Vi beskriver framställningen av tre provexemplar och hur de kan användas för att optimera och utvärdera resultaten av STORM mikroskop. Med hjälp av dessa exempel visar vi hur du kan få rådata och sedan bearbeta den att skaffa super-upplösning i celler på ca 30-50 nm upplösning.
STORM är ett nyligen utvecklat super-upplösning mikroskopi teknik med upp till 10 gånger bättre upplösning än vanliga fluorescens mikroskopi tekniker. Men som bilden överförs på ett helt annat sätt än normalt, genom att bygga upp en bild molekyl-för-molekyl, finns det några viktiga utmaningar för användare i att försöka optimera sin bildtagning. För att underlätta denna process och få mer insikt i hur STORM fungerar presenterar vi beredning av 3 testprov och metoden att förvärva och bearbetning STORM super-upplösning med typiska resolutioner av mellan 30-50 nm. Genom att kombinera testproven med hjälp av den fritt tillgängliga regnstorm bearbetning programvara är det möjligt att få en hel del information om bildkvalitet och upplösning. Med hjälp av dessa mått är det sedan möjligt att optimera avbildningsförfarandet från optiken, för att provberedningen, färg val, buffertförhållanden och bildförvärvs inställningar. Vi enLSO visar exempel på några vanliga problem som resulterar i dålig bildkvalitet, exempelvis lateral drift, där provet rör sig under bildtagning och densitet Relaterade problem som uppstår i "mislocalization" fenomen.
Nyligen har en rad optisk mikroskopi tekniker har utvecklats, vanligen kallat super-upplösning mikroskopi eller nanoskopi, vilket kan kringgå diffraktionsgränsen och generera bilder med en upplösning på 100 nm eller bättre 1,2. Sedan offentliggörandet av super-upplösning mikroskopi som den Nature Methods metoden av året 2008 har det skett en hel del utveckling av lokaliseringsbaserade mikroskop. Till exempel finns det flera färger applikationer 3-6, 3D-implementeringar 7-12, och även live-cell tillämpningar 5,13-17. Dessutom, eftersom dessa system håller på att kommersialiseras och är nu på väg ut ur optik laboratorier i händerna på cellbiologer finns det sannolikt en ytterligare ökning av deras användning och tillämpning av biomedicinska frågor.
En gren av denna familj är den lokaliseringsbaserade metoder som fungerar genom att bygga upp en bild molekyl-för-molekyl. Jagn För att göra detta, måste du slå de flesta av fluorescerande molekyler i provet av så att bara ett fåtal spatialt separerade molekylerna är aktivt åt gången. Dessa molekyler sedan snabbt slås på och av och många bilder tas, så att en betydande del av befolkningen avbildas för att spegla den underliggande strukturen med sub-diffraktion precision. Ett antal metoder har publicerats inklusive GSDIM 18 PALM 19, fPALM 20, STORM 21 och RESOLFT 22. Algoritmer som mäter läget hos en enda molekyl detektering kan därefter användas för att lokalisera den aktuella positionen av molekylen med precisionerna bättre än 20 nm med användning av Gauss-koppling 23, exempelvis rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 och regnstorm 27. När avbildning cell eller andra biologiska prover, som har en hög molekyltäthet, är det därför nödvändigt att ta många tusen ramardenna blinkande, rumsligt separerade, signal för att bild en avsevärd andel av de märkta molekylerna.
Stochastic optisk rekonstruktion mikroskop (STORM) och den starkt relaterade dSTORM och GSDIM metoder är lokaliseringsbaserade super-upplösningsmetoder, som har visat sig fungera med kommersiellt tillgängliga organiska färgämnen 21. De har sedan dess visat sig vara tillämplig på ett antal olika färger 28-30, vilket gör metoden särskilt attraktiva på grund av specificitet och relativa bekvämligheten av väletablerade immunomärkning metoder för att utföra fluorescensmikroskopi. Följaktligen finns det enkel tillgång till ett utbud av dye-antikropp och färgämnes biomolekylen konjugat, som har potential att användas i lokaliseringsbaserade super-upplösning. Medan de allmänna principerna för STORM och liknande metoder är relativt enkla, och vid första anblicken beredning hårdvara och prov verkar relativt straightforward, det finns ett antal steg i den process som är avgörande för att uppnå hög kvalitet, artefaktfria, super upplösning.
Som med alla mikroskopitekniker processen kan betraktas i tre huvudsteg: för det första provpreparering, andra, bild förvärv och för det tredje, bildbehandling och / eller bildanalys och tolkning. Den ytterligare upplösningsförmåga och metod för att generera super-upplösning med hjälp av en lokaliseringsbaserad metod introducerar några nya problem och överväganden 31-33. Börjar med provberedning, vid utförande av immunmärkning, i synnerhet indirekt immunfluorescens, där en primär och sekundär kombination antikropp används, bör det noteras att det fluorescerande färgämnet kan vara upp till 20 nm bort från den intressanta molekylen. I fallet med mikrotubuli, resulterar detta i diametrar på 35-50 nm jämfört med en förväntad mikrotubuli diameter på 25 nm 28,30. Dessutom bör märkningen tätheten mEET Nyquists kriterier i syfte att generera en bild av hög kvalitet 14. Till exempel för en förväntad upplösning på 20 nm längs en trådstruktur bör det finnas en färgämnesmolekyl minst var 10 nm 27. Medan många färgämnen har publicerats för att arbeta för lokalisering baserade närmar det totala resultatet av färgen är en blandning av åtminstone fyra viktiga kriterier, nämligen detekterade fotoner per växla händelse (ljusstyrkan för varje blinkning – ljusare är bättre), jämvikten på -off duty cycle (kontrastförhållandet av färgämnen i off kontra på staten – mer av är generellt bättre), överlevnadsfraktionen (en låg blekningshastigheten är bättre) och antalet tändcykler (antalet blinkningar per fluorofor – mer är bättre för högupplöst, även om 1 blinkning per fluoroforen kan vara en fördel för molekyl räkna ändamål). Situationen kompliceras ytterligare av det faktum att dessa egenskaper för ett givet färgämne kan variera i olika buffertbetingelser ochmed lasereffekt 28,29. Dessutom, liksom dessa unika STORM överväganden bildkvaliteten kan förbättras genom att optimera provberedning på samma sätt som mer traditionella fluorescens mikroskopi tekniker t.ex. genom att minimera autofluorescens genom modifiering av fixeringsförhållandena och användningen av släckningsreagens. Dessutom är det viktigt att minimera icke-specifikt bundna fluoroforer, vilket kan göras genom att justera etikettkoncentrationer, inkubationstider och blockerings-och tvättningssteg.
Det andra steget i bilden förvärvet är också kritisk. De optimala inställningarna på mikroskop kommer att bero på färgämnet, buffertbetingelser, märkning densitet och provtyp, t.ex. monoskikt på glas, celler eller vävnadsprover. De viktigaste överväganden är kamera exponeringstid, ramnummer, infallsvinkel (TIRF, Hilo, Epi) och lasereffekt. Målet är att så snabbt som möjligt samla så många ljusa blinkar rumsligt separerade. Om bakgrunden is mycket höga eller blinkar är inte mycket ljus, med andra ord den signal-till-brus-förhållande är dålig, återuppbyggnaden algoritmen kommer inte att kunna lokalisera positionerna så noggrant. Förutom att maximera lokalisering precision, dvs noggrannheten med varje molekyl läge kan mätas, beror bildkvalitet även på ett stort antal lokaliseringar. Om ett tillräckligt antal av molekylerna av intresse avbildas, antingen på grund av dålig effektivitet märkning, överdriven fotoblekning eller otillräcklig bildnummer, då den resulterande super-upplösning blir punktformig och diskontinuerliga som Nyquist kriterier inte har uppfyllts 14,27 .
Och slutligen, är det tredje steget, bildbehandling, särskilt viktigt i jämförelse med vanliga fluorescens mikroskopi tekniker. Det finns en rad fritt och kommersiellt tillgängliga algoritmer, vilket är både en fördel, när det gäller urval, och en nackdel, eftersom det kan vara förvirrande att veta which är lämpligast att använda. Om, till exempel rådata har väl fördelade spatialt distinkta blinkar sedan en enda molekyl passande algoritm kan vara mycket noggrann och effektiv, till exempel genom att de glesa passningsalgoritmer som finns i regnstorm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 och QuickPALM 26 programvara . Om rådata innehåller en hel del överlappande signaler sedan algoritmer som kan vara lämpligare inkluderar DAOSTORM 34, 3B 35 och deconSTORM 36. Dessutom är dessa algoritmer innehåller gränsvärden för olika kriterier såsom signal räknas, eller fotoner per blink, samt olika bildvisningsalternativ som visualisera med utjämnade Gaussfunktioner eller som histogram med pixelstödraster, där super-upplösning pixelstorlek kan vara som valts av användaren. Alla dessa alternativ ändra utseendet på den slutliga bilden och har implikationer för bildtolkning och analys.
<p class="jove_content"> Därför presenterar vi tre testprover som kommer att ge den nya användaren med en utgångspunkt för färgbaserade lokaliseringsbaserade super-upplösning experiment, som för tydlighetens skull kommer vi refererar till som STORM, och mer erfarna användare möjlighet att ytterligare optimera sina experiment. För det första är det möjligt att belägga ytan av glaset med en fluorescerande skikt av dextran-färgämne-konjugat. Detta ger ett snabbt och enkelt sätt att fastställa att mikroskopet, färg och buffert arbetar för att generera blinkande fluorescerande signal. Metoden kan därefter förlängas genom att jämföra medel lokalisering precision och siffermått som genereras av häftigt regn för att optimera buffertförhållanden, bildupptagning inställningar och testa olika färgämnen. För det andra presenterar vi ett enkelt protokoll för beredning av aktin filament på glas som lätt kan märkas med hjälp phalloidin-färgämneskonjugat. Dessa ger idealiska strukturer för att ta mätningar av upplösningen 27 och typiskt full bredd halv max (FWHM)av en glödtråd ges som en empirisk uppskattning av upplösning 37. Det bör noteras att upplösning varierar mellan prover och mellan bilder i samma prov eftersom upplösningen i lokaliseringsbaserade super-resolution mikroskopi är en funktion av fluorofor ljusstyrka, bakgrundsbrus och lokalisering densitet 27 och dessa är inte nödvändigtvis konstant under provet. Aktin filament används för att påvisa eventuella artefakter såsom mislocalizations och drift och hur de kan identifieras med programfunktioner inom regnstorm. Dessutom beskriver vi användning av fluorescerande referensmarkörer för både mäta och korrekt drift. Och för det tredje, färgning av celler med epidermal tillväxtfaktor (EGF)-färgämneskonjugat beskrivs. EGF ger en användbar indikator på superupplösning bildprestanda, eftersom en del av receptorn på cellytan genomgår endocytos via vesiklar, som är sub-diffraktion stora strukturer på cirka 50-150 nmi diameter 27,38,39.Vi visar med några enkla testproverna och den fritt tillgänglig process programvara regnstorm är det möjligt att optimera STORM super-resolution imaging. Dessa verktyg och metoder kommer att ge användbara utgångspunkter för nya användare och sätt för erfarna användare för att öka förtroendet för deras mikroskop och användningen av dem för att studera biologiska och cellulära strukturer med oöverträffad detaljrikedom. Genom att använda en kombination av prover med kända eller väl förstådda strukturer och en algoritm som kan producera ett antal användbara bildkvalitetsmått, till exempel medel precision beräkningar, lokaliseringsnummer och histogram som visar att det är möjligt att förbättra bildkvaliteten och för att ha större förtroende i STORM avbildningsprocessen. Det finns ingen one-size fits all strategi att förvärva data som det finns ett antal olika kommersiella och hemmabyggda mikroskop konfigurationer som kan användas. Dessutom finns det många provberedning och bildförvärvssteg som kan påverhet den slutliga bilden därför att ha programverktyg och testprover är avgörande för att förstå och optimera STORM bildkvalitet.
Utöver dessa protokoll kan ge användbara och mindre tvetydiga sätt att felsöka eventuella problem som kan uppstå. Till exempel dextran provet är ett mycket användbart sätt att fastställa om det finns någon laserstråle felinriktning eller ojämn belysning av provet. Om det finns farhågor om att kopplingsbufferten inte kan arbeta en mycket enkel visuell test för att se om det finns någon "blinkar" kommer att hjälpa. Aktin filament är ett bra sätt att mäta upplösning med FWHM jämförelser samt att belysa driv och mislocalization artefakter. Dock bör det noteras att eftersom lokaliseringsbaserade super-upplösning metoder kan vara fluoroforen densitet känsliga, utan hinder av andra bidragande faktorer, såsom exponeringstider, bildhastighet, lasereffekter och hur bilden behandlas, är det omöjligt att tilldela en resolution om att ensärskilt mikroskop och anta att alla bilder kommer att ha den upplösningen. Vad är möjligt, dock, är att mäta olika aspekter av upplösning såsom medellokaliserings precisioner, lokaliseringsnummer och drift 27. Även om referensmarkörer inte kan införlivas i varje experiment de kan, åtminstone, att användas för att karakterisera ett mikroskopsystem, dess miljö och bättre förstå de operativa överväganden som hur mycket tid som krävs för att uppnå termisk jämvikt efter uppstart. Förutom att korrigera för lateral avdrift kan referenspunkternas markörer användas för att karakterisera och korrigera för axiell avdrift, även om detta kräver användning av en astigmatisk lins och en återkopplingsmekanism för att korrigera provposition medan bilderna låtande 43. Kommersiella super-upplösning system innefattar vanligen någon form av stabilitetskontroll eller fokusera-låsmekanism, som kan vara en mer praktisk lösning för att korrigera fokus drift.
Det finns enre alternativ till ospecifikt belägga glaset med dextran, som att använda färgämnen direkt eller andra konjugerade molekyler, såsom sekundära antikroppar. En begränsning av dessa tillvägagångssätt är att antalet molekyler bundna till glaset är inte känd. Alternativa trådlika strukturer som har använts inkluderar mikrotubuli 28 och DNA 21. Men kombinationen av mycket liten storlek och bekväma kommersiellt tillgängliga reagenser gör aktin ett attraktivt alternativ, särskilt som avståndet av divergerande eller grenade trådar kan också vara ett användbart mått på systemets prestanda 27.
Det finns utrymme för ytterligare utveckling av testprover, trots den senaste tidens framsteg inom detta område 28,29,46,47. Särskilt innehåller flera färgbilder ett antal utmaningar i alla tre viktigaste aspekterna av bildbehandling, provmärkning, bild förvärv (hårdvara) och programvara (bildbehandling och anpassning). Det har en varitett antal publikationer som behandlar dessa aspekter 4-6 och det är därför klart att lämpliga testprov och metoder är avgörande för att generera och tillförlitligt tolka dessa typer av bilder. I själva verket, som nyligen visades att dSTORM skulle kunna användas för att ta två färgbilder av, och lösa, den mycket symmetriska karaktären hos den nukleära por komplex och författarna föreslog att detta skulle vara ett idealiskt sätt att bedöma resultat av kromatisk aberration korrigeringar 45. En annan intressant metod är att använda DNA-origami för att skapa en nanoruler, vilket skapar möjlighet till positionering fluoroforer vid specifika sub-diffraktion avstånd från varandra 46. Detta ger ett sätt att bedöma upplösning och gör avståndsmätningar. Dock är det yttersta syftet att tillämpa dessa superupplösning tekniker för att icke-idealiserade prov, exempelvis celler, som är komplicerade tredimensionella strukturer. I detta fall kan en kombination av mer grundlig förståelse av than teknik i kombination med programvaruverktyg som hjälper användaren att skaffa information, bearbeta den på lämpligt sätt, och ger bild mått sannolikt är det ultimata svaret. 28,29,47,48
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner finansiering från kemi-och bioteknik Metrology program av Storbritanniens nationella mätningskontoret. Vi tackar Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi och Eric Rees för teknisk rådgivning och förslag. Vi tackar Miklos Erdelyi, Eric Rees och Max Ryadnov för hjälpsamma kommentarer och diskussioner om detta manuskript.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
*Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
Table 1. Materials & Equipment | |||
[header] | |||
PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
EGF – Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
Formaldehyde – 10% solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
Table 2. Reagents |