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Behavior

Cre recombinase कोकीन वातानुकूलित जगह वरीयता में लक्ष्य जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए व्यक्त वायरल वैक्टर की stereotaxic Microinjection

Published: July 30, 2013 doi: 10.3791/50600
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Graduate Program in Neuroscience, Weill Cornell Graduate School of Biomedical Sciences, 2Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, Weill Cornell Medical College

Summary

यह लेख माउस मस्तिष्क में वायरल वैक्टर microinject और उसके बाद एक अधिग्रहण, विलुप्त होने और बहाली चरण शामिल है कि एक वातानुकूलित जगह वरीयता प्रतिमान में परीक्षण करने के लिए कैसे करें.

Abstract

ब्याज की चुनिंदा पीटकर जीन को अलग माउस मस्तिष्क क्षेत्रों में Cre recombinase व्यक्त पुनः संयोजक adenoassociated वायरल (rAAV) वैक्टर Microinjecting मौजूदा तरीकों की तुलना में, जीन विलोपन का बढ़ाया अस्थायी और क्षेत्रीय स्तर पर विशिष्ट नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. सशर्त विलोपन भी एक floxed जीन ले चूहों के साथ विशिष्ट जीन प्रमोटरों के नियंत्रण में व्यक्त Cre recombinase, stereotaxic microinjection के हित के प्रयोगकर्ता निर्धारित समय बिंदुओं पर असतत मस्तिष्क क्षेत्रों को निशाना बनाने के लिए अनुमति देता है कि संभोग चूहों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. कोकीन वातानुकूलित जगह वरीयता, और इस तरह के आत्म - प्रशासन या वापसी, विलुप्त होने और / या बहाली के चरणों में शामिल कर सकते हैं कि मनोप्रेरणा संवेदीकरण के रूप में अन्य कोकीन व्यवहार मानदंड के संदर्भ में, इस तकनीक के इन अलग करने के लिए लक्ष्य जीन का अद्वितीय योगदान की खोज में विशेष रूप से उपयोगी है कोकीन प्रेरित plasticity के व्यवहार मॉडल के चरणों. विशेष रूप से,इस तकनीक समय में व्यवहार करने के लिए उनके योगदान का परीक्षण करने के लिए एक व्यवहार की असतत चरणों के दौरान लक्ष्य जीन के चुनिंदा पृथक के लिए अनुमति देता है. अंत में, यह समझ नशे की लत व्यवहार के प्रत्येक चरण के दौरान स्वयं उपस्थित कि सबसे शक्तिशाली जोखिम कारकों का पता करने के लिए सबसे अच्छा सक्षम हैं कि अधिक लक्षित चिकित्सा के लिए अनुमति देता है.

Introduction

कोकीन एक बेहद मजबूत psychostimulant है. कई बार प्रदर्शन के बाद, कई आणविक और सेलुलर रूपांतरों बाध्यकारी में परिणाम माना जाता है कि इनाम प्रासंगिक मस्तिष्क circuitry में होते दवा की मांग की एक गंभीर नैदानिक ​​समस्या 1 ढोंग जो पतन की उच्च दर के उत्साह, व्यवहार. कोकीन जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने से इन लंबे समय से स्थायी व्यवहार प्रभाव डाल रही है. पुरानी कोकीन के इस्तेमाल से पैदा होती है कि रूपांतरों का अध्ययन करने के लिए, पूर्व नैदानिक ​​कृंतक मॉडल बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. ऐसा ही एक मॉडल वातानुकूलित जगह वरीयता (सीपीपी) प्रतिमान है. यह मॉडल एक पहले से तटस्थ पर्यावरण और कोकीन से पुरस्कृत गुणों के बीच एक सीखा संघ का विकास शामिल है. एक विशेष कक्ष के साथ कोकीन के कई pairings के बाद, जानवरों आज़ादी कोकीन बनती और गैर कोकीन बनती वातावरण का पता लगाने के लिए अनुमति दी जाती है और वे दवा बनती डिब्बे पसंद करते हैं, वे एक कोकीन प्रेरित plac प्राप्त कर लिया है करने के लिए कहा जाता हैई वरीयता. इसके अलावा, एक विलुप्त होने के प्रशिक्षण अवधि के बाद, इस प्रतिमान कोकीन व्यवहार की मांग के संदर्भ विशेष बहाली का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस तरह के नशे की लत नकल अधिक सही माना जाता है कि लंबे समय तक कोकीन प्रेरित व्यवहार और आणविक plasticity के 2,3 और आत्म - प्रशासन (एसए) का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो मनोप्रेरणा संवेदीकरण,, के रूप में नशे की लत की तरह व्यवहार के अन्य व्यवहार मॉडल की तुलना में, जैसे मनुष्यों में पाया व्यवहार, सीपीपी प्रतिमान कोकीन प्रासंगिक सीखने 4 अध्ययन करने के लिए एक सरल प्रक्रिया है. सीपीपी प्रोटोकॉल आसानी इसी तरह दवा लालसा और पतन 5-7 और जो मानव में होता है के पहलुओं पुनरावृत्ति माना जाता है दवा व्यवहार की मांग और दवा अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए अनुमति देते हैं जो एसए करने, विलुप्त होने और बहाली के चरणों में शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है - और क्यू प्रेरित पतन 8-10.

एक तंत्र है कि underliesअधिग्रहण, विलुप्त होने, और बहाली सहित सीपीपी के अलग चरणों, प्रत्येक की विशेषता है कि कोकीन प्रेरित व्यवहार प्लास्टिसिटी, अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर जीन अभिव्यक्ति की अद्वितीय हस्ताक्षर की सक्रियता है. सीधे व्यवहार में बदलाव कोकीन प्रेरित मध्यस्थता इनाम प्रासंगिक मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर जो जीन का परीक्षण करने के लिए, यह एक क्षेत्रीय स्तर पर विशिष्ट ढंग से चुनिंदा उन्हें हेरफेर करने के लिए सक्षम होने के लिए उपयोगी है. इस को प्राप्त करने का एक तरीका यह व्यक्त Cre recombinase LoxP साइटों (floxed चूहों) द्वारा flanked लक्ष्य जीन है कि चूहों के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में, stereotaxic सर्जरी का उपयोग कर रहा है कि पुनः संयोजक adenoassociated वायरल (rAAV) वैक्टर microinject है. इस विधि जब और जहां जीन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 11-13 उत्प्रेरण के बिना, दोनों विभाजन और गैर विभाजित न्यूरॉन्स में, ablated कर रहे हैं पर बहुत सटीक लौकिक और क्षेत्रीय नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. नियंत्रण का यह स्तर floxed चूहों डब्ल्यू प्रजनन के पारंपरिक Cre पर LoxP प्रौद्योगिकी पर एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता हैउस में, एक अंतर्जात जीन प्रमोटर के नियंत्रण में Cre recombinase व्यक्त ith चूहों समय और जीन विलोपन का वितरण अधिक कसकर विनियमित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, वायरल वेक्टर की मध्यस्थता जीन पीटा पारंपरिक पीटकर रणनीतियों का उपयोग हो सकता है कि संभावित विकास प्रतिपूरक प्रभाव circumvents.

आत्म - प्रशासन और psychomotor संवेदीकरण सहित अलग चरणों, शामिल है कि व्यवहार मानदंड को सर्वत्र लागू किया जा सकता है विशिष्ट जीन की भूमिका का आकलन करने के floxed चूहों के मस्तिष्क में, यहाँ rAAV-Cre के microinjection वर्णन किया गया है जो कोकीन सीपीपी, के अलावा. उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला कोकीन मनोप्रेरणा संवेदीकरण 14 में सीए वी 1.2 एल प्रकार सीए 2 + चैनलों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए rAAV-Cre प्रौद्योगिकी का उपयोग किया गया है. विशेष रूप से, rAAV-Cre प्रदर्शित करने के लिए जीन एन्कोडिंग सीए वी 1.2 floxed साथ चूहों के नाभिक accumbens (एनएसी) में microinjected था कि सीए ध् 14,15 की अभिव्यक्ति चरण अभिनय. मनोप्रेरणा संवेदीकरण में सीए वी 1.3 एल प्रकार सीए 2 + चैनलों की भूमिका का आकलन करते समय ब्याज की एक floxed जीन के साथ चूहों मौजूद नहीं है हालांकि, अगर rAAV-Cre रणनीति इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, के रूप में हमारे अनुभव था. सशर्त चूहों ब्याज की एक विशेष जीन के लिए मौजूद नहीं है, इसलिए, अगर rAAV-Cre के उपयोग की एक सीमा में ही प्रस्तुत. हालांकि, हम सीए वी 1.3 चैनल 14,15 की भूमिका की जांच करने के लिए किया है के रूप में व्यक्त है siRNA, पछाड़ना लक्ष्य जीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि rAAVs.

Floxed चूहों की असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में rAAV-Cre Microinjecting और फिर सीपीपी प्रतिमान में उन्हें परीक्षण के विभिन्न नशे की लत की तरह व्यवहार के चरणों और जहां वे अभिनय कर रहे हैं कि मध्यस्थता विशिष्ट जीन की जांच के लिए अनुमति देता है. इस प्रतिमान का प्रयोग सार में दोहराया कोकीन प्रशासन br hijacks कैसे को समझने में हमारी सहायता प्राप्त हैains इनाम circuitry आदी राज्य 1,16,17 के लिए नेतृत्व कि आणविक संकेत पारगमन मार्ग और जीन अभिव्यक्ति में maladaptive परिवर्तन के कारण.

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के नियमों के अनुसार आयोजित की जाती हैं.

1. तैयारी और वायरल वैक्टर Stereotaxic डिलिवरी के लिए सेटअप

  1. एक उपकरण, बाँझ झाड़ू, या बाँझ दस्ताने पहने हाथ एक गैर बाँझ सतह के साथ संपर्क में आने से दूषित है, तो एक गर्म मनका अजीवाणु उपयोग कर साधन, त्यागने या फिर से बाँझ, झाड़ू त्यागने या नए बाँझ दस्ताने के लिए बदल जाते हैं.
  2. पोस्ट ऑपरेटिव वसूली के लिए गर्म करने के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर बिस्तर के साथ एक माउस पिंजरे रखें.
  3. खोपड़ी बाँझ सिर और इथेनॉल और आयोडीन हजामत बनाने के लिए बिजली के रेजर सेट करें.
  4. 70% इथेनॉल के साथ कान सलाखों और stereotax का मुंह पकड़ नीचे साफ कर लें.
  5. एक 5 μl हैमिल्टन सिरिंज का प्रयोग, वायरल वेक्टर (1 एक्स 10 6 वायरल कणों / μl) के 5 μl खींचना और stereotax पर सिरिंज धारक में स्थापित की.
  6. माइक्रोवेव हीटिंग पैड या एक पर बिजली पैड बारीstereotax पर एन डी जगह. जलने के जोखिम को कम करने के लिए एक साफ शोषक पैड के साथ कवर. मॉनिटर माउस शरीर का तापमान (97-99.5 ° एफ) के बीच अक्सर प्रक्रिया के दौरान.
  7. Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (20 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के साथ माउस (22-35 ग्राम के बीच वजन) इंजेक्षन. एक माउस anesthetized है एक बार, चुटकी पूंछ टिप माउस की सजगता की जाँच करें और माउस को पर्याप्त रूप से anesthetized है कि यह सुनिश्चित करने के लिए किसी भी आंदोलन या प्रतिक्रिया के लिए ध्यान दें.
  8. कान और आंखों के बीच सिर दाढ़ी.
  9. इथेनॉल और आयोडीन बाँझ कपास applicators के साथ बारी मुंडा सिर साफ करें.
  10. Stereotax पर गर्म पैड के लिए माउस स्थानांतरण.

2. वायरल वैक्टर की stereotaxic Microinjection

  1. सर्जरी के दौरान बाँझ दस्ताने पहनें. दस्ताने गैर बाँझ सतहों को छूने से किसी भी बिंदु पर दूषित कर रहे हैं, दस्ताने बदल जाते हैं.
  2. शून्य दांत बार और कान बार तराजू.
  3. दांत बार में दांतों के सेट करें.
  4. थूथन में भाड़ में. Wiggling या गलमुच्छा कदम हैंजाहिर है किसी भी समय पर ध्यान दिया जाता है, ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (20 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के एक आईपी बूस्टर खुराक (~ 0.05 सीसी) प्रशासन.
  5. कान सलाखों में भाड़ में.
  6. PuraLube साथ आंखों चिकना.
  7. करने के लिए सिर्फ एक स्केलपेल के साथ कान के पीछे खुले खोपड़ी काटें.
  8. त्वचा छील दूर खोपड़ी से खोपड़ी के कोनों पर जगह बुलडॉग क्लिप. शीर्षस्थान और लैम्ब्डा आसानी से दिखाई जानी चाहिए.
  9. शीर्षस्थान से लैम्ब्डा को यकीन है कि सिवनी बनाओ सीधे गठबंधन किया है. सिवनी सिर की कुटिल बदल डालना स्थिति है.
  10. Stereotax पर सभी सेटिंग्स को चुना जाता है सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें.
  11. पर्वबिन्दु पर जगह में सुई टिप रखो.
  12. शीर्षस्थान और लैम्ब्डा दोनों के लिए सभी निर्देशांक उपाय. यह उदर / पृष्ठीय, पार्श्व / औसत दर्जे का है और पूर्वकाल / पीछे निर्देशांक शामिल हैं.
  13. शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के लिए उदर निर्देशांक एक दूसरे का 0.02 मिमी के भीतर कर रहे हैं जब तक सिर समायोजित करें.
  14. एक बार (एम / एल) पार्श्व औसत दर्जे / निर्देशांक मध्यवर्ती पर्वबिन्दु से, बाहर जाने के गठबंधन. सुनिश्चित करेंबाएँ और दाएँ पक्ष एक दूसरे का 0.02 मिमी भीतर से जुड़ रहे हैं.
  15. पर्वबिन्दु पर और वहां से पुन: केन्द्र सुई टिप वांछित पीछे / पूर्वकाल समन्वय करने के लिए (ए / पी) पीछे / पूर्वकाल दिशा में चलते हैं.
  16. यदि आवश्यक हो, कोण एक दिशा में सुई और stereotax बंद कर दिया जाता है सुनिश्चित करें. (- 1.52 / +) बाएं एम / एल समन्वय के लिए बाहर जाओ
  17. बोरहोल drilled है के बाद एक संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए खोपड़ी के ऊपर के उदर स्थिति उपाय.
  18. वांछित समन्वय पर एक बाँझ ड्रिल बिट का उपयोग कर एक वेधन छिद्र ड्रिल. सुई खोपड़ी के माध्यम से निर्बाध रूप से प्रवेश कर सकते हैं की जाँच करें.
  19. वांछित उदर समन्वय के लिए सुई लोअर.
  20. एक बार समन्वय डुबकी 0.015 मिमी वायरल वेक्टर के लिए एक छोटी सी जेब बनाने के लिए ~ 10 सेकंड के लिए, नीचे पहुंच गया है.
  21. ~ 0.1 μl / मिनट की दर से वायरल वेक्टर के वांछित मात्रा इंजेक्षन. पूरी तरह फैलाना वायरल वेक्टर के लिए 3 मिनट रुको. सुई टिप 0.015 मिमी उठाएँ और एक अतिरिक्त 2 मिनट इंतज़ार करो.
  22. विपरीत दिशा में सुई (एंगल्ड इंजेक्शन कर रही हो तो) डुबकी. फिर, खोपड़ी के शीर्ष के लिए एक संदर्भ के रूप में उदर स्थिति रिकॉर्ड.
  23. (द्विपक्षीय इंजेक्शन कर रही हो तो) विपरीत दिशा में वायरल वेक्टर इंजेक्षन पहले पक्ष पर के रूप में एक ही कदम दोहराएँ.
  24. एक बाँझ कपास टिप applicator की लकड़ी के अंत का उपयोग कर उन्हें सील करने के लिए दोनों छेद करने के लिए हड्डी मोम लागू करें.
  25. खोपड़ी सिवनी.
  26. घायल क्षेत्र के लिए तंत्रिका ब्लॉक लागू करें.
  27. 45 मिनट के लिए ठीक करने के लिए गर्मी ब्लॉक पर गरम पिंजरे में stereotax से माउस और जगह निकालें.
  28. सहित दर्द के लक्षण के लिए मॉनिटर:, समग्र गतिविधि या बेचैनी कमी आई भोजन और पानी की खपत या बढ़ा वोकलिज़ेशन की कमी हुई. Buprenorphine (0.05-0.2 मिलीग्राम / किग्रा) यदि आवश्यक हो तो दर्द के लिए एक सप्ताह के लिए दैनिक दो बार प्रशासित किया जा सकता है. स्वीकार्य विकल्प शामिल हैं: meperidine (20-60 मिलीग्राम / किग्रा), pentazocine (10 मिलीग्राम / किग्रा), nalbuphine (4-8 मिलीग्राम / किग्रा).

3. वातानुकूलित जगह पसंद Acquisitioएन, विलुप्त होने, और बहाली

  1. गिलोटिन दरवाजे के साथ एक 60 सेकंड आदी होना अवधि के लिए एक तीन कक्ष जगह वरीयता तंत्र (मेड एसोसिएट्स इंक, सेंट Albans, VT, संयुक्त राज्य अमरीका) के केंद्रीय कक्ष में जगह चूहों बंद हुआ.
  2. आदी होना, खुले गिलोटिन दरवाजे के बाद और MedPC चतुर्थ सॉफ्टवेयर (मेड एसोसिएट्स, Inc) का उपयोग कर दर्ज की जा रही प्रत्येक कक्ष में बिताए समय के साथ 1,200 सेकंड के लिए सभी 3 कक्षों के चूहों मुक्त अन्वेषण, अनुमति देते हैं.
  3. पूर्व परीक्षण के दौरान उनके प्रदर्शन के आधार पर कंडीशनिंग कक्षों को चूहों निरुपित. आधारभूत पूर्व परीक्षण के दौरान कम से कम पसंदीदा था कि डिब्बे के साथ बाद में 3 दिनों के दौरान एक पक्षपाती डिजाइन, इस जोड़ी को दवा प्रशासन का उपयोग करना.
  4. सेकंड इंजेक्शन के बाद तुरंत 1200 के लिए सुबह के सत्र के दौरान और उनके सौंपा कक्ष में उन्हें सीमित; अगले 3 कंडीशनिंग दिनों के दौरान, कोकीन (आईपी 10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों इंजेक्षन. सत्र के बाद उनके घर पिंजरों में चूहों लौटें. 4 घंटे के बाद, (नमक के साथ चूहों इंजेक्षन 0.01 मिलीग्राम / छशरीर के वजन) और 1,200 सेकंड दोपहर के सत्र के लिए विपरीत चैम्बर के लिए उन्हें सीमित.
  5. अधिग्रहण के लिए परीक्षण करने के लिए, गिलोटिन दरवाजे के साथ केंद्रीय कक्ष में जगह चूहों एक 60 सेकंड आदी होना अवधि के लिए बंद कर दिया. ओपन गिलोटिन दरवाजे और MedPC चतुर्थ सॉफ्टवेयर (मेड एसोसिएट्स, Inc) द्वारा दर्ज सभी कक्षों में बिताए समय के साथ, 1,200 सेकंड के लिए स्वतंत्र अन्वेषण अनुमति देते हैं. कोकीन बनती कक्ष में बिताए समय की राशि से खारा बनती कक्ष में बिताए समय की राशि को घटाकर की वरीयता की गणना.
  6. जगह वरीयता बुझाने के लिए, अधिग्रहण के लिए परीक्षण के बाद 24 घंटे के लिए शुरुआत है, कम से कम 2 घंटे के द्वारा अलग एक ही उपकरण में दैनिक स्वतंत्र अन्वेषण के दो 20 मिनट के सत्र, के लिए चूहों को बेनकाब. सभी कक्षों में बिताए समय को फिर से दर्ज किया जाना चाहिए और प्रारंभिक सीपीपी की भयावहता प्रत्येक विलुप्त होने के सत्र के साथ तुलना किया जाना चाहिए.
  7. चूहों एक सममूल्य के लिए कि क्या वरीयता का आकलन करने से दवा प्रेरित वरीयता बुझा दिया है कि क्या यह निर्धारितलगातार दो विलुप्त होने के दिन भर ticular कक्ष अधिग्रहण वरीयता स्कोर की तुलना में काफी कम है.
  8. कोकीन की एक भड़काना खुराक (5 या 10 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के साथ चूहों बहाल और स्वतंत्र अन्वेषण की अनुमति तंत्र को फिर से बेनकाब और प्रत्येक डिब्बे में बिताए समय रिकॉर्ड है.
  9. Euthasol इच्छामृत्यु समाधान (150 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन. Transcardially 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ चूहों छिड़कना और सही microinjection के प्लेसमेंट को मान्य करने के लिए एक ऊतकीय परीक्षा प्रदर्शन करते हैं.

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Representative Results

सीपीपी

Microinjected चूहों पर सीपीपी प्रदर्शन करने के बाद, एक नियंत्रण इंजेक्शन की पलटन (rAAV GFP) चूहों सामान्य रूप से दवा बनती कक्ष (चित्रा 1 ए, 1 बी) के लिए वरीयता हासिल कर ली है कि सत्यापित करना चाहिए. चूहे कोकीन वरीयता (खारा बनती कक्ष में बिताए कोकीन बनती कक्ष ऋण समय में बिताए समय) आधारभूत वरीयता स्कोर (चित्रा 1 बी, ए बनाम बी) की तुलना में काफी अधिक है जब एक विशेष कक्ष के लिए वरीयता हासिल कर ली है माना जाता है . एक पलटन के रूप में, नियंत्रण इंजेक्शन चूहों कोकीन बनती कक्ष के लिए एक प्राथमिकता दिखाने के लिए, या एक से बचने नहीं दिखाते, तो, प्लेसमेंट ऊतक विज्ञान (rAAV इंजेक्शन उपधारा देखें) और गलत नियुक्ति के साथ चूहों के माध्यम से तुरंत सत्यापित किया जाना चाहिए खारिज किया जाना चाहिए.

वरीयता सामान्य रूप से नियंत्रण इंजेक्शन पलटन द्वारा अधिग्रहीत किया गया है, तो एक के बाद (चित्रा 1 ए शुरुआत विलुप्त होने से प्रतिमान विस्तार कर सकते हैं (चित्रा 1 बी, E3, E4, E5 बनाम ए) की तुलना में काफी कम है जब एक विशेष कक्ष के लिए दवा प्रेरित वरीयता बुझ गए हैं पर विचार कर रहे हैं. इस समय, एक एक दवा प्रधानमंत्री (चित्रा 1 ए, 1 बी) के साथ बहाल कर सकते हैं. दवा प्रधानमंत्री के प्रशासन के बाद वरीयता स्कोर अधिग्रहण पर उस से सांख्यिकीय अप्रभेद्य है, तो उस पलटन दवा बनती चैम्बर के लिए दवा प्रेरित वरीयता (चित्रा 1 बी, आर बनाम ए) बहाल है कहा जाता है.

rAAV microinjections

पिछले एक rAAV-Cre वास्तव में qPCR (चित्रा 1C) और / या पश्चिमी धब्बा या immunohistochemical विश्लेषण 18 से microinjected चूहों में ब्याज की जीन बाहर खटखटाया गया है सत्यापित करना चाहिए किसी भी व्यवहार प्रतिमान के भीतर rAAV-Cre प्रयोगात्मक रणनीति का पीछा करने के लिए </> समर्थन. उदाहरण के लिए, एल प्रकार कैल्शियम चैनल isoform सीए वी 1.2 floxed था कि चूहों की एनएसी में rAAV-Cre पर GFP की microinjection के बाद, rAAV-Cre इंजेक्शन घूंसे जीन अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कमी (चित्रा 1C) दिखा. इसके अतिरिक्त, हम immunohistochemical विश्लेषण से पता चला है rAAV-Cre माउस मस्तिष्क 18 में पीटकर सीए वी 1.2 प्रोटीन कर सकते हैं. सभी व्यवहार विश्लेषण के बाद, चूहों transcardially हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए किया जाना चाहिए 4% paraformaldehyde और फ्लोरोसेंट immunohistochemistry के साथ perfused किया जाना चाहिए. द्विपक्षीय संरचनाओं को निशाना बनाया गया है, उचित द्विपक्षीय प्लेसमेंट फ्लोरोसेंट immunohistochemical धुंधला (चित्रा -1, एनएसी के लक्ष्य प्रतिनिधि) द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए. सही क्षेत्र वास्तव में लक्षित किया गया है, तो धुंधला इरादा इस क्षेत्र में विशेष रूप से देखे जा और इसे से बाहर नहीं होना चाहिए. इंजेक्शन से एक या दोनों बंद लक्ष्य कर रहे हैं, चूहों पूर्वव्यापी होना चाहिएly सीपीपी डेटा सेट से बाहर रखा गया है. वायरल वेक्टर संक्रमित मस्तिष्क क्षेत्रों और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए संक्रमित क्षेत्र के बाद विच्छेदन को निशाना सटीक के दृश्य के लिए एक और रणनीति, ली और वुल्फ (2011) 19 में वर्णित के रूप में एक GFP-रोशन टॉर्च का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 ए. RAAV-Cre microinjection और वातानुकूलित जगह वरीयता अधिग्रहण, विलुप्त होने और बहाली चरण की प्रयोगात्मक समय. RAAV-Cre व्यवहार परीक्षण की दीक्षा के लिए 2-3 सप्ताह पूर्व रुचि के क्षेत्र में microinjected है. वातानुकूलित जगह वरीयता कोकीन (10 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के साथ कंडीशनिंग के 3 दिनों के बाद किसी भी प्रारंभिक पूर्वाग्रहों, पता लगाने के लिए एक पूर्व परीक्षण के साथ शुरू होता है. चार घंटे प्रत्येक कोकीन कंडीशनिंग सत्र के बाद, चूहोंनमक के साथ इलाज और विपरीत कक्ष तक ही सीमित हैं. अगले दिन चूहों एक सीपीपी के अधिग्रहण के लिए जांच की जाती है. विलुप्त होने के प्रशिक्षण के बाद 24 घंटे के शुरू होता है और पूरे तंत्र को मुफ्त का उपयोग की अनुमति देते हैं कि कम से कम 2 घंटे से अलग हो रहे हैं कि 2 दैनिक सत्र, शामिल है. एक बार चूहों विलुप्त होने कसौटी पर पहुँच गए हैं, वे कोकीन की एक भड़काना इंजेक्शन (10 मिग्रा / किग्रा, आईपी) दिलाई और अपने समय के तंत्र के सभी कक्षों में खर्च कर रहे हैं कोकीन व्यवहार की मांग. चित्रा 1 बी की बहाली के लिए परीक्षण करने के लिए मूल्यांकन किया है. आधारभूत के प्रतिनिधि परिणाम, अधिग्रहण, विलुप्त होने के प्रशिक्षण, और बहाली. गुम्मट C57BL/6J चूहों कंडीशनिंग के दिन 2, 3 और 4 के दौरान कोकीन के साथ इलाज किया गया. चूहे अधिग्रहण, विलुप्त होने और कोकीन प्रेरित बहाली (10 मिलीग्राम / किग्रा आईपी कोकीन प्राइम) का प्रदर्शन किया. *** पी <0.001 आधारभूत बनाम (बी); # पी <0.05 अधिग्रहण बनाम (ए). बेसलाइन, बी, अधिग्रहण, एक, विलुप्त होने, ई, बहाली, आर चित्रा 1C. Stereotaxसीए वी 1.2 floxed चूहों की एनएसी में rAAV-Cre पर GFP के आईसी वितरण काफी सीए वी 1.2 mRNA की कमी हुई. Homozygous सीए वी 1.2 floxed चूहों वायरल वैक्टर नियंत्रण (rAAV GFP) या प्रयोगात्मक (rAAV-Cre पर GFP) के साथ microinjected गया . अधिक से अधिक Cre के सक्रियण के बाद, चूहों बलिदान थे और mRNA अलग किया गया था और रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर सीए वी 1.2 विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के माध्यम से जांच की गई. सीए वी 1.2 floxed चूहों की एनएसी में rAAV-Cre पर GFP की stereotaxic वितरण काफी AAV-GFP के साथ इंजेक्शन चूहों की तुलना में, सीए वी 1.2 mRNA स्तर कम किया है. † † पी <0.001 rAAV-GFP बनाम. चित्रा -1. न्यूरॉन्स माउस एनएसी में rAAV-GFP के साथ microinjected. Homozygous सीए वी 1.2 floxed चूहों एनएसी में उचित द्विपक्षीय प्लेसमेंट के लिए जाँच करने के लिए rAAV-GFP के साथ microinjected थे. चूहे 4% पीएफए ​​और immunohistochemistry प्रदर्शन किया गया था के साथ perfused थे. GFP धुंधला प्रदर्शन हैएनएसी की उचित द्विपक्षीय लक्ष्यीकरण tes. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

विलुप्त होने और बहाली के चरणों में शामिल है कि सीपीपी के साथ संयुक्त वायरल वैक्टर stereotaxic microinjection के माध्यम से क्षेत्रीय स्तर पर और अस्थायी विशिष्ट जीन पृथक नशे की लत की तरह व्यवहार की तीन अलग चरणों के लिए जीन की विशिष्ट योगदान की जांच के लिए अनुमति देता है. पारंपरिक Cre पर LoxP प्रणाली का उपयोग हासिल की है कि सशर्त पीटकर स्थानिक-अस्थायी प्रतिबंधित जीन पृथक के लिए प्रदान करता है, stereotaxically floxed चूहों की असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में Cre-recombinase microinjecting जब और जहां एक जीन बाहर खटखटाया है की भी सख्त नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. साथ ही, यह कभी कभी पीटा चूहों में मनाया सीमित प्ररूपी भिन्नता के लिए खातों जो विकास के दौरान होने वाली प्रतिपूरक परिवर्तन की संभावना circumvents. इसके अलावा, व्यवहार के दौरान विभिन्न बिंदुओं पर समय microinjected गया कि चूहों के साथियों का उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और व्यवहार में परिवर्तन के बीच किए जाने के लिए कारण लिंक के लिए अनुमति दे सकते हैं. जन्मदिनrtantly, इस तकनीक को आत्म - प्रशासन और psychomotor संवेदीकरण सहित कई अलग कोकीन व्यवहार मानदंड को लागू किया जा सकता है.

यह Cre recombinase की अधिक से अधिक सक्रियण 20 हो गई है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सर्जरी के बाद कम से कम 10-14 दिन इंतजार करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस से पहले व्यवहार परीक्षण की शुरुआत की व्याख्या करने के लिए व्यवहार निष्कर्ष मुश्किल बनाने, उप अधिकतम Cre अभिव्यक्ति का एक अज्ञात राशि के साथ चूहों के उपयोग में परिणाम कर सकते हैं. एक जीन की पूरी पीटकर में Cre के परिणाम की अधिकतम सक्रियण, लेकिन, यह केवल संक्रमित वास्तव में कर रहे हैं कि कोशिकाओं में पाया जाता है. मात्रा और वायरल वेक्टर के टिटर पर निर्भर करता है, कोशिकाओं की लगभग 50-70% कुछ अवशिष्ट जीन अभिव्यक्ति (चित्रा 1C) के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो mRNA और प्रोटीन पीटकर की इसी राशि में जिसके परिणामस्वरूप एक दिए गए क्षेत्र के लिए संक्रमित हैं. हालांकि, हम नॉकआउट के इस प्रकार के एक 50-60% mRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए पर्याप्त है कि प्रदर्शन किया हैमनोप्रेरणा संवेदीकरण 14 की. इसके अलावा, इस विधि Cre सक्रियण vivo में होता है एक बार के रूप में लंबे समय तक व्यवहार मानदंड के लिए आदर्श है, इसकी अभिव्यक्ति और इसी जीन पीटकर कम से कम 6 महीने 21 के लिए रहता है.

लेकिन एक समय के एक अधिक असतत अवधि में एक जीन की भूमिका की जांच करने में रुचि है, तो है कि इस विशेष विधि के साथ संभव नहीं है. कम अवधि अभिव्यक्ति के लिए, दाद अधिमान्यतया न्यूरॉन्स 22 संक्रमित है, जो वायरल (एचएसवी) वैक्टर इस्तेमाल किया जा सकता सिंप्लेक्स. वे दिन के लिए vivo में व्यक्त रूप प्रमोटर विवो 23 में कई दिनों या हफ्तों के बाद खामोश नहीं है के रूप में लंबी अवधि के लिए बनी रहती है जो Cre recombinase के rAAV अभिव्यक्ति की तुलना में, एचएसवी वैक्टर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए पसंद कर रहे हैं. एचएसवी वैक्टर वे व्यापक पारगमन दक्षता और कहा कि सहायक वायरस मुक्त शेयरों में 22 मौजूद है कि प्रदर्शन में भी फायदेमंद हैं. इसके अलावा, एचएसवी वैक्टर भी Cre आरईसी व्यक्त कर सकते हैंombinase और संस्कृति में और vivo 24 में दोनों floxed दृश्यों के छांटना मध्यस्थता. हालांकि, सामयिक cytotoxicity पाया गया है.

मस्तिष्क के भीतर लगभग किसी भी क्षेत्र में इस microinjection तकनीक का उपयोग कर निशाना बनाया जा सकता है. एक बड़े क्षेत्र के भीतर छोटे उपक्षेत्र लक्षित करने के लिए प्रयास करते हैं, एक प्रयोग किया जाता वायरल वेक्टर की राशि का अनुकूलन करने की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, हम इस तरह के हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था के रूप में व्यापक ढांचे को लक्षित करते समय, जबकि अहमद और उनके सहयोगियों ने 20 rAAV-Cre के 0.8 μl इस्तेमाल किया, एनएसी और उदर tegmental क्षेत्र (VTA) 14 लक्षित करने के लिए rAAV-Cre पर GFP के 0.5 μl microinjected. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक एक छोटे, अधिक परिभाषित क्षेत्र को लक्षित करने में सहायता कर सकते हैं (चोई एट अल देखें. (2005) 25 समीक्षा के लिए) अंतर प्रसार और संक्रामकता गुण है कि विभिन्न सीरोटाइप विकल्पों की खोज. इसके विपरीत, एक बड़े क्षेत्र को लक्षित करने के लिए प्रयास करते हैं, एक microinjected वायरल वेक्टर की मात्रा बढ़ा सकते हैं. यह मैं22 संक्रमित कुल कोशिकाओं के एक उच्च संख्या के लिए विरोध के रूप में वे संभावना सेल प्रति अतिरिक्त संक्रमण उपज के रूप में उच्च वेक्टर titers के उपयोग की तुलना में और अधिक प्रभावोत्पादक. इसके अतिरिक्त, एक अधिक प्रभावी रूप से एक बड़े क्षेत्र को 26 संक्रमित करने के लिए, एक क्षेत्र के भीतर, या कई क्षेत्रों में एकाधिक इंजेक्शन प्रदर्शन कर सकते हैं.

मस्तिष्क समारोह और बीमारी की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि अन्य वायरल वैक्टर के साथ तुलना में जब rAAV वैक्टर का प्रयोग भी लाभदायक है. विशेष रूप से, परंपरागत adenoviral वैक्टर ऐसे रेट्रोवायरस और lentiviruses के रूप में अन्य वैक्टर insertional mutagenesis के साथ मुद्दों को शामिल कर सकते हैं कि वे गंभीर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं प्रेरित समस्याग्रस्त साबित कर दिया. rAAV एक सौम्य parvovirus है और rAAV संक्रमण के साथ जुड़ा कोई ज्ञात रोग है. इसके अलावा, अन्य वायरल वैक्टर के विपरीत, rAAV साथ पारगमन बहुत कम एक चिंता का लक्ष्य कोशिकाओं पर माध्यमिक प्रभाव है, जिससे देशी एएवी वायरल प्रोटीन 27 की अभिव्यक्ति के बिना होता है.rAAV वैक्टर उच्च titers में उत्पादित किया जा सकता है और एक अत्यधिक स्थानिक स्थानीयकृत ढंग 21,28 में मस्तिष्क में बाद mitotic न्यूरॉन्स transduce कर सकते हैं. इसके अलावा, rAAV वैक्टर अब माउस दिमाग में न्यूरॉन्स 29 और Cre पर निर्भर rAAV अभिव्यक्ति सिस्टम भी (समीक्षा के लिए झांग एट अल. (2010) 30 देखें) और अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल हो रहे हैं के विशिष्ट उपप्रकार लक्षित कर सकते हैं कि उत्पन्न किया जा रहा है.

सारांश में, कोकीन सीपीपी कोकीन प्रासंगिक अधिग्रहण के लिए प्रासंगिक शिक्षा, विलुप्त होने, और कोकीन व्यवहार की मांग की बहाली का अध्ययन करने के लिए एक सरल अभी तक जानकारीपूर्ण व्यवहार उपकरण के रूप में कार्य करता है. सीपीपी के साथ एक floxed एलील ले चूहों में Cre recombinase व्यक्त rAAV के उपयोग का एक संयोजन व्यवहार की मांग कोकीन कि मध्यस्थता विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में लक्ष्य जीन की भूमिका की खोज के लिए एक शक्तिशाली रणनीति प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों विस्तारित वातानुकूलित जगह वरीयता प्रोटोकॉल स्थापित करने में उनकी मदद के लिए Anni ली और मॉरीन बर्न धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conditioned place preference activity chambers Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA model 900
Hamilton syringes Hamilton Company, Reno, Nevada, USA 7634-01
rAAV2-Cre-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7016
rAAV2-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7004

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References

  1. Nestler, E. J. Molecular neurobiology of addiction. American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).
  2. Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction. British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).
  3. Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).
  4. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).
  5. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).
  6. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).
  7. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).
  8. Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients. Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).
  9. O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. A learning model of addiction. Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).
  10. Stewart, J. Psychological and neural mechanisms of relapse. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).
  11. Bueler, H. Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biological Chemistry. 380, (1999).
  12. Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system. Experimental Neurology. 144 (1), (1997).
  13. Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).
  14. Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels. Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).
  15. Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure. Channels. 6 (1), 11-17 (2012).
  16. Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction. NIDA Research Monograph. 125, (1993).
  17. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).
  18. Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice. Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).
  19. Li, X., Wolf, M. E. Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis. Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).
  20. Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5. BMC Neuroscience. 5, (2004).
  21. Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  22. Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders. Biotechniques. 39 (3), 9 (2005).
  23. Pohl, M., Braz, J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions. European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).
  24. Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination. Virus Research. 65 (1), (1999).
  25. Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery. Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).
  26. Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).
  27. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression. Journal of Virology. 63 (9), (1989).
  28. Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), (1994).
  29. Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).
  30. Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), (2010).

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Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference. J. Vis. Exp. (77), e50600, doi:10.3791/50600 (2013).

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