Stereotaktisk Mikroinjektion af virale vektorer, der udtrykker Cre recombinase at undersøge den rolle, målgener i Kokain Konditioneret Place Preference

Summary

Denne artikel beskriver, hvordan microinject virale vektorer i muse hjerne og derefter teste i klimatiseret sted præference paradigme, der omfatter en erhvervelse, udryddelse, og genindsættelse fasen.

Abstract

Mikroinjektion rekombinante adenoassociated virale (rAAV) vektorer, der udtrykker Cre recombinase i særskilte mus hjerneområder til selektivt knockout gener af interesse giver mulighed for øget tidsmæssigt og regionalt specifikke kontrol af gendeletion sammenlignet med eksisterende metoder. Mens betinget sletning også kan opnås ved parring mus, der udtrykker Cre recombinase under kontrol af specifikke genpromotorer med mus, der bærer en floxet gen, stereotaxic mikroinjektion mulighed for målretning af diskrete områder i hjernen på forsøgslederen fastlagte tidspunkter af interesse. I forbindelse med kokain conditioned sted præference og andre kokain adfærdsmæssige paradigmer såsom selvadministration eller psykomotorisk overfølsomhed, der kan involvere tilbagetrækning udryddelse og / eller genindsættelse faser er denne teknik særligt nyttigt i at udforske den unikke bidrag target gener på disse særskilte faser af adfærdsmæssige modeller for kokain-induceret plasticitet. Specifiktdenne teknik giver mulighed for selektiv fjernelse af målgener under diskrete faser af en adfærd til at teste deres bidrag til adfærden tværs af tid. I sidste ende, denne forståelse giver mulighed for mere målrettede lægemidler, der er bedst i stand til at løse de mest potente risikofaktorer, der præsenterer sig selv i hver fase af vanedannende adfærd.

Introduction

Kokain er et stærkt forstærkende psykostimulerende. Efter gentagen eksponering, forekomme flere molekylære og cellulære tilpasninger i belønning-relevant hjernen kredsløb, der menes at resultere i kompulsiv narkotika-søger adfærd, hvilket fik høje tilbagefald, der udgør et alvorligt klinisk problem ^1.. Kokain udøver disse langvarige adfærdsmæssige effekter ved regulering af genekspression. At studere de tilpasninger, der opstår fra kronisk brug af kokain, har prækliniske gnavermodeller været brugt i udstrakt. En sådan model er den betingede sted præference (CPP) paradigme. Denne model indebærer udvikling af en lært forening mellem en tidligere neutralt miljø og givende egenskaber kokain. Efter flere fodboldmesterskaber af kokain med en bestemt kammer er dyr lov til frit at udforske kokain-parret og har non-kokain-parret miljøer, og hvis de foretrækker narkotika parrede rum, er de siges at have erhvervet en kokain-induceret place præference. Desuden efter en udslettelse træningsperiode, kan dette paradigme bruges til at studere kontekst-specifikke genindsættelse af kokain-søger adfærd.

Sammenlignet med andre adfærdsmæssige modeller af vanedannende-lignende adfærd, såsom psykomotorisk sensibilisering, som bruges til at studere langsigtet kokain-induceret adfærdsmæssige og molekylær plasticitet ^2,3 og selvadministration (SA), der menes at mere præcist efterligne vanedannende -lignende adfærd hos mennesker, er CPP paradigme en enkel procedure til at studere kokain kontekstuelle læring ^4.. CPP protokoller kan bekvemt udvides til at omfatte udryddelse og genindsættelse faser ligeledes til SA, som giver mulighed for undersøgelse af de underliggende mekanismer narkotika trang og tilbagefald ^5-7 og som menes at rekapitulere aspekter af, hvad der sker i humant lægemiddel-søgende adfærd og narkotika - og cue-induceret tilbagefald ^8-10.

En mekanisme, der ligger til grund forkokain-induceret adfærdsmæssige plasticitet, der er karakteristisk for hver af de forskellige faser af CPP, herunder erhvervelse, udryddelse, og genindsættelse, er aktivering af unikke signaturer genekspression inden for forskellige områder af hjernen. Til direkte teste, hvilke gener inden belønning-relevante områder af hjernen medierer kokain-induceret adfærdsmæssige ændringer, er det nyttigt at være i stand til at manipulere dem selektivt i et regionalt-specifik måde. En måde at opnå dette på er at microinject rekombinante adenoassociated viral (rAAV)-vektorer, der udtrykker Cre-rekombinase med stereotaktisk kirurgi, i særskilte områder i hjernen af ​​mus, der har målgener flankeret af loxP sites (floxet mus). Denne metode giver mulighed for meget præcis tidsmæssig og regional kontrol over, hvornår og hvor generne er poleres, i både delende og ikke-delende neuroner, uden at inducere immunresponser ^11-13. Dette niveau af kontrol er en vigtig fordel i forhold til traditionelle Cre-LoxP teknologi af ynglende floxet mus wed mus, der udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af et endogent gen promotor, idet timingen og fordelingen af ​​gendeletion kan mere stramt reguleret. Derudover viral vektor-medieret gen knockout omgår potentielle udviklingsmæssige kompenserende virkninger, der kan opstå ved brug af traditionelle knockout strategier.

Foruden kokain CPP, som er beskrevet her, mikroinjektion af rAAV-Cre ind i hjernen på mus floxet at vurdere betydningen af ​​specifikke gener kan anvendes ubikvitært til adfærdsmæssige paradigmer, der involverer separate faser, herunder selvadministration og psykomotorisk sensibilisering. For eksempel har vores laboratorium udnyttet rAAV-Cre teknologi at undersøge den rolle, Ca _{V 1.2} L-type ^{Ca2 +-kanaler} i kokain psykomotorisk sensibilisering ^14. Specifikt blev rAAV-Cre mikroinjiceres i nucleus accumbens (NAC) i mus med genet, som koder Ca _v 1.2 floxet at påvise, at Ca _v 14,15. Dog kan rAAV-Cre strategi ikke anvendes, hvis mus med en floxet gen af interesse ikke eksisterer, som var vores erfaring, når vurderingen rolle Ca _{V 1.3} L-type ^{Ca2 +-kanaler} i psykomotorisk sensibilisering. Dermed en begrænsning af anvendelse rAAV-Cre præsenterer sig selv hvis betingede mus, ikke eksisterer for et bestemt gen af ​​interesse. Men rAAVs der udtrykker siRNA kan bruges til at Knockdown target gener, som vi har gjort for at undersøge, hvilken rolle Ca _{V 1.3} kanaler ^14,15.

Mikroinjektion rAAV-Cre i adskilte områder af hjernen i floxet mus og derefter teste dem i CPP paradigme tillader undersøgelse af de specifikke gener, der medierer de forskellige faser af vanedannende-lignende adfærd, og hvor de handler. Brug af dette paradigme har hjulpet i vores forståelse af, hvordan gentagen kokain administration i det væsentlige hijacks brains belønning kredsløb forårsager utilpasset forandringer i molekylær signaltransduktionsveje og genekspression, der fører til den afhængige tilstand ^1,16,17.

Protocol

Alle procedurer udføres i overensstemmelse med Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care og brugervilkår udvalgets regler.

1.. Forberedelse og opsætning for stereotaktisk Levering af virale vektorer

1. Hvis et instrument, steril podepind, eller hånd iført sterile handske er forurenet med at komme i kontakt med en ikke-steril overflade, kasseres eller re-sterilisere instrumentet ved hjælp af en varm perle sterilisator, kasseres vatpind eller skifte til nye sterile handsker.
2. Placer en mus bur med strøelse på en varmeblok at varme for det postoperative forløb.
3. Oprette elektrisk barbermaskine til barbering hoved og ethanol og iod at sterilisere hovedbunden.
4. Tør øre barer og mund fat i stereotax med 70% ethanol.
5. Ved hjælp af en 5 ul Hamilton sprøjte udarbejde 5 ul viral vektor (1 x 10 ⁶ viruspartikler / ul), og oprettet i sprøjteholderen på stereotax.
6. Mikrobølgeopvarmning pad eller slå elektrisk pad på ennd sted på stereotax. Dæk med en ren absorberende pude for at reducere risikoen for forbrændinger. Monitor muse kropstemperatur (mellem 97-99,5 ° F) ofte hele proceduren.
7. Injicere mus (vejer mellem 22-35 g) med en blanding af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (20 mg / kg). Når en mus er bedøvet, at knivspids halespids kontrollere musens reflekser og notere enhver bevægelse eller reaktion for at sikre, at musen er tilstrækkeligt bedøvet.
8. Shave hoved mellem ører og øjne.
9. Ren barberet hoved med vekslende ethanol og jod sterile bomuld applikatorer.
10. Overfør musen til opvarmet pad på stereotax.

2.. Stereotaktisk mikroinjektion af virale vektorer

1. Bære sterile handsker hele operationen. Hvis handskerne er forurenet på noget tidspunkt ved at røre usterile overflader skifte handsker.
2. Zero tand bar og øre bar skalaer.
3. Set tænder tand bar.
4. Skru næsepartiet. Hvis vrikker eller knurhår flytteling bemærkes helst administrere en ip boosterdosis (~ 0,05 cc) af en blanding af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (20 mg / kg).
5. Skru øre barer.
6. Smør øjne med PuraLube.
7. Skær åben hovedbund til lige bag ørerne med en skalpel.
8. Place bulldog clips på hjørnerne i hovedbunden at skrælle huden væk fra kraniet. Bregma og lambda skal være let synlige.
9. Sørg sutur fra bregma til lambda er justeret lige. Hvis suturen er skævt genjusteres positionering af hovedet.
10. Kontroller, at alle indstillinger på stereotax nulstilles.
11. Sæt nålespidsen på plads i bregma.
12. Måle alle koordinater for både bregma og lambda. Dette omfatter dorsale / ventrale mediale / laterale og anteriore / posteriore koordinater.
13. Juster hoved, indtil de ventrale koordinater for bregma og lambda er inden 0,02 mm fra hinanden.
14. Når justeret, gå fra bregma medialt ud til mediale / laterale (M / L) koordinater. Sørgvenstre og højre side er afstemt inden 0,02 mm fra hinanden.
15. Re-center nålespids på bregma og derfra bevæger sig i den forreste / bageste (A / P) retning til den ønskede anteriore / posteriore koordinat.
16. Hvis det er nødvendigt, vinkel nål i den ene retning, og sørg for stereotax er låst. Gå ud til venstre M / L koordinat (+ / - 1,52)
17. Måle ventrale position af toppen af ​​kraniet at bruge den som reference, når borehullet bores.
18. Bore et borehul ved hjælp af en steril borehoved ved den ønskede koordinat. Kontrollere, at nålen kan indtaste uafbrudt gennem kraniet.
19. Sænke nålen til den ønskede ventrale koordinat.
20. Når koordinaterne er nået, dip 0,015 mm under for ~ 10 sek for at skabe en lille lomme til virusvektoren.
21. Injicere den ønskede mængde af viral vektor med en hastighed på ~ 0,1 ul / min. Vent 3 minutter for viral vektor til at diffundere fuldstændigt. Hæv nålen spids 0,015 mm og vente yderligere 2 min.
22. Dyp nål (hvis gør vinklede injektioner) i den modsatte retning. Igen, registrerer den ventrale position som en reference for den øverste del af kraniet.
23. Gentage de samme trin som på den første side at injicere viral vektor på den modsatte side (hvis gør bilaterale injektioner).
24. Påfør knogle voks til begge huller til at forsegle dem ved hjælp af træ ende af en steril bomuld applikatorspidsen.
25. Sy hovedbunden.
26. Påfør nerve blok til sårede område.
27. Fjern musen fra stereotax og plads i opvarmet bur på varmeblok at inddrive i 45 min.
28. Monitor for tegn på smerte, herunder: faldt samlet aktivitet eller rastløshed, nedsat mad og vand forbrug eller øget vokalisering. Buprenorphin (0,05-0,2 mg / kg) indgives to gange dagligt i en uge, hvis nødvendigt for smerter. Acceptable alternativer omfatter: meperidin (20-60 mg / kg), pentazocin (10 mg / kg), nalbuphin (4-8 mg / kg).

3.. Betinget Place præference: KØBn, Extinction og genindsættelse

1. Sted mus ind i centrale kammer i et tre-kammer sted præference apparat (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) for en 60 sek tilvænningsperiode med guillotinen døre lukket.
2. Efter tilvænning, åbne guillotinen døre og tillade mus fri udforskning af alle 3 kamre til 1.200 sek, med tiden tilbragt i hvert kammer, der optages ved hjælp MedPC IV-software (Med Associates, Inc.).
3. Tildel mus conditioning kamre baseret på deres præstationer i pre-test. Ved hjælp af en forspændt konstruktion, pair lægemiddeladministration i de efterfølgende 3 dage med det rum, der var mindst foretrukket under baseline præ-test.
4. I løbet af de næste 3 conditioning dage injicere mus med kokain (10 mg / kg, ip) i løbet af formiddagen session og begrænse dem i deres tildelte kammer til 1.200 sek umiddelbart efter injektionen. Retur mus til deres hjem bure efter sessionen. Efter 4 timer, injicere mus med saltvand (0,01 ml / glegemsvægt) og begrænse dem til det modsatte kammer til 1.200 sek eftermiddag.
5. For at teste for erhvervelse, placere mus i det centrale kammer med guillotinen dørene lukket for en 60 sek tilvænningsperiode. Åbne guillotinen døre og tillader fri udforskning for 1.200 sek med tiden tilbragt i alle kamre indspillet af MedPC IV software (Med Associates, Inc.). Beregn præference ved at fratrække mængden af ​​tid brugt i saltvand parrede kammer fra mængden af ​​tid tilbragt i kokain-parret kammer.
6. At slukke stedet præference, udsætte mus til to 20 min sessioner af fri udforskning dagligt i samme apparat, adskilt af mindst 2 timer, der begynder 24 timer efter testen for erhvervelsen. Tid brugt i alle kamre igen skal noteres, og størrelsen af ​​den oprindelige CPP bør sammenlignes med, at hver udslettelse session.
7. Afgør om mus har slukkede narkotika-induceret præferencer ved vurderingen af, om præference for et parsærlig kammer over to på hinanden følgende udslettelse dage er betydeligt lavere i forhold til købet præference score.
8. Genindføre mus med en priming dosis af kokain (5 eller 10 mg / kg, ip) og re-udsættes for apparatet tillader fri udforskning og registrere tidsforbruget i hvert rum.
9. Administrere Euthasol eutanasi opløsning (150 mg / kg). Transcardialt perfundere mus med 4% paraformaldehyd (PFA) og udføre en histologisk undersøgelse for at validere korrekt mikroinjektion placering.

Representative Results

CPP

Efter at have udført CPP om mikroinjicerede mus, bør man kontrollere, at den kohorte af kontrol-injicerede (rAAV-GFP) mus normalt have erhvervet præference for narkotika parrede kammer (figur 1A, 1B). Mus anses for at have erhvervet præference for en bestemt kammer, når kokain præference (tid i kokain-parret kammer minus tid brugt i saltvand parret kammer) er betydeligt højere sammenlignet med baseline præference score (figur 1B, A vs B) . Hvis vi, som en kohorte, gør kontrol-injicerede mus ikke vise en præference for kokain-parrede kammer, eller vis en aversion, bør placeringen kontrolleres omgående via histologi (se rAAV Indsprøjtninger underafsnit), og mus med forkert placering skal kasseres.

Hvis præference har været normalt erhvervet af kontrol-indsprøjtning kohorte, kan man efterfølgende udvide paradigmet ved begyndelsen uddøen (figur 1A (figur 1B, E3, E4, E5 vs A). På dette tidspunkt, kan man genindføre med et lægemiddel prime (figur 1A, 1B). Hvis præference score efter administration af lægemidlet prime er statistisk ikke skelnes fra det ved erhvervelsen, så at kohorte siges at have genindført lægemiddelinduceret præference for lægemiddel-parrede kammer (figur 1B, R vs A).

rAAV microinjections

Før forfølge rAAV-Cre eksperimentelle strategi inden nogen adfærdsmæssige paradigme bør man kontrollere, at rAAV-Cre har faktisk slået ud genet af interesse i mikroinjicerede mus ved qPCR (figur 1C) og / eller Western blot eller immunhistokemisk analyse ^{18 <}/ Sup>. For eksempel, efter mikroinjektion af rAAV-Cre-GFP i NAC af mus, der havde L-typen calciumkanal isoform Ca _mod 1,2 floxet rAAV-Cre injicerede stempler viser et signifikant fald i genekspression (fig. 1C). Derudover har vi vist ved immunhistokemisk analyse, at rAAV-Cre kan knockout Ca _v 1.2 protein i musehjernen ^18. Efter alle de adfærdsmæssige analyser bør musene transcardialt perfunderet med 4% paraformaldehyd og fluorescerende immunhistokemi bør udføres for grønt fluorescerende protein (GFP). Hvis bilaterale strukturer blev målrettet, bør en korrekt bilateral placering verificeres ved fluorescerende immunhistokemisk farvning (figur 1D, repræsentativt målretning af NAC). Hvis det korrekte område faktisk har været målrettet, bør farvning kan visualiseres udelukkende i beregnet regionen og ikke uden for det. Hvis en eller begge af injektioner er off-mål, bør mus tilbagevirkende kraftly udelukket fra CPP datasæt. En anden strategi til visualisering af præcise målretning af virale vektor-inficerede områder af hjernen og efterfølgende dissektion af det inficerede område for biokemiske analyser, kan opnås ved hjælp af en GFP-lysende lommelygte, som beskrevet i Li og Wolf (2011) ^19.

Figur 1A. Eksperimentel tidslinje for rAAV-Cre mikroinjektion og aircondition sted præference erhvervelse, udryddelse og genindsættelse faser. RAAV-Cre er mikroinjiceret i regionen af interesse 2-3 uger forud for indledningen af adfærdsmæssige test. Betinget sted præference begynder med en pre-test for at fastslå eventuelle indledende fordomme, efterfulgt af 3 dages konditionering med kokain (10 mg / kg, ip). Fire timer efter hver kokain conditioning session, musbehandles med saltvand og begrænses til det modsatte kammer. Den følgende dag mus testes for erhvervelse af en CPP. Extinction træning begynder 24 timer senere, og involverer 2 daglige sessioner, der er adskilt af mindst 2 timer, der tillader fri adgang til hele apparatet. Når mus har nået udslettelse kriterium, administreres de en priming injektion af kokain (10 mg / kg, ip) og deres tid i alle kamre i apparatet vurderes at teste for genindsættelse af kokain-søgende adfærd. Figur 1B. Repræsentative resultater af baseline blev erhvervelse, udslettelse uddannelse og genindsættelse. WT C57BL/6J-mus behandlet med kokain i løbet af dag 2, 3 og 4 i condition. Mus udstillet erhvervelse, udslettelse og kokain-induceret genansættelse (10 mg / kg ip kokain prime). *** P <0,001 i forhold til baseline (B) # p <0,05 versus erhvervelse (A). Baseline, B, Acquisition, A, Extinction, E, genindsættelse, R. Figur 1C. Stereotaxic levering af rAAV-Cre-GFP i NAC for Ca _{V 1.2} floxet mus faldt betydeligt Ca _v 1.2 mRNA. Homozygote Ca _{V 1.2} floxet mus blev mikroinjiceret med kontrol (rAAV-GFP) eller eksperimentelle (rAAV-Cre-GFP) virale vektorer . Efter maksimal Cre aktivering blev musene aflivet, og mRNA blev isoleret og relative ekspressionsniveauer blev undersøgt via kvantitativ polymerasekædereaktion under anvendelse Ca _{V 1.2} specifikke primere. Stereotaktisk levering af rAAV-Cre-GFP i NAC af Ca _{V 1.2} floxet mus faldt betydeligt Ca _{V 1.2} mRNA niveauer i forhold til mus injiceret med AAV-GFP. † † p <0,001 versus rAAV-GFP. Figur 1D. Neuroner mikroinjiceres med rAAV-GFP i muse NAC. Homozygote Ca _{V 1.2} floxet mus blev mikroinjiceret med rAAV-GFP at kontrollere for en korrekt bilateral placering i NAC. Mus blev perfunderet med 4% PFA og immunhistokemi blev udført. GFP farvning demonstrationTES korrekt bilateral målretning af NAC. Klik her for at se større figur .

Discussion

Regionalt og tidsligt-specifikt gen ablation via stereotaxic mikroinjektion af virale vektorer kombineret med CPP, der omfatter udryddelse og genindsættelse faser muliggør undersøgelse af de specifikke bidrag fra gener til tre forskellige faser af vanedannende-lignende opførsel. Mens betingede knockout, der er opnået udnytte den traditionelle Cre-LoxP system giver for spatio-tidsmæssigt begrænset gen ablation, stereotaksisk mikroinjektion Cre-recombinase i adskilte dele af hjernen hos floxet mus giver mulighed for endnu større kontrol over, hvornår og hvor et gen er slået ud. Desuden er denne omgår muligheden for kompenserende forandringer under udviklingen, som til tider tegner sig for begrænset fænotypisk variation observeret i knockout-mus. Desuden kan bruge kohorter af mus, der blev mikroinjiceret på forskellige tidspunkter i løbet af den adfærd, give mulighed for årsagssammenhænge, ​​der skal foretages mellem en ændring i genekspression og en adfærdsændring. Importantly, kan denne teknik anvendes på flere forskellige kokain adfærdsmæssige paradigmer, herunder selvadministration og psykomotorisk sensibilisering.

Det er vigtigt at vente mindst 10-14 dage efter kirurgi for at sikre, at maksimal aktivering af Cre rekombinase er forekommet ^20. Begyndelsen adfærdsmæssige test forud for dette kan resultere i anvendelsen af ​​mus med en ukendt mængde af sub-maksimal Cre ekspression, hvilket gør adfærdsmæssige resultater vanskeligt at fortolke. Maksimal aktivering af Cre resulterer i fuldstændig knockout af et gen, men dette sker kun i celler, der er i virkeligheden smittede. Afhængigt af mængden og titeren af den virale vektor er ca 50-70% af celler inficeret for en given region resulterer i den tilsvarende mængde af mRNA og protein knockout hvilket kan føre til nogle resterende genekspression (fig. 1C). Vi har imidlertid vist, at en 50-60% mRNA denne type knockout er tilstrækkelig til at ændre ekspressionaf psykomotorisk sensibilisering ^14.. Desuden giver denne metode er ideel til længere adfærdsmæssige paradigmer som når Cre aktivering forekommer in vivo, udtrykket og det tilsvarende gen knockout varer mindst 6 måneder ^21.

Hvis man er interesseret i at undersøge rollen af ​​et gen i en mere diskret tidsperiode dog, at det ikke er muligt med denne metode. For kortere sigt ekspression, herpes simplex virus (HSV) vektorer kan anvendes, som fortrinsvis inficere neuroner ^22.. Sammenlignet med rAAV udtryk for Cre rekombinase, som varer i længere perioder, da initiativtageren ikke dæmpes efter dage eller uger i vivo ²³ er HSV-vektorer foretrækkes til transient udtryk som de udtrykker in vivo for dage. HSV-vektorer er også fordelagtige ved, at de udviser en bred transduktion effektivitet og at hjælper virusfri bestande findes ^22. Desuden kan HSV-vektorer også udtrykke Cre recombinase og mægle excision af floxet sekvenser både i kultur og in vivo ^24.. Imidlertid har lejlighedsvis cytotoksicitet fundet.

Næsten enhver region i hjernen kan målrettes ved hjælp af denne mikroinjektion teknik. Når man forsøger at målrette mindre underområder i et større område, kan man nødt til at optimere mængden af ​​viral anvendte vektor. For eksempel mikroinjiceret vi 0,5 pi rAAV-Cre-GFP at målrette NAC og ventrale tegmentalområde (VTA) ^14, mens når målretning større strukturer såsom hippocampus og cortex, brugte Ahmed og kolleger ²⁰ 0,8 pi rAAV-Cre. Alternativt undersøge forskellige serotype optioner, som hver har differentieret spredes og smitteevne egenskaber (se Choi et al. (2005) ²⁵ for gennemgang) kan hjælpe med at målrette en mindre, mere afgrænset område. Omvendt, hvis forsøger at målrette et større område, kan man øge mængden af ​​virusvektoren mikroinjiceres. Dette har jegs mere effektiv end at udnytte højere vektor titre, som de sandsynligvis give yderligere infektioner per celle i modsætning til et større antal af de samlede celler inficeret ^22.. Derudover kan man udføre flere injektioner inden for en region eller på tværs af flere regioner, for mere effektivt at inficere et større område ^26.

Brug af rAAV-vektorer er også fordelagtig, når sammenlignet med andre virale vektorer, der anvendes til at undersøge hjernens funktion og sygdom. Specifikt traditionelle adenovirusvektorer vist sig vanskeligt i de inducerede alvorlige inflammatoriske responser, mens andre vektorer, såsom retrovira og lentivirus kan involvere problemer med insertionsmutagenese. rAAV er en godartet parvovirus, og der er ingen kendt sygdom er forbundet med rAAV-infektion. Desuden, i modsætning til andre virale vektorer, forekommer transduktion med rAAV uden ekspressionen af native AAV virusproteiner ^27, hvilket sekundære virkninger på målceller meget mindre af en bekymring.rAAV-vektorer kan fremstilles i høje titere og kan transducere post-mitotiske neuroner i hjernen i et stærkt rumligt lokaliseret måde ^21,28. Desuden er rAAV vektorer nu genereres, som kan målrette specifikke undertyper af neuroner i musehjernen ²⁹ og Cre-afhængige rAAV ekspressionssystemer er også blevet mere udbredt (se Zhang et al. (2010) ³⁰ for gennemgang).

Sammenfattende tjener kokain CPP som en enkel men informativ adfærdsmæssige værktøj til at studere kokain kontekstuelle læring relevant for erhvervelse, udryddelse, og genindsættelse af kokain-søger adfærd. En kombination af at udnytte rAAV udtrykker Cre recombinase i mus, der bærer en floxet allel med CPP giver en stærk strategi for at udforske den rolle målgener i bestemte områder af hjernen, som medierer kokain søger adfærd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004