Summary
我々は3つの試験試料の調製及びそれらがどのように最適化し、STORM顕微鏡の性能を評価するために用いることができるが記載されている。これらの実施例を用いて、我々は、生データを取得し、次いで約30〜50 nmの分解能の細胞において、超解像画像を取得するためにそれを処理する方法を示す。
Abstract
嵐は標準的な蛍光顕微鏡技術よりも最大で10倍の分解能で最近開発された超解像顕微鏡技術です。しかし、画像は通常よりも非常に異なる方法で取得されるように、分子による分子画像を構築することにより、それらの画像取得を最適化しようとするユーザーのためのいくつかの重要な課題が存在する。このプロセスを支援し、嵐が、我々は3つの試験試料の調製とNM 30〜50の間の典型的な解像度で超解像画像を取得し、処理嵐の方法論を提示する仕組みを、より深い理解を得るために。無料公開暴風雨処理ソフトウェアを用いて、試験サンプルを組み合わせることにより、画質と解像度についての情報を大量に得ることができる。これらの指標を用いることで、調製、染料の選択、緩衝液条件、及び画像取得設定をサンプリングするために、光学系から撮像手順を最適化することが可能である。我々このような横方向のドリフト、「誤った局在」現象が、その結果、画像取得および密度に関連する問題中の試料の移動に伴って低画質になり、いくつかの一般的な問題のLSOの例を示している。
Introduction
最近、光学顕微鏡技術の範囲は、典型的には、回折限界をバイパスし、100nm以下の1,2の良好な解像度を有する画像を生成することができる超解像顕微鏡またはナノスと呼ばれる、開発されている。 2008年のネイチャーメソッドメソッドであるとして超解像顕微鏡の発表以来、ローカリゼーションに基づく顕微鏡の開発に多大があった。例えば、マルチカラー用途3-6、3Dの実装7-12、さらに生細胞アプリケーション5,13-17がある。さらに、これらのシステムとして商品化されて、現在は生物医学の質問に、それらの使用およびアプリケーションのさらなる増加がありそうである細胞生物学者の手に光学研究室の外に自分の道を作っている。
このファミリーの一つの分岐は、画像分子ごとの分子を構築することにより動作するローカライズに基づいた方法である。私少数の空間的に分離された分子が一度にアクティブになるようにこれを行うには、n個の順序は、試料内の蛍光分子の大部分はオフにされなければならない。これらの分子は、その後急速にオンとオフを切り替えられ、人口のかなりの部分は、サブ回折精度で基本的な構造を反映して画像化されるように、多くの画像が取得されます。多くのアプローチがGSDIM 18パーム19、fPALM 20嵐21とRESOLFT 22を含め公表されている。単一分子検出の位置を測定するアルゴリズムは、次いで、例えばrapidSTORM 24,25 QuickPALM 26は、12 palm3d及び暴風雨27ガウスフィッティング23を用いて、20 nmより良好な精度で分子の実際の位置を特定するために使用することができる。細胞または高い分子密度を有する他の生物学的試料を撮像するときには、フレームの何千を取ることが必要であるこの点滅、空間的に分離され、信号の画像標識分子のかなりの割合するためである。
確率的光学再構築顕微鏡法（STORM）と高度に関連dSTORMとGSDIM方法は、市販の有機色素21を操作することが実証されている局在型超解像方式である。それらは、十分に確立されたので免疫標識の特異性および相対的な利便性の蛍光顕微鏡を実行するために接近するための方法論としては、特に魅力的な異なる色素の数28-30、に適用可能であることが示されている。その結果、局在型超解像イメージングに使用される可能性を有する色素 - 抗体および色素生体分子コンジュゲートの範囲への容易なアクセスがあった。 STORMと同様のアプローチの一般的な原則は、比較的簡単であり、一目で、ハードウェアとサンプル調製は比較的STRA思えるながらightforward、高品質、アーチファクトのない、超解像を実現するために不可欠なプロセスのステップがいくつかあります。
すべての顕微鏡技術と同様に、プロセスは、主に3つのステップであると考えることができる：第一、第二試料調製、画像取得と、第三の、画像処理および/または画像解析および解釈。局在ベースのアプローチを使用して超解像画像を生成する追加の解像力及び方法は、いくつかの新たな問題および考慮事項31-33を導入する。免疫標識は、一次及び二次抗体の組み合わせが使用され、特に間接免疫蛍光を行う際に試料調製から出発し、それは蛍光色素が離れて、目的の分子から最大20nmであってもよいことに留意すべきである。微小管の場合、これは、25ナノメートル28,30の予想される微小管の直径に比べて35〜50ナノメートルの直径をもたらす。また、標識密度べきメートル高品質な画像14を生成するためにナイキスト基準をEET。糸状構造に沿っ20nmの予想される画像の解像度については、例えば、少なくとも10nm毎27色素分子があるはずです。 、上の平衡 - 多くの染料は、ローカライズ系色素の全体的なパフォーマンスは、少なくとも4つの重要な基準は、イベントを切り替えるごとに、すなわち検出された光子（明るい方がよい各まばたきの明るさ）が混在しているアプローチのための仕事を出版されている一方でオフデューティ·サイクル（オフ状態での対中の染料のコントラスト比 - オフよりは一般的に優れている）、生存率（低脱色率が優れている）と、スイッチングサイクルの数（蛍光団ごとの点滅の数 - 詳細蛍光団ごとに1回点滅）は、分子の計数のために優位することができますが、高解像度のためのより良いです。状況はさらに、任意の所与の色素のためのこれらの特性は、異なる緩衝液条件で変化し得るという事実によって複雑になるレーザパワー28,29と。さらに、ならびにこれらのユニークなSTORMの考慮、画質が固定条件と消光試薬の使用の改変により自己蛍光を最小化することによって、例えば、より伝統的な蛍光顕微鏡法と同様にして試料調製を最適化することによって改善することができる。また、非特異的に結合したフルオロフォアを最小化するラベル濃度、インキュベーション時間、ブロッキングおよび洗浄工程を調整することによって行うことができ、これは重要である。
画像取得の第二段階は、非常に重要です。顕微鏡上の最適な設定は、染料、緩衝液条件、標識密度、およびサンプルタイプ、ガラス、細胞または組織サンプル上で、例えば単層に依存するであろう。主な考慮事項は、カメラ露出時間、フレーム番号、照明角度（TIRF、HILO、エピ）及びレーザーパワーである。目的は、可能な限り迅速な限り多くの明るい空間的に分離された点滅を収集することである。もし背景I再構成アルゴリズムは、正確な位置をローカライズすることができなくなり、非常に高いのか点滅し、非常に明るくはない、換言すれば、信号対雑音比が悪い。ならびに定位の精度を最大化する、各分子の位置に精度を測定することができる、すなわち 、画質もローカライゼーションの高い数に依存する。目的の分子の数が不足が画像化されている場合は、どちらかが悪い標識効率のために、過度の光退色または不適切なフレーム番号、ナイキスト基準が14,27の満たされてないので、結果の超解像画像は、点状かつ不連続になります。
そして最後に、第3の工程と、画像処理が、標準的な蛍光顕微鏡技術と比較して特に重要である。それはワット知って混乱することができるという選択肢の面で利点、および欠点でもあり、自由に、商業的に利用可能なアルゴリズムの範囲が、、ありますHICHは使用するのが最も適切である。例えば、生データが適切に間隔をあけ空間的に別個の点滅がある場合は、単一分子フィッティングアルゴリズムは暴風雨27、rapidSTORM 24,25で利用可能なスパースフィッティングアルゴリズムによって、たとえば、高精度かつ効率的にすることができ、12とQuickPALM 26ソフトウェアをpalm3d 。生データ信号をオーバーラップが多く含まれている場合は、より適切であるかもしれないアルゴリズムがDAOSTORM 34、図3（b）35とdeconSTORM 36が含まれています。さらに、これらのアルゴリズムは、超解像の画素サイズがあり得るような信号数、または点滅当たりの光子、並びにそのような平滑化ガウス関数、またはピクセルグリッドのヒストグラムとして可視化するような様々な異なる画像の表示オプションとして、様々な基準のしきい値を含有するユーザによって選択された。これらのオプションはすべて、最終的なイメージの外観を変更し、読影と分析のための意味を持っている。
27の測定値を取ると、通常の半値全幅（FWHM）のに理想的な構造を提供するフィラメントの決議37の経験的な推定値として与えられている。これは、局在型超解像顕微鏡の解像度がフルオロフォアの明るさ、背景雑音および局在密度27の関数であり、これらは、試料全体にわたって必ずしも一定ではないので、解像度がサンプル間で、同一試料内の画像の間で変化することに留意すべきである。アクチンフィラメントは、mislocalizationsとドリフトとどのように暴風雨の中のソフトウェア機能と同一視されるように潜在的な成果物を示すために使用されている。また、我々は、メジャー、正しいドリフトの両方に蛍光基準マーカの使用を記載している。第三に、上皮成長因子（EGF） - 色素複合体を用いた細胞の染色は記載されている。細胞表面での受容体の割合は約50〜150 nは、サブ回折サイズの構造である小胞を介してエンドサイトーシスを受けるため、EGFは、超解像性能の有用な指標を提供する直径27,38,39中のm。
Protocol
注意：このプロトコルを通じて、ヒントや提案は、特定の手順に従って発見された。記号「* 1」というように（注1）は、この特定のステップに関連していることを示し、。
1。ガラスの蛍光デキストランコーティング
- 8室カバーガラスの各ウェルに0.01％のポリ-L-リジン溶液200μlを加え、10分間インキュベートする。いいえ、残りの液体であることを保証するためにピペットで除去します。
- 2 mg / mlのストック溶液を作成するために、製造業者の指示に従ってデキストラン-アレクサ647 * 1を再構成。このことから、20μg/ mlのソリューションを作成するために脱イオン水25μLに0.25μLを希釈。
- デキストランアレクサ647ソリューションの高密度コーティングを作成するには、脱イオン水200μLの合計に20μg/ mlの溶液20μlを希釈。中密度ソリューションでは、脱イオン水（元の保存溶液からの1:10,000希釈）200μl中2μlを希釈する。低用密度溶液は脱イオン水200μL（元原液から1:100,000希釈）で0.2μLを希釈。
- 各ウェルに希釈したデキストラン - アレクサ647ソリューションを200μlを加え、10分間インキュベートする。より長いインキュベーション時間は、より高密度のデキストランコーティングをもたらし得る用いることができる。 3回を削除し、H 2 Oで洗浄* 2
注1：その他のデキストラン-色素複合体を使用することができる。非結合体化デキストランは、所望の組み合わせが市販されていない場合は色素にコンジュゲートすることができる。
注2：蛍光の均一性が低下するおそれがあるが、同じデキストランチャンバは、数週間の期間にわたって再イメージ化することができる。どのバッファがない場合の4℃で保管することをお勧めします。
2。ガラス上に蛍光アクチンフィラメント
- チャンバーの各ウェルに0.01％のポリ-L-リジン溶液200μlを加え、* 3 10分間インキュベートする。リ液体が残存されていないことを保証するためにピペットで移動する。
- 各チャンバーに、一般的なアクチンバッファ（メーカーの指示に従って再構成された）の90を添加する。 （メーカーの指示に従って、メタノール1.5ミリリットルに溶解した場合に0.2単位）、アクチンフィラメント液と1μlのファロイジン-アレクサ647を予め形成し、10μMの10μLを加え、穏やかにピペットミックスダウンする。 * 4 30分間インキュベートします。
注3：ポリ-L-リジンコーティングしたガラスへの結合より少ないフィラメント中のチャンバ内のフィラメント結果溶液の体積を増加させる。
注4：4℃で最大48時間のインキュベーション時間が良い結果でテストされています。チャンバーは、それが複数の日に同じサンプルを使用することは推奨されませんので、バッファを切り替えるにさらされた後にアクチンフィラメント画質が劣化する。
3。画像マーカとして、微小球蛍光ビーズ
- イメージング室に希釈されたビーズを追加し、* 5 15分間待ちます。溶液を除去し、画像化の前にPBSで3回洗浄する。
注5 -希釈およびインキュベーション時間は、ビーズの異なる密度を得るために調整することができる。 20.5ミクロンあたり10ビーズX 20.5ミクロンの視野-このプロトコルは、通常3〜になる。
4。上皮成長因子細胞染色
- 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で約80％コンフルエントに撮像チャンバ内の培養HeLa細胞。
- 培養培地を除去し、PBSで洗浄する。次いで、10分間、4％ホルムアルデヒド溶液（4 mlの10％ホルムアルデヒド溶液1mlの10×PBS、5mlの水）500μlを添加する。ホルムアルデヒドを除去してPBSで3回洗浄する。細胞はDのままにしないでくださいRY、常に、PBSを使用するには、低張性、ストレスを避けるために、ソリューションをバッファリングされた。
注意 - ホルムアルデヒドは、非常に毒性が強い。適切な手袋、目の保護と白衣を着用していることを確認します。ホルムアルデヒドの処分のための現地のガイドラインを確認してください。
- 50μg/ mlの保存溶液を作成するために、製造業者の指示に従って、EGFアレクサ647を再構成する。 （PBS中）、0.1％BSA溶液の200μlにこの原液の2を添加する。細胞からPBSを除去、EGF溶液を添加し、30分間インキュベートする。
- 溶液を除去し、15分間（PBS中）0.1％BSAのブロッキング溶液を添加する前にPBSで3回洗浄する。これを削除し、以前の画像にPBSでさらに3回洗浄する。
5。バッファの準備を切り替える
- カタラーゼ10μL（20μg/ ml）を、1 Mトリス（2 - carboxyelthyl）ホスフィン塩酸塩（4mm）を、2.5ミリリットルグリセリン（50％）の20μL、125μlの酵素原液（A）を作る1 MのKCl（25 mM）を、1MのpHは7.5のTris-HCl（20mM）を、DIH 2 Oで5ミリリットルボリュームにグルコースオキシダーゼ（1 mg / ml）で、トップまでの5 mgの100μlを。これは、-20℃で保存し、最長1年間使用することができる100×50μlのアリコートを作るのに十分である。
- ）4gのグルコース（100 mg / ml）を4mlのグリセリン（10％）および36ミリリットルDIH 2 Oでグルコースストック溶液（B）を作る。 20°C、最大1年間に使用される - これはで保存することができる100×400μlのアリコートを作るのに十分である。
- MEA -塩酸（1M）の113.6 mgおよびのdiH 2 0の1ミリリットルと還元剤原液（C）を作る。新鮮を使用するか、-20℃で保存し、1ヶ月までに使用することができ、10×100μlアリコートを、（一定分量を再冷凍しないでください）を作る。
- 直前にイメージングするためには、酵素（A）、グルコース（B）との比率50μL、400μL、100μLで一緒剤（C）の原液を削減をミックスし、* 6、PBSで1ミリリットルに構成しています。このバッファは現在、酸素を除去し、還元環境（100mMのMEAを持ちます塩酸）* 7。最終的なpHの範囲は6.0であるべき- 8.5（調整は、通常は必要ありません）* 8。
注6 -このバッファは、Cy5でおよびAlexa 647などのシアニン系色素での使用に適している。
注7 -最終酵素濃度は、50μgの個/ ml（5単位/ ml）は、グルコースオキシダーゼおよび1μgの個/ ml（40〜60単位/ ml）のカタラーゼ。酵素活性（単位）は供給者によって与えられ、異なる場合があります。カタラーゼのための計算は、ステップ5.4の後に1μg/ mlの最終濃度が酵素の50単位を含むことになることを想定しています。同じような酸素除去成分を含む種々の緩衝剤組成物は21,30,40見つけることができます。バッファと染料の組み合わせの概要については参考文献28,29を参照してください。グリセリン及びTCEPを-20℃で長期保存のために必要とされる
注8 -イメージングアクチンフィラメントは、Tの安定化を支援する2 MgCl 2および0.2 mMのATPを追加した場合彼はフィラメント。
6。 （アレクサ647染料を使用して）STORMデータの顕微鏡取得
- 熱平衡に達することができるようにSTORM / PALM顕微鏡、イメージングの前には少なくとも3時間のスイッチをオンにします。この前のイメージングは、ドリフトの機会が増加しています。
- 顕微鏡ステージ試料ホルダーにイメージングチャンバーを挿入します。サンプルがホルダーにしっかりとあり、平らであることを確認してください。
- イメージングチャンバーからPBSを削除してからスイッチングバッファーで先頭に記入してください。慎重に確認して気泡が全く存在しないことを、全室がカバーされていることを作り、チャンバーの上にカバースリップを配置。任意の気泡がそうでない場合、パフォーマンスが低下することができるバッファが見られる場合は、追加のバッファーまたはPBSを補充して下さい。
注意 - サンプルおよびバッファが平衡化させていることが推奨され、対物レンズに関連したサンプルの横方向と軸方向のドリフトの可能性を最小限にする撮像前に少なくとも15分間室温。
- 画像化される対象の蛍光構造の位置を確認します。これは、細胞試料に特に利益のある非合焦光を最小化することによって信号対雑音比を改善するように、この場合の照明の所望の角度、TIRFまたは高度に傾斜角を選択することをお勧めします。前STORM画像化と構造の基準回折限界画像を撮影。
- 約2キロワット/ cm 2程度に相当する、ハイパワーに（約640nmの適当な励起波長を有する）励起レーザを増加しながら10秒露光のカメラ設定と約50Hzのサイクル時間を有するイメージング（フレーム毎秒） 。フルオロフォア（ほとんどのサンプルのために、おそらく10秒以内）、疎点滅パターンに移行したら* 9万のフレームを収集します。
9注-万のフレームは、ここで説明するサンプルに適していますしかし、他のサンプル50,000以上のフレーム数を増やす必要があり得る。
7。生データから超解像画像を再構成する（暴風雨を使用）
- MATLAB内部からrainSTORM.mファイルを開きます（ 図1A）を実行します。
- 暴風雨ウィンドウ（ 図1B）で、[参照]ボタンを使用して分析したい画像ファイルを選択します。これは。tifファイル（ImageJのはTIFフォーマットに他の種類のファイルを変換するために使用することができる）である必要があります。 * 10個のデータを取得するために使用される顕微鏡システムの生データと一致するように画素幅を変化させる。デフォルトに他の値のままにしておきます。
注10 -典型的なEMCCDカメラは16ミクロンのピクセルサイズを持っているので、100倍の対物レンズを備えたシステム上で画像上の画素サイズが160ナノメートルとなります。商用システム上のピクセルサイズは、通常、ソフトウェア内に表示される。ピクセルサイズは、ほとんどのローカリゼーション顕微鏡用100 nmから160 nmの間で変動する。
- 「プロセスイメージ」ボタンを押して、予備的な画像が表示されるまで待ちます。処理の持続時間は、ファイルサイズ、コンピュータ書および* 11生データ内の候補点滅の数に依存する。
注記11 -アクチンおよびEGFデータの万フレームシーケンスは、IntelのXeon E5420のCPUを搭載したPCを使用して、それぞれの処理に23秒、25秒を要した。複数のコア処理せずにMATLABの並列処理ツールボックスのない、またはコンピュータと同じコンピュータを使用して、時間はそれぞれ66秒と81秒だった。
- 更新された超解像画像を押し「オープンアー」ボタンを生成し、第二のウィンドウが（ 図1C）が表示されます。 （ 図1D）、必要に応じて画像表示を変更するために、「コントラストの調整」ボタンをクリックして下さい。いくつかのケースでは、画像は非常に暗いである場合、最大値は減少させるべきである。
- REVを使用有用な画像品質メトリックを生成し、さらに超解像画像を精緻化するiewerウィンドウ（ 図1C）。 12 *はそれぞれ4000、0.1および0.8〜2.0の値〜第3の品質管理パラメータを設定します。光子校正測定に基づいて、または特定のEMゲイン設定用のカメラメーカーが指定光子曲線検量線の値を使用してのいずれかである必要があり、光子値当たりのカウントを更新します。これにより、正確な精度と解像度* 13測定値を得るために重要である。
注12 -信号の輝度基準に基づいて点滅を拒否カウントします。値が大きいほど明るくは点滅、最終画像内の局在として受け入れとなることでなければなりません。これは、色素と露光時間とカメラの感度の光子出力に応じて変更する必要があるかもしれません。信号とフィットガウスすなわち、Dとの間に有意な乗誤差がある場合には許容範囲が点滅を拒否oubleピーク。 PSFの嵌合幅がこの範囲外にある場合、PSFシグマ範囲が点滅を拒否し、すなわち、より狭い範囲は、焦点外の信号および一定の蛍光の大きな凝集したブロブを拒絶するために使用することができる。より広い範囲を使用すると、最終画像に現れる非局在化アーチファクトをもたらし得る。実際には、ローカリゼーション精密カットオフパラメータを使用して初期品質管理を行うことをお勧めします。
注13 -解像度測定基準の詳細については、参考文献23,27を参照してください。各々によって生成される光子の数を知ることにより簡単に言えば、それが画像全体の精度の見積もりを意味各定位の定位の精度を計算し、その結果、全体的な導出することができる点滅。フォトン値ごと200カウントのゲイン設定でアンドールIXON DU-897Eを使用すると、9.04である。
- 平均ローカリゼーションPRECISの最適化とのトレードオフにローカライズ精密カット（ 図1C）を変更最終的な画像でのローカリゼーションの数に対するイオン。 30〜50ナノメートルの値は、データの質と試料によって推奨されています。ヒストグラムおよびINFO.TXTファイルの両方は、この決定した（ 図1Fおよび1G）を通知するために使用することができる。
- 再スケール係数（ 図1C）デフォルトでは、元の画像の画素幅が160nmであると仮定し32ナノメートルの超解像度ピクセルを生成し、これは5である。原画像が100nmの画素サイズを有する場合、これは、20nmの画素を有する超解像画像を生成する。 * 14最終的な画像でより小さな超解像度ピクセルを生成するためにスケールファクタを増やします。
注記14 -ローカリゼーション顕微鏡の分解能は（単純なヒストグラム再建のピクセルサイズつまり）の可視化だけでなく、ローカライズの精度に必要な平滑に依存します。実際には、再構成画素サイズは、一般的に局在化よりも小さくなければならない精度（情報テキストファイルの平均の高精度推定メトリックを参照してください - 6.11＆6.12ステップ）。この場合による再構成画素サイズの解像度の損失は小さく23,27であろう。例えば図4Eの行と列の方向の平均精度の推定値は16.1 nmおよび16.2 nmのです。 16nmのピクセルサイズは、（160nmの元のピクセル幅を有する10の再スケールファクタ）は、このデータを可視化するために使用されている。
- 例えば、生データのサブセットに再構築を制限する限界枠の範囲（ 図1C）を修正[2001-INF]生データの初期2000のフレームを除外することになる。
- 更新された超解像画像（ 図1E）を生成する「ファイル名を指定して実行のレ」ボタン（ 図1C）を押します。
- 画像品質メトリック（ 図1F）* 15を表示するために、「ヒストグラム表示」ボタン（ 図1C）を押す。 注記15 -カメラフレーム番号と右下（ 図1F）でのトンプソンローカライズプレシジョンヒストグラムに対する受け入れローカライズの数を描いた右上のグラフは、ローカリゼーション、精密カットのレビューオプションを通知するために使用することができます。例えば、50 nmのカットオフを使用すると、最終的な高解像度画像に含まれるから、悪く精度ですべてのローカライズを除外するであろう。
- 16 *このデータのすべてを保存するためにレビューします（ 図1C）で「画像保存」ボタンをクリックして下さい。
- 7.6に進み、必要に応じて別の校閲者のパラメータを使用して以降の処理を繰り返すためにデータを調べた後（ 例えば INFO.TXTファイルおよびヒストグラム）を返します。ステップ7.11で「名前を付けて画像を保存」を押すと、以前に保存したデータを上書きします。
- 通常の方法で画像を生成する7.9 - 手順7.1を実行します。
- レビュー（ 図1C）の「ボックス追跡」ボタンを押して、レビュー画面上の指定基準マーカや構造上のボックスをクリックしてドラッグします。
- 新しいイメージが表示されるまで「箱入りポジション」（例については図6B、6Cと6Fを参照）が表示されるまで待ちます。必要に応じて、このイメージを保存します。
- 関心のあるオブジェクトが基準マーカであれば、補正は「サブ続く「SETアンカー」ボタンをクリックすることにより行うことができるドリフト道ドリフト」ボタンを押します。最後になりましたすべてのローカライズが基準マーカ位置に応じて修正した新しいSTORM画像を生成するために、再度「ファイル名を指定して実行のレ」をクリックします。ビーズの位置は、最終的なレビュー画像から削除されます。
- 最終ドリフト補正画像内の他の基準マーカがある場合は、所望に応じて、これらは「ボックス·トラッキング」を押すことによって除去することができ、次いで、「ランレ '何度でも'箱入り削除」と。
注記16 - 3〜5のファイルが（加算画像、STORMdataImage、STORMprocessed、インフォメーション＆hists）選択したオプションに応じて保存することができ、 図1Gは、参照してください。 STORM処理された画像が修正されたコントラストとカラーマップで表示されます。 STORMdataImageは、各画素の階調レベルが無感覚に等しいで、グレースケール画像であるその中で同定されたローカライズのER。
8。箱トラッキングとドリフト補正（暴風雨を使用）
Representative Results
デキストラン
デキストランの成功コーティングが蛍光単分子膜を生成する必要があります。高濃度では、これは比較的均一に表示されます。低濃度ではそれが（ 図2A）まばらに表示されます。多くSTORM / PALM顕微鏡はTIRFに落射蛍光からの照明の角度を変更する能力を持っている。典型的なEMCCDカメラに512×512ピクセルで、たとえば、フルフレームカメラビューを使用する場合は、均一な照明を考える必要はありません。任意ストライプ又はピンボケ領域がある場合、これは、試料が対物レンズに新鮮な油と試料ホルダに再挿入する必要があることを示すことができる。あるいは、顕微鏡に問題がある可能性があります。
超解像の生データを取得する際に画像形成レーザーは約2キロワット/ cm 2の電力に大きくする必要があります。蛍光団がして駆動されるように、点滅が続く蛍光の初期バーストがあるでしょう一時的な暗い状態に。高デキストランで点滅し、特に、画像取得の先頭近く、オーバーラップする可能性が高い濃度（ ビデオ1）。中、低密度でこれらの点滅は、 つまり空間的に分離され、スパースでなければならず、明らかな背景を持つ焦点に（ 図2A、動画2および3をフレーム2000、5000および8000を参照）。この画像取得段階では、一定のレーザー照射で、点滅の数は、（高密度のサンプル、 図2（a）にフレーム8000とフレーム2000と比較）時間とともに減少します。異なるデキストラン濃度（高、中、低）の種々の超解像画像間の主な違いは、ローカリゼーション数の減少（ 図2Aおよび2B）である。換言すれば、蛍光分子の濃度は、生データにおける瞬きの数及び局在の数は比例関係にある。この関係、しかし、非常に高い分子のように（ 図2Cを赤と青のラインと比較されたい）ソフトウェアが正常に分子を局所化することができない密度単純な線形ではありません。この理由は、処理ソフトウェアが点滅が非スパースであるガウスフィッティングアルゴリズムを用いた位置に合うように高濃度でそれが不可能であることである。点滅は、ソフトウェアの光退色に取得段階を通じて低下したとおりに（ 図2Aおよび2C）、疎になると、より多くの点滅の多くを収めることができます。さらに、個々の色素分子が点滅してもよいので、28,41,42回以上ローカライズする。
これらのサンプルのいずれかを撮像する共通の問題が、特に高密度デキストランつは、急速にSTORM画像取得段階中に拡散されるようであるが非集束明るい蛍光ヘイズの存在下であってもよい。これは上のコントラストの高い蛍光団とは区別される（ 図3A、ビデオ5）の点滅見ることができるガラスの表面。これらの離脱蛍光分子は、従来のスイッチング·バッファを追加するPBSでの洗浄工程の数を増加させることによって、又はチャンバ（ 図3B、ビデオ6）新鮮なスイッチング緩衝液を添加することによって予防または除去することができる。それらは点滅をローカライズするためにソフトウェアを嵌合することが可能なローカリゼーションの数と精度の両方の減少（ 図3C、3D、3Eを有する非常に異なる超解像度画像における各画像シーケンスの結果からのデータを処理し、比較することおよび3F）。
アクチンフィラメント
予め形成されたアクチンフィラメントは、回折限界画像（ 図4A〜4C）でガラス表面に付着したことが分かる。フィラメントの数が非常に少ない表示される場合は、より長いインキュベーション時間は、使用またはアクチンの量の減少することができるフィラメントソリューションも役立ちます。より良い品質の画像内の単一の比較的明るいフィラメント（ 図4D）のではなく、もつれた地域の結果を選択。アクイジション·フェーズでは、鮮やかな合焦点点滅は、フィラメントの長さ（ 動画7）に沿って見られるべきである。スパース点滅はアクイジション·フェーズ中に見られるべきであるとし、その後、処理されたデータに細い連続フィラメント（ 図4E）があるはずですし、フレームごとのローカライズは、 図3Eとは異なり、徐々に減少します（ 図4F）はず。
点滅が非スパースである場合、またはソフトウェア分子を局在化することができない場合は、誤った局在32と呼ばれる、より微妙なアーティファクトは、生じ得る。ソフトウェアの平均は2オーバーラップする分子の位置とローカリゼーションは、それらの間の位置の中間にある場合に発生します。重複BLIかなりの数がなかったことを指示NKS、結果的にmislocalizations、平均精度の推定値、 すなわち水平方向および垂直方向に、行と列の方向で同じでなければならないことである。mislocalizationsがあるときは、これらは、フィラメントの長さに沿って発生したであろう、通常よりも大きなまばたきを生産し（結果的に方向のいずれかに少ない精度でローカライズされたであろう多くのピクセル以上すなわちスプレッド）。そこ単一アクチンフィラメントは、撮像領域内にあり、それは水平または垂直に横たわっている場合、これは最も容易に見られる。この場合には、STORM顕微鏡は、両方向に16nmの平均精度を達成した。これは精度限界、約34ナノメートルの有効画像解像度の尺度になる。我々は、均一な直径のフィラメント状構造、我々は、画像の解像度を推定するためにFWHMの測定値を取ることができ、非常に小さなファロイジン-アレクサ647で標識さ7nmを有するように、これらのメトリックは、しかしながら、暴風雨27によって提供される。 DRAによるImageJの（ 図4G）での超解像画像のフィラメントに翼直線をプロットプロファイル機能（ 図4H）を使用して、その後、半値幅が43.2 nmのように計算されたガウスフィット（ 図4I）を実施する。この測定をしようとしたとき、我々は、画素サイズが一致するか（INFO.TXTファイル図1Gを参照）、画像の平均精度の推定値よりわずかに小さくすることをお勧めします。この場合には、16nmの画素は、画像を再構成するために使用した。
二つの関連する問題が点滅蛍光団が同時に約250 nmの点滅内の非スパース、 すなわち個々の分子になるため、信号が重なっ嵐、発生する可能性があります。最初のアルゴリズムおよびそれが使用する品質管理基準に応じて、点滅は全く局在化されないことである。これは、ほとんどまたは全く局在して超解像画像が得られる。第二の問題2点滅が単一の点滅のように表示されるように互いに十分近く発生したときにmislocalizationsが発生します。この場合、最終画像における位置は、2つの平均を表す。これについての詳細は文献32を参照してください。両方の場合において、これは非常に高密度のサンプルが不十分レーザパワーで、または緩衝液の問題を切り替えで発生する可能性がある。アクチンフィラメントの数は、分岐および/ または（ 図5A〜D、ビデオ9）互いに交差している場合、この問題は明らかである。フレームのサブセットを処理し、最初と最後の5000のフレームを比較することによって、我々は、さまざまな結果の画像を見ることができます。最初の5000フレーム（ 図5C）を使用した超解像画像では、最後の5000のフレームを使用している場合、これらの非常に少数は明らかであり、我々はちょうどが残されているが、画像の中央にある多くのローカライゼーションがあることがわかりますフィラメント、IMAGにおけるローカライズの数が少ないせいでやや不連続ではあるがE（ 図5D）。高すぎる点滅密度が疑われる場合は、フレームデータ毎に局在化と画像の比較が強く、この問題が発生していることをお勧めすることができます。フレームの最初のセットの間に10以上のフレームごとのローカライズの平均数は、最後のセットと比較してありますそれが約4（ 図5E）であるフレームの。画像化される多数の分子が存在する場合、 すなわち、高密度サンプルについて、これは必要とするが、それは、可能な限りフレーム当たりわずか局在を有することが理想的である天然mislocalizationsの可能性を最小限にするために当該取得多数のフレームはドリフトであるSTORM顕微鏡という問題につながる取られる。
横ドリフト - アクチンフィラメントおよび画像マーカ
ドリフトが発生したときに、データ取得フェーズを介して対物レンズに関連して、サンプルを移動する。これはドゥリンを見ることが困難または不可能であるそれは横方向ではなく軸方向、またはそれは、典型的には比較的安定した顕微鏡システムのために数分かけて50ナノメートル未満であるように、それは具体的には、測定されている場合は特にない限り、グラム画像取得段階。しかしながら、このような明確な構造を有するアクチンフィラメントとして知られている構造の再構成画像では、超解像画像において検出することができる。横方向のドリフトが発生した可能性があるという最初の徴候は構造が、67 nmのと比べて、この場合に、豪雨の精度限界データと比較して相対的に大きいFWHMで（例えば、 図6A、ビデオ8）90nmの予想よりも大きいことである。しかし、ドリフトを検出するためのより良い方法は、後のフレーム内の局在が早いフレームのものに比べてずれている場合は、 すなわち見て、時間の関数として局在を比較することである。この場合には明らかに、非常に小さく、均一な構造のものであるアクチンフィラメントの場合に見られる暴風雨（ 図6Bおよび6C）におけるボックス追跡機能を使用してカラーコードで表示。
ドリフトはよく認識されている問題であり、19、最小化するか、取得後のいずれかの基準マーカー21,43又は相互相関44を用いて補正することができる多くの戦略が存在する。ドリフトおよびそれの正しいを測定するために、直径100nmの蛍光ビーズは、基準マーカ（ 図6D）として使用することができる。彼らは小さく、明るくしているため、その位置を正確な暴風雨などのガウシアンフィッティングアルゴリズムを使用して測定することができます。 3分10秒かけて、約100nmの比較的厳しいドリフトがある例では、取得段階（ 図6E）の間に、同じボックストラッキング機能は、カラーコードを使用して（ 図6Fつまりドリフトが発生して確認することができます）。この例では、すべての4つのビーズがほぼ同一のドリフトを示したように、Pであるそれらのうちの一つを選択するossible、この場合には参考とし、他のビーズ（ 図6G）からドリフトを減算する、2ビード。それは、基になる構造が不明またははるかに可変アクチンフィラメントや蛍光ビーズよりもドリフトを測定して補正することが可能となる目的の生物学的サンプルに基準マーカーを追加することによって。
上皮成長因子
最後に、EGF染色HeLa細胞は、細胞（ 図7A、ビデオ10）における画像解像度の現実的な例を与えるために使用することができる。それらはカバーガラスに近接細胞表面上の平面の焦点におけるEGF-蛍光の大部分を有するべきであるように、これらの細胞は、画像が比較的簡単である。小さい明るい領域は、中央に核の位置に対応する。 TIRF照明はセルmの部分からの焦点外の蛍光を排除することによって、画質を向上させることができるガラス（細胞内への約150nmの浸透）に近接embraneはない。回折限界画像内の関心領域にズームインさは、典型的には、（ 図7B及び7C）不明瞭であり、ただし、超解像度画像中の混合物があるべきクラスタと時折単離された単一のピクセル（ 図7D〜7F）の。これらは、細胞表面または非特異的結合の可能な少量で単離されたEGF受容体のいずれかを表す。クラスターは、直径が約100nmで、成形ピットおよび小胞、EGFは、主にダウンレギュレートし、エンドサイトーシスされ、それを介して経路に対応する可能性が高いであろう。典型的な平均の推定値の精度は、約45nmの精度限界を有するサンプルは、このタイプの20nmのまわりにある。これは、実効分解能の精度限界この尺度は基準マーカで測定することができるアカウントラベルのサイズ、または任意のドリフトを考慮しないことに留意が、それでもnoticであるべきであるクラスタや、図6に概説し、プロトコルセクション8で説明したように箱の追跡機能を使用しての「彗星の尾」によるeable。
| コンポーネント | 最終濃度 |
| カタラーゼ | 1μg/ mlの（50台） |
| グルコース | 40 mg / mlの |
| ブドウ糖酸化酵素 | 50μg/ mlの |
| グリセリン | 12.50パーセント |
| 塩化カリウム | 1.25 mMの |
| MEA-塩酸 | 100 mMの |
| TCEP | 200μMの |
| トリス | 1 mMの |
表3。バッファの切り替え
| 典型的な取得設定 | 値 |
| ピクセルサイズ（ナノメートル） 160 | |
| 露光時間（ミリ秒） | 10 |
| ゲイン | 200 |
| フレームサイズ（ピクセル） | 128×128 |
| サイクルタイム（FPS） | 52.5 |
| フレーム番号 | 万 |
| 640 nmのレーザーパワー密度出力（kW / cm 2）と | 2 |
表4。取得設定
図1。暴風雨の使い方STORM画像再構成（A）は、MATLAB内から暴風雨を開く。 （B）暴風雨グラフィカルユーザインタフェース（GUI）。 （C）暴風雨レビューのGUI。 （D）コントラストウィンドウを調整します。レビューとコントラスト調整後の、（E）STORMイメージ。 （F）彼画質メトリックのtograms。レビューアのGUIで画像保存ボタンを押した後に生成（G）ファイルは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2（A）回折限定（DL）の画像は、デキストラン従来STORM画像化の異なる濃度を示す。超解像（SR）画像再構成は、25nmの画素サイズを有する。 128×128ピクセルのフレームサイズと個々のフレームがその配列（2,000 5,000 8,000）から示されている1万の画像を収集した。毎秒52.5フレームで10秒露光時間で取得しました。画像は、160nmのピクセルサイズを有する。 0.1％画素彩度コントラスト強調を表示を明確にするためにはImageJを用いて塗布した。平均精度見積もりは、28ナノメートル（高）、24ナノメートル（中）と異なるデキストラン画像の（低い）16ナノメートルである。ローカリゼーション密度は以下2当たり724（高）、以下2（中）あたり526および13 2 UMあたりの（低い）である。 （B）グラフはデキストランの各濃度の3万フレームシーケンスの平均を示す。エラーバーは標準偏差を示す。（C）グラフローリング100フレームの平均を使用してフレームごとに受け入れられたローカライズの数をプロットする。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。質の悪いデキストランデータ。15000フレームストーム配列からの（A）の回折限界のフレーム。画像を横切って拡散蛍光ヘイズに注意してください。これはfluorophoによって引き起こされる RES媒体を介して拡散する。 128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得した。 （B）は、バッファが変更された後に（A）と同じ。未結合の蛍光団が洗い流されてきたように改善されたコントラストに注意してください。 （C）（A）で収集されたデータに対応する超解像画像再構成。同一の画像サイズが、25nmのピクセル。平均精度の推定値は35 nmである。 （D）（B）で収集されたデータに対応する超解像画像再構成。同一の画像サイズが、25nmのピクセル。平均精度の推定値は30nmである。 （E）のグラフは、ローリング100フレームの平均を使用して、フレームごとに受け入れローカライズの数をプロットする。赤い線は、高いバックグラウンドがあるSTORM列（A＆C）に対応している。青い線は、バックグラウンドが低く、（B＆D）に対応するデータを示している。高に対応する画像のために受け入れ定位数を示す（F）のグラフ（C）及び低（D）バックグラウンドデータ。HREF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg"ターゲット= "_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。
図4。前のバッファとSTORM画像を切り替えるの添加アクチンフィラメントの典型的なアクチンのデータ（AC）回折制限画像。フィラメントの長さが可変見ることができる。非常に明るいフィラメントは、多くの場合、一緒にもつれたいくつかのフィラメントである。画素サイズは160 nmである。 （D）は、単一のアクチンフィラメントの回折限界像。 （E）STORM画像（ImageJのに適用される0.1％のコントラスト強調）。 128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得された10,000フレームシーケンスから。画素サイズは16 nmである。平均精度の推定値は16 nmである。受け入れローカライズの数をプロット（F）グラフローリング100フレームの平均を使用してフレームごとにS、。全体で描かれた黄色のラインプロファイルをコントラスト強調する前に、（E）からアクチンフィラメントの領域に拡大（G）A。 （H）アクチンフィラメントを横切って引か黄色の線からプロットプロファイルビュー。 ImageJの中で生成された。 （I）ImageJの中のカーブフィッティングツールを使用して、プロットプロファイルのガウスフィット。標準偏差は、Dは、43.2ナノメートルのFWHMの測定を得るために2.35を掛けた。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図5。 Mislocalizedアクチンフィラメント（A）の回折限界アクチンフィラメント。 160 nmのピクセル。 （B）（A）に示したアクチンフィラメントのSTORM画像。 128×128ピクセルFRAM 20,000フレームシーケンスから電子サイズ、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得した。 STORM画素サイズは16 nmである。 2万のフレームが処理された。平均精度の推定値は17 nmである。 （C）（B）としては、但し20,000フレームシーケンスの最初の5000フレームの処理を有する。平均精度の推定値は18程度である。（D）、（B）としてではなく、処理2万フレームシーケンスの最後の5000フレームで。平均精度の推定値は17程度である。完全な128×128ピクセル·フレームビューからフレームデータごとにローカライズの（E）のグラフ。
図6。ドリフト横64×64ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒64.6フレームで撮影した1万フレームシーケンスから再構成アクチンフィラメントの（A）STORM画像を表示する。 STORMの画素サイズは32 nmである。平均精度の推定値である32 nmの。 （B）STORMイメージは暴風雨の「ボックスの追跡」機能を使用して表示。ローカライゼーションは、それらが取得されたときのフレーム番号に対応する色で表示される、例えば、収集シーケンスの初期からのローカライズは、青色であり、後期取得シーケンス内の局在が赤である。避難色はドリフトが発生したことを示す。 （C）（A）の領域にズームAは暴風雨におけるボックス追跡機能を使用して表示。避難色はドリフトが発生したことを示す。 （D）基準マーカーとして使用することができる4つの100nmの蛍光ビーズの回折限界像。ピクセルサイズ160 nmの。数字1-4ショーはトリミングされ、個別にビーズを拡大。 （E）128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得した1万フレームシーケンスから暴風雨で再構成（D）に対応する各蛍光ビーズ。 STORMの画素サイズは5nmである。平均精度の推定値は7nmである。 （F）（D）に対応するビーズ及び（E）、「箱の追跡」機能を使用して表示。避難色はドリフトが発生したことを示す。 （G）ビーズ番号2を使用して参照として、ビーズ1,3,4 'が減算ドリフト」機能の後に表示されているが、暴風雨で使用される。 （E）との比較は、横方向のドリフトが補正されていることを示している。 STORMの画素サイズは5 nmである。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図7。典型的なEGFデータ。基底細胞表面に集束したHeLa細胞の一部の（A）回折制限された画像。黄色のボックスは、（B）および（C）に示される関心領域にズームイン示す。 （b）細胞（ボックスB）のエッジ付近の領域からの回折限界画像をズームイン。 （C）回折限界にズームイン核（ボックスC）下の領域からのイメージ。 （D）に対応するSTORM画像（A）。 128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得された10,000フレームシーケンスから。 STORMの画素サイズは25 nmである。平均精度の推定値は21程度である。 （E）、E（D）をボックスに対応するSTORMイメージ。 （F）F（D）をボックスに対応するSTORM画像を表示する。 （D）から、フレームデータ毎に、（G）版。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
1 =高、2 =中、3 =低、4 =なし）： 動画1-4動画デキストラン濃度を変化させて図2Aに対応している。毎秒52.5フレームで10ミリ秒の露光時間で取得128×128ピクセルのフレームサイズ、10,000フレームシーケンス。 ビデオ1を見るにはここをクリックしてください 、load/50579/50579video2.mov "ターゲット=" _blank ">映像2、 映像3 、 映像4
ビデオ5-6。動画3 A＆Bビデオ5図に対応し、非結合蛍光団が除去された後にプレ洗浄およびビデオ6は、洗浄後である。 128×128ピクセルのフレームサイズ、10ミリ秒の露光時間を使用して、毎秒52.5フレームで取得された15000フレームシーケンス。 ビデオ5見るにはここをクリックしてください 、 ビデオ6 。
ビデオ7。ビデオ図4EにおいてSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示す。万フレームseque128×128ピクセルのフレームサイズ、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得されたとのNCE。 ビデオ7を見るにはここをクリックしてください 。
ビデオ8。ビデオ図5BにSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示す。 2万128×128ピクセルのフレームサイズとフレームシーケンス、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得しました。 ビデオ8を見るにはここをクリックしてください 。
ビデオ9。ビデオ図6AにSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示す。 64×64ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒64.6フレームで撮影した。10,000フレームシーケンスCLIビデオ9を表示するには、こちらのCK。
ビデオ10。図7DにSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示すビデオ。万128×128ピクセルのフレームサイズとフレームシーケンス、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得しました。 ビデオ10を見るにはここをクリックしてください 。
Discussion
我々はいくつかの簡単なテストサンプルと、それは、嵐の超解像イメージングを最適化することが可能で、自由に利用可能な処理ソフトウェアの暴風雨で示しています。これらのツールや方法は、新規ユーザーとその顕微鏡での自信と前例のないディテールで生物学的および細胞構造を研究するためにそれらの利用を高めるために、経験豊富なユーザのための方法のための有用な出発点を提供します。このような精度の推定値、局在番号と、画像品質を向上させるため、より大きな自信を持つことが可能で示すヒストグラムを意味するように、既知の又は十分に理解された構造および有用な画像品質メトリックの数を生成することができるアルゴリズムを有するサンプルとの組み合わせを使用することによりSTORMイメージングプロセスにおいて。誰サイズを用いることができる別の商業的および自作の顕微鏡構成の数があるので、データを取得するすべてのアプローチに適合していないが存在する。また、インフルできる多くのサンプル調製および画像取得ステップがあります最終的なイメージは、そのためのソフトウェア·ツールとテストサンプルを持つことが理解とSTORM画質を最適化するために重要であるリファレンス。
さらに、これらのプロトコルは、発生する可能性のある問題のトラブルシューティングの役に立つと少ない曖昧な方法を提供することができます。例えばデキストランサンプルは任意のレーザービームの位置ずれや、サンプルの照明ムラがあるかどうかを識別するための非常に便利な方法です。スイッチングバッファは任意の「点滅」は役立つがあるかどうかを確認するのは非常に簡単な目視検査作業できないことが懸念されている場合。アクチンフィラメントは、FWHMの比較を使用して、解像度を測定するだけでなく、ドリフトや誤局在アーティファクトを強調表示する便利な方法です。しかしながら、局在型超解像法はフルオロフォア濃度に敏感であることができるように、例えば、露光時間、フレームレート、レーザパワーと画像が処理される方法のような他の要因、にもかかわらず、それを割り当てることが不可能であることに留意すべきである解像度特に顕微鏡や全ての画像がその解像度を持っていることを前提としています。何が可能であることは、しかしながら、そのような平均局在化精度、定位数と解像度の種々の態様を測定し、27ドリフトすることである。基準マーカは、彼らができる全ての実験に組み込むことができない場合でも、少なくとも、その環境、顕微鏡システムを特徴付けるために使用することが、より良いような起動時の後に熱平衡に到達するために必要な時間などの操作の考慮事項を理解する。この画像43を獲得している一方で、試料位置を補正する非点収差レンズとフィードバック機構の使用を必要とするが、同様に横方向のドリフトを補正するような、基準マーカは、軸方向のドリフトを特徴付け、正しいするために使用することができる。商業的な超解像システムは、通常、安定制御やフォーカスドリフトを補正するためのより実用的な解決策とすることができるフォーカスロック機構のいくつかの並べ替えを含む。
そこ非特異的な直接染料を使用するなど、デキストラン、または二次抗体のような他の共役分子とガラスをコーティングに代わる再。これらのアプローチの制限は、ガラスに結合した分子の数は知られていないことである。使用されている代替の糸状の構造は、微小管28とDNA 21が含まれています。しかし、非常に小型で便利な市販の試薬 の組合せはまた、システム27の性能測定に有用であり得る、特に分岐または分岐状のフィラメントの分離距離として、魅力的な代替アクチン行う。
試験サンプルの更なる発展の余地がこのエリア28,29,46,47の最近の進歩にもかかわらず、そこにある。特に、マルチカラーイメージングは、イメージングのすべての3つの主要な側面で多くの課題は、サンプルラベリング、画像取得（ハードウェア）、ソフトウェア（画像処理及び配向）を示す。が行われているこれらの態様4-6に対処する多くの刊行物及び適切な試験サンプルおよび方法論は確実に画像を生成して、これらのタイプの解釈に重要であることは明らかである。実際、最近ではdSTORMがの2色画像を撮影し、解決し、核膜孔複合体の対称性の高い性質のために使用できることが示されており、著者らは、この色収差補正45の性能を評価するための理想的な方法であることが示唆された。もう一つの興味深いアプローチは、離れて46特定のサブ回折距離で位置決め蛍光体の可能性が作成さnanorulerを作成するためのDNA折り紙を使用することである。これは、解像度を評価し、距離測定を行う方法を提供する。しかし、究極の目的は、このような複雑な三次元構造である細胞のような非理想化されたサンプルを、これらの超解像技術を適用することである。この場合、tは、より完全な理解の組合せ彼は、データを取得し、適切な方法でそれを処理し、画像指標を提供する際にユーザを支援するソフトウェアツールと組み合わせた技術は、最終的な回答である可能性が高い。28,29,47,48
Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、英国の国家計量局の生物化学計測技術プログラムから資金提供を認めている。我々は技術的なアドバイスや提案のためにセバスチャン·ファン·デ·リンデ、ミクロスErdelyi、エリックリースに感謝します。私たちは、有益なコメントや、この原稿の議論のためにミクロスErdelyi、エリック·リースとMax Ryadnovに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
| 100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
| EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
| 640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
| LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
| ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
| Table 1. Materials & Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyde - 10 % solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Table 2. Reagents | |||
References
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