछ नई समस्याओं और विचारों 31-33 परिचय. Immunolabeling, एक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी संयोजन इस्तेमाल किया जाता है, जहां विशेष रूप से अप्रत्यक्ष immunofluorescence जब प्रदर्शन नमूना तैयार करने के साथ शुरू, यह फ्लोरोसेंट डाई दूर ब्याज के अणु से ऊपर 20 एनएम के लिए हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. सूक्ष्मनलिकाएं के मामले में, यह 25 एनएम 28,30 की एक उम्मीद microtubule व्यास के साथ तुलना में 35-50 एनएम के व्यास में यह परिणाम है. इसके अलावा, लेबलिंग घनत्व चाहिए एमएक उच्च गुणवत्ता छवि 14 उत्पन्न करने के क्रम में Nyquist मापदंड EET. एक filamentous संरचना के साथ 20 एनएम की एक अनुमानित छवि संकल्प के लिए उदाहरण के लिए कम से कम हर 10 एनएम 27 एक डाई अणु होना चाहिए. , पर संतुलन – कई रंगों स्थानीयकरण आधारित डाई के समग्र प्रदर्शन में कम से कम चार महत्वपूर्ण मापदंड, घटना स्विचन प्रति अर्थात् पता चला फोटॉनों (उज्जवल बेहतर है प्रत्येक झपकी की चमक) का मिश्रण है दृष्टिकोण के लिए काम करने के लिए प्रकाशित किया गया है, जबकि बंद कर्तव्य चक्र (राज्य पर बनाम बंद में रंगों के विपरीत अनुपात – बंद अधिक आम तौर पर बेहतर है), अस्तित्व अंश (एक कम विरंजन दर बेहतर है) और चक्र स्विचन की संख्या (फ्लोरोफोरे प्रति झपकाए की संख्या – अधिक फ्लोरोफोरे प्रति 1 झपकी) अणु गिनती प्रयोजनों के लिए एक लाभ हो सकता है, उच्च संकल्प के लिए बेहतर है. स्थिति आगे किसी भी डाई के लिए इन गुणों अलग बफर की स्थिति में भिन्नता है और कर सकते हैं कि इस तथ्य से जटिल हैलेजर शक्ति 28,29 साथ. इसके अलावा, के रूप में अच्छी तरह से इन अद्वितीय तूफान विचार के रूप में, छवि गुणवत्ता निर्धारण शर्तों के संशोधन और शमन अभिकर्मकों के उपयोग से autofluorescence कम करके उदाहरण के लिए अधिक पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक के रूप में एक ही रास्ते में नमूना तैयार करने के अनुकूलन के द्वारा सुधार किया जा सकता है. इसके अलावा, गैर विशेष रूप से बाध्य fluorophores को न्यूनतम लेबल सांद्रता, ऊष्मायन बार और अवरुद्ध और धोने कदम का समायोजन करके किया जा सकता है, जो महत्वपूर्ण है.
छवि अधिग्रहण के दूसरे चरण के लिए भी महत्वपूर्ण है. माइक्रोस्कोप पर इष्टतम सेटिंग्स डाई, बफर की स्थिति, लेबलिंग घनत्व, और नमूना प्रकार, कांच, कोशिकाओं या ऊतकों के नमूनों पर जैसे monolayers पर निर्भर करेगा. मुख्य कारणों कैमरा जोखिम समय, फ्रेम संख्या, रोशनी कोण (TIRF, हिलो, महामारी) और लेजर शक्ति हैं. लक्ष्य के रूप में जल्दी संभव के रूप में कई उज्ज्वल spatially अलग झपकाए जमा है. यदि पृष्ठभूमि मैंपुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म के रूप में सही रूप में पदों के स्थानीयकरण करने में सक्षम नहीं होगा, बहुत अधिक है या झपकाए, बहुत उज्जवल नहीं कर रहे हैं, दूसरे शब्दों में संकेत करने वाली शोर अनुपात गरीब है. के रूप में अच्छी तरह से मापा जा सकता है कि प्रत्येक अणु की स्थिति के साथ सटीकता यानी, स्थानीयकरण परिशुद्धता अधिकतम के रूप में, छवि गुणवत्ता भी localizations के एक उच्च संख्या पर निर्भर करता है. ब्याज के अणुओं की संख्या अपर्याप्त है imaged रहे हैं Nyquist मापदंड 14,27 मिले किया गया है नहीं होगा, या तो कारण गरीब लेबलिंग दक्षता, अत्यधिक photobleaching या एक अपर्याप्त फ्रेम नंबर करने के लिए, तो जिसके परिणामस्वरूप सुपर संकल्प छवि कबरा और टूटनेवाला हो जाएगा .
और अंत में, तीसरे चरण के लिए, इमेज प्रोसेसिंग, मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ तुलना में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यह डब्ल्यू पता करने के लिए भ्रमित किया जा सकता है कि में चुनाव के संदर्भ में एक फायदा है, और एक नुकसान यह है कि दोनों ही है जो स्वतंत्र रूप से और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एल्गोरिदम, की एक श्रृंखला हैhich उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त है. उदाहरण के लिए कच्चे डेटा स्थानिक अलग झपकाए अच्छी तरह से स्थान दिया गया है तो एक एकल अणु ढाले एल्गोरिथ्म आंधी 27 में उपलब्ध विरल फिटिंग एल्गोरिदम द्वारा उदाहरण के लिए, बेहद सटीक और कुशल हो सकता है, rapidSTORM 24,25, QuickPALM 26 सॉफ्टवेयर 12 palm3d और . कच्चे डेटा तो अधिक उपयुक्त हो सकता है जो एल्गोरिदम संकेतों अतिव्यापी का एक बहुत कुछ होता है DAOSTORM 34, 3 बी 35 और deconSTORM 36 में शामिल हैं. इसके अलावा, इन एल्गोरिदम ऐसे संकेत मायने रखता है, या झपकी प्रति फोटॉनों, साथ ही इस तरह के smoothed गाऊसी कार्यों के साथ visualizing के रूप में या सुपर संकल्प पिक्सेल आकार के हो सकते हैं, जहां पिक्सेल ग्रिड, साथ हिस्टोग्राम के रूप में विभिन्न अलग छवि प्रदर्शन विकल्प के रूप में विभिन्न मानदंडों के लिए थ्रेसहोल्ड होते उपयोगकर्ता द्वारा चयनित. इन विकल्पों में से सभी अंतिम छवि के स्वरूप को बदल और छवि व्याख्या और विश्लेषण के लिए निहितार्थ हैं.
<p class="jove_content"> इसलिए, हम स्पष्टता की खातिर हम तूफान के रूप में करने के लिए संदर्भित करेंगे जो डाई आधारित स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प प्रयोगों, और अधिक अनुभवी उपयोगकर्ताओं के अवसर के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के साथ नए उपयोगकर्ता प्रदान करेगा जो 3 परीक्षण के नमूने पेश आगे उनके प्रयोगों का अनुकूलन. सबसे पहले, यह कोट करने के लिए dextran डाई संयुग्म के एक फ्लोरोसेंट परत के साथ कांच की सतह संभव है. इस माइक्रोस्कोप, डाई और बफर फ्लोरोसेंट संकेत निमिष उत्पन्न करने के लिए काम कर रहे हैं स्थापित करने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है. विधि तो, बफर स्थिति अनुकूलन छवि अधिग्रहण सेटिंग्स और विभिन्न रंगों का परीक्षण करने के लिए आंधी से उत्पन्न मतलब स्थानीयकरण परिशुद्धता और संख्या मेट्रिक्स तुलना करके बढ़ाया जा सकता है. दूसरा, हम आसानी से phalloidin डाई conjugates का उपयोग लेबल किया जा सकता है, जो कांच पर actin filaments तैयार करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे. ये संकल्प 27 और आम तौर पर पूरी चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) का माप लेने के लिए आदर्श संरचना प्रदानका एक रेशा संकल्प 37 के एक अनुभवजन्य अनुमान के रूप में दिया जाता है. यह स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में संकल्प फ्लोरोफोरे चमक, पृष्ठभूमि शोर और स्थानीयकरण घनत्व 27 के एक समारोह है और इन नमूना भर जरूरी स्थिर नहीं कर रहे हैं क्योंकि संकल्प नमूनों के बीच और एक ही नमूना भीतर छवियों के बीच होती है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. Actin filaments ऐसे mislocalizations के रूप में संभावित कलाकृतियों का प्रदर्शन और बहाव के लिए इस्तेमाल किया और वे आंधी के भीतर सॉफ्टवेयर सुविधाओं के साथ पहचाना जा सकता है कि कैसे कर रहे हैं. इसके अलावा, हम उपाय और सही बहाव दोनों को फ्लोरोसेंट मापकला मार्कर के उपयोग का वर्णन. और तीसरे, epidermal वृद्धि कारक (EGF) डाई conjugates के साथ कोशिकाओं के धुंधला हो जाना बताया गया है. कोशिका की सतह पर रिसेप्टर के अनुपात लगभग 50-150 n के उप विवर्तन आकार की संरचनाओं हैं जो vesicles, के माध्यम से endocytosis से होकर गुजरती है, क्योंकि EGF, सुपर संकल्प छवि के प्रदर्शन का एक उपयोगी सूचक प्रदान करता हैव्यास 27,38,39 में एम.हम कुछ सरल परीक्षण के नमूने और यह तूफान सुपर संकल्प इमेजिंग अनुकूलन करने के लिए संभव है आज़ादी से उपलब्ध संसाधन सॉफ्टवेयर आंधी के साथ दिखा. इन उपकरणों और तरीकों नए उपयोगकर्ताओं और उनके सूक्ष्मदर्शी में आत्मविश्वास और अभूतपूर्व विस्तार के साथ जैविक और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए उनमें से उनके उपयोग को बढ़ाने के लिए अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए तरीके के लिए उपयोगी शुरू अंक प्रदान करेगा. यह छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए और अधिक आत्मविश्वास के लिए संभव है दिखा ऐसी सटीक मतलब अनुमान है, स्थानीयकरण संख्या और हिस्टोग्राम के रूप में उपयोगी छवि गुणवत्ता मैट्रिक्स के एक नंबर, उत्पादन कर सकते हैं कि जाना जाता है या अच्छी तरह से समझ संरचनाओं और एक एल्गोरिथ्म के साथ नमूनों का एक संयोजन का उपयोग करके तूफान इमेजिंग प्रक्रिया में. कोई एक आकार इस्तेमाल किया जा सकता है कि विभिन्न व्यावसायिक और स्वयं बनाया खुर्दबीन विन्यास की एक संख्या के रूप में वहाँ डेटा प्राप्त करने के लिए सभी दृष्टिकोण फिट बैठता है. इसके अलावा, प्रभावित कर सकते हैं जो कई नमूना तैयार करने और छवि अधिग्रहण कदम उठाए हैंअंतिम छवि इसलिए सॉफ्टवेयर उपकरणों और परीक्षण के नमूने होने समझ और तूफान छवि गुणवत्ता के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण है खिलाडि़यों.
इसके अलावा इन प्रोटोकॉल उत्पन्न हो सकती है कि किसी भी समस्याओं के निवारण के लिए उपयोगी और कम अस्पष्ट तरीके प्रदान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए dextran नमूना किसी भी लेजर बीम misalignment या नमूना के असमान रोशनी अगर वहाँ की पहचान करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी तरीका है. स्विचिंग बफर किसी भी 'पलक' मदद मिलेगी अगर वहाँ देखने के लिए एक बहुत ही साधारण दृश्य परीक्षण काम नहीं किया जा सकता है कि वहाँ चिंता कर रहे हैं. Actin filaments FWHM का उपयोग तुलना के साथ ही बहाव और mislocalization कलाकृतियों को उजागर करने के संकल्प को मापने का एक उपयोगी तरीका है. हालांकि, यह स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प तरीके के रूप में इस तरह के जोखिम बार, फ्रेम दर, लेजर शक्तियों और छवि संसाधित किया जाता है जिस तरह के रूप में अन्य कारकों का योगदान, के बावजूद, संवेदनशील fluorophore घनत्व हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, यह निर्दिष्ट करने के लिए असंभव है एक के लिए एक संकल्पविशेष माइक्रोस्कोप और सभी छवियों कि संकल्प होगा कि मान. क्या संभव है, हालांकि, इस तरह के मतलब स्थानीयकरण precisions, स्थानीयकरण संख्या के रूप में संकल्प के विभिन्न पहलुओं को मापने के लिए और 27 बहाव है. विश्वस्त मार्करों वे कर सकते हैं हर प्रयोग में शामिल नहीं किया जा सकता है, भले ही कम से कम, एक माइक्रोस्कोप प्रणाली, अपने पर्यावरण विशेषताएँ और बेहतर इस तरह के बहुत समय बाद शुरू थर्मल संतुलन तक पहुँचने के लिए आवश्यक है कि कैसे के रूप में परिचालन कारणों को समझने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. इस चित्र 43 का अधिग्रहण किया जा रहा है whilst नमूना स्थिति सही करने के लिए एक विदृष्टिक लेंस का इस्तेमाल करते हैं और एक प्रतिक्रिया तंत्र की आवश्यकता है के रूप में अच्छी तरह से पार्श्व बहाव के लिए संशोधन के रूप में, मापकला मार्करों, विशेषताएँ इस्तेमाल किया और अक्षीय बहाव के लिए सही किया जा सकता है. वाणिज्यिक सुपर संकल्प प्रणालियों आमतौर पर स्थिरता नियंत्रण या ध्यान की दिशा सही करने के लिए एक अधिक व्यावहारिक समाधान हो सकता है जो ध्यान केंद्रित ताला तंत्र, किसी प्रकार का शामिल होंगे.
वहाँ एकगैर विशेष रूप से इस तरह के रंगों सीधे या ऐसे माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में अन्य संयुग्म अणुओं का उपयोग कर के रूप में dextran, साथ ग्लास कोटिंग के लिए विकल्प फिर से. इन तरीकों की एक सीमा है कि कांच के लिए बाध्य अणुओं की संख्या ज्ञात नहीं है कि है. इस्तेमाल किया गया है कि वैकल्पिक filamentous संरचनाओं सूक्ष्मनलिकाएं 28 और डीएनए 21 में शामिल हैं. हालांकि, बहुत छोटे आकार और सुविधाजनक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों के संयोजन अपसारी या branched तंतुओं की जुदाई दूरी भी प्रणाली प्रदर्शन 27 का एक उपयोगी माप किया जा सकता है, खासकर के रूप में एक आकर्षक विकल्प actin बनाते हैं.
परीक्षण के नमूने के आगे विकास के लिए कमरे में इस क्षेत्र 28,29,46,47 में हाल की प्रगति के बावजूद, वहाँ है. विशेष रूप से, बहु रंग इमेजिंग एक इमेजिंग के सभी 3 मुख्य पहलुओं में चुनौतियों की संख्या, नमूना लेबलिंग, छवि अधिग्रहण (हार्डवेयर), और सॉफ्टवेयर (इमेज प्रोसेसिंग और संरेखण) प्रस्तुत करता है. एक कर दिया गया हैप्रकाशनों इन पहलुओं 4-6 संबोधित कर रहे हैं और यह उचित परीक्षण के नमूने और तरीकों छवियों के इन प्रकार के सृजन और मज़बूती से व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि इसलिए स्पष्ट है की एक संख्या. दरअसल, हाल ही में यह dSTORM के दो रंग के चित्र लेने, और हल, परमाणु ताकना परिसर के अत्यधिक सममित प्रकृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और लेखकों के लिए इस रंगीन विपथन सुधार 45 के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक आदर्श तरीका होगा कि सुझाव दिया है कि दिखाया गया था. एक और दिलचस्प दृष्टिकोण के अलावा 46 विशिष्ट उप विवर्तन दूरी पर स्थिति fluorophores की संभावना बनाता है जो एक nanoruler, बनाने के लिए डीएनए origami का इस्तेमाल होता है. इस संकल्प का आकलन करने और दूरी माप बनाने का एक तरीका प्रदान करता है. हालांकि, अंतिम लक्ष्य जटिल तीन आयामी संरचना हैं जो इस तरह की कोशिकाओं के रूप में गैर idealized नमूने, के लिए इन सुपर संकल्प तकनीक लागू करने के लिए है. इस मामले में, टी के और अधिक पूरी तरह से समझ का एक संयोजनवह डेटा प्राप्त उचित तरीके से यह प्रसंस्करण, और छवि मेट्रिक्स प्रदान करने में उपयोगकर्ता सहायता सॉफ्टवेयर है कि उपकरणों के साथ संयुक्त तकनीक अंतिम जवाब होने की संभावना है. 28,29,47,48
The authors have nothing to disclose.
हम ब्रिटेन की राष्ट्रीय मापन कार्यालय के रासायनिक और जैविक मैट्रोलोजी कार्यक्रम से धन स्वीकार करते हैं. हम तकनीकी सलाह और सुझाव के लिए सेबस्टियन वैन डे लिंडे, मिक्लोस Erdélyi और एरिक रीस धन्यवाद. हम उपयोगी टिप्पणी और इस पांडुलिपि पर विचार विमर्श के लिए मिक्लोस Erdélyi, एरिक रीस और अधिकतम Ryadnov धन्यवाद.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
*Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
Table 1. Materials & Equipment | |||
[header] | |||
PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
EGF – Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
Formaldehyde – 10% solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
Table 2. Reagents |