Summary
Questo articolo viene descritto come microinject vettori virali nel cervello di topo e poi prova in un luogo climatizzato preferenza paradigma che comprende una fase di acquisizione, l'estinzione e la reintegrazione.
Abstract
Microinjecting virali (rAAV) vettori ricombinanti adenoassociated esprimono Cre ricombinasi in distinte regioni del cervello del mouse in modo selettivo i geni knockout di interesse permette maggiore controllo temporalmente e specifici per ogni regione di delezione genica, rispetto ai metodi esistenti. Mentre delezione condizionale può essere ottenuto anche con accoppiamento topi che esprimono ricombinasi Cre sotto il controllo di promotori genici specifici con i topi che portano un gene floxed, microiniezione stereotassico consente per il targeting delle aree cerebrali discrete a sperimentatore-determinati punti di tempo di interesse. Nel contesto di cocaina luogo preferenza condizionata, e altri paradigmi comportamentali della cocaina come l'auto-somministrazione o psicomotorio sensibilizzazione che può coinvolgere recesso, estinzione e / o fasi di rimessa, questa tecnica è particolarmente utile a esplorare il contributo unico di geni bersaglio di questi distinti fasi di modelli comportamentali di cocaina indotta plasticità. Specificamente,Questa tecnica permette di ablazione selettiva di geni bersaglio durante fasi distinte di un comportamento di testare il loro contributo al comportamento nel tempo. In definitiva, questa comprensione permette terapeutica più mirati che sono meglio in grado di affrontare i fattori di rischio più potenti che si presentano nel corso di ogni fase del comportamento di dipendenza.
Introduction
La cocaina è uno psicostimolante altamente rinforzo. A seguito di esposizione ripetuta, diversi adattamenti molecolari e cellulari che si verificano in ricompensa rilevanti circuiti cerebrali che si ritiene di provocare compulsivo di droga in cerca di comportamento, provocando alti tassi di recidiva che presentano un grave problema clinico 1. La cocaina esercita questi effetti comportamentali di lunga durata di regolare l'espressione genica. Per studiare gli adattamenti derivanti da uso cronico di cocaina, roditori modelli preclinici sono stati ampiamente utilizzati. Uno di questi modelli è il luogo preferenza paradigma condizionata (CPP). Tale modello prevede lo sviluppo di una associazione tra un ambiente appreso precedentemente neutro e le proprietà gratificanti della cocaina. Dopo diversi abbinamenti di cocaina con una particolare camera, sono ammessi animali di esplorare liberamente gli ambienti di cocaina-accoppiati e non-cocaina-appaiati e se preferiscono il vano droga appaiati, si dice che essi hanno acquisito un cocaina-indotta place preferenza. Inoltre, a seguito di un periodo di formazione estinzione, questo paradigma può essere usato per studiare al contesto specifico ripristino di cocaina comportamento di ricerca.
Rispetto ad altri modelli comportamentali di dipendenza comportamento simile, come sensibilizzazione psicomotorio, che viene utilizzato per studiare lungo termine indotta dalla cocaina comportamentale e plasticità molecolare 2,3 e di auto-somministrazione (SA), che si ritiene più esattamente imitare coinvolgente comportamento simile trovato negli esseri umani, il paradigma CPP è una procedura semplice per studiare la cocaina apprendimento contestuale 4. Protocolli CPP possono essere convenientemente estesi per includere l'estinzione e le fasi di reintegrazione, in modo simile a SA, che consentono di studiare i meccanismi alla base di craving e la ricaduta 5-7 e che si ritiene di ricapitolare gli aspetti di ciò che avviene in umana droga in cerca di comportamento e droga - e cue-indotto ricaduta 8-10.
Un meccanismo che sta alla base delcocaina-indotta plasticità comportamentale che è caratteristica di ciascuna delle distinte fasi di CPP, compresa l'acquisizione, estinzione e reintegrazione, è l'attivazione di firme uniche di espressione genica in differenti regioni cerebrali. Per testare direttamente quali geni all'interno di regioni cerebrali premio rilevanti mediare cocaina-indotta cambiamenti comportamentali, è utile essere in grado di manipolare selettivamente in maniera regionalmente specifico. Un modo per raggiungere questo obiettivo è quello microinject vettori ricombinanti adenoassociated virali (rAAV) che esprimono la ricombinasi Cre che utilizzano la chirurgia stereotassica, in aree distinte del cervello dei topi che hanno geni bersaglio affiancati da siti LoxP (topi floxed). Questo metodo consente il controllo temporale e regionale molto preciso quando e dove i geni vengono asportate, in entrambi i neuroni divisione e non la divisione, senza indurre risposte immunitarie 11-13. Questo livello di controllo rappresenta un importante vantaggio rispetto tecnologia tradizionale Cre-loxP di allevamento topi floxed with topi esprimenti ricombinasi Cre sotto il controllo di un promotore del gene endogeno, in quanto i tempi e la distribuzione di delezione del gene possono essere più strettamente regolata. Inoltre, virali knockout genico mediata da vettori aggira potenziali effetti compensativi inerenti allo sviluppo che possono verificarsi utilizzando strategie di eliminazione diretta tradizionali.
Oltre alla cocaina CPP, che è descritto qui, la microiniezione di rAAV-Cre nel cervello di topi floxed per valutare il ruolo di specifici geni può essere applicato ubiquitariamente a paradigmi comportamentali che coinvolgono fasi distinte, tra cui l'auto-amministrazione e psicomotorio sensibilizzazione. Ad esempio, il nostro laboratorio ha utilizzato la tecnologia rAAV-Cre per studiare il ruolo del Ca v 1.2 di tipo L Ca 2 + canali in cocaina psicomotorio sensibilizzazione 14. In particolare, rAAV-Cre stato microiniettato nel nucleo accumbens (NAc) di topi con il gene che codifica Ca v 1.2 floxed, per dimostrare che Ca v 14,15. Tuttavia, la strategia rAAV-Cre non può essere utilizzato se non esistono topi con un gene floxed di interesse, come era la nostra esperienza nel valutare il ruolo del Ca v 1.3 di tipo L Ca 2 + canali di sensibilizzazione psicomotoria. Quindi, una limitazione di utilizzo rAAV-Cre si presenta se non esistono topi condizionali per un particolare gene di interesse. Tuttavia, rAAVs che esprimono siRNA può essere utilizzato per geni bersaglio atterramento, come abbiamo fatto per esaminare il ruolo del Ca V 1.3 canali 14,15.
Microinjecting rAAV-Cre in regioni cerebrali discrete di topi floxed e poi testarle nel paradigma CPP permette di indagine i geni specifici che mediano le varie fasi del comportamento di dipendenza, come e dove operano. L'utilizzo di questo paradigma ha aiutato nella nostra comprensione di come la somministrazione ripetuta di cocaina in sostanza dirotta il brains circuito ricompensa causando cambiamenti adattativi nel molecolari di trasduzione del segnale e l'espressione genica che portano allo stato di tossicodipendente 1,16,17.
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Protocol
Tutte le procedure sono condotte in conformità con il Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care e Usa regole del Comitato.
1. Preparazione e configurazione di consegna stereotassico di vettori virali
- Se uno strumento, tampone sterile, o della mano indossando guanti sterili è contaminata da entrare in contatto con una superficie non sterile, eliminare o ri-sterilizzare lo strumento con un caldo tallone sterilizzatore, scartare il tampone o passare a nuovi guanti sterili.
- Posizionare una gabbia del mouse con biancheria da letto su un blocco di calore per riscaldare per il recupero post-operatorio.
- Impostare rasoio elettrico per radersi la testa e l'etanolo e iodio per sterilizzare il cuoio capelluto.
- Pulire le orecchie bar e bocca stretta della stereotax con il 70% di etanolo.
- Utilizzando un 5 microlitri siringa Hamilton, redigere 5 ml di vettore virale (1 x 10 6 particelle virali / mL) e istituito nel supporto siringa sul stereotax.
- Riscaldamento a microonde pad o accendere pad elettrica su una° posto su stereotax. Coprire con un tampone assorbente pulita per ridurre il rischio di ustioni. Controllo della temperatura corporea del mouse (tra 97-99,5 ° F) frequentemente durante procedura.
- Iniettare topo (peso compreso tra 22-35 g) con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg). Una volta che un topo è anestetizzato, punta della coda pizzico di verificare i riflessi del mouse e osserva qualsiasi movimento o risposta per garantire che il mouse è adeguatamente anestetizzato.
- Radersi la testa tra le orecchie e gli occhi.
- Pulire la testa rasata con alternanza di etanolo e iodio sterili applicatori di cotone.
- Passa il mouse a pad riscaldato stereotax.
2. Microiniezione stereotassica di vettori virali
- Indossare guanti sterili durante l'intervento chirurgico. Se i guanti sono contaminati in qualsiasi momento toccando superfici non sterili, cambiare i guanti.
- Zero bar e con i denti bar scale orecchio.
- Set denti in bar dente.
- Vite in museruola. Se dimenando o baffo mossazione è notato, in qualsiasi momento, somministrare una dose di richiamo ip (~ 0,05 cc) di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg).
- Vite in barre orecchio.
- Lubrificare gli occhi con PuraLube.
- Tagliare cuoio capelluto aperta a appena dietro le orecchie con un bisturi.
- Luogo bulldog clip su angoli del cuoio capelluto per sbucciare la pelle dal cranio. Bregma e lambda dovrebbe essere facilmente visibile.
- Assicurati di sutura dal bregma al lambda sia allineata. Se la sutura è storto riaggiustare posizionamento della testa.
- Verificare che tutte le impostazioni sulla stereotax sono azzerati.
- Mettere la punta dell'ago in atto a bregma.
- Misurare tutte le coordinate per entrambi bregma e lambda. Questo include coordinate dorsale / ventrale, mediale / laterale e anteriore / posteriore.
- Regolare la testa fino a quando le coordinate ventrali per bregma e lambda sono a 0,02 millimetri l'uno dall'altro.
- Una volta allineata, dal bregma medialmente andare fuori alle coordinate mediale / laterale (M / L). Assicurarei lati sinistro e destro sono allineate all'interno di 0,02 mm di vicenda.
- Punta dell'ago ri-center su bregma e da lì muoversi nella direzione anteriore / posteriore (A / P) per la coordinata anteriore / posteriore desiderato.
- Se necessario, ago angolo in una direzione e assicurarsi che il stereotax è bloccato. Uscire alla M / L coordinata sinistra (+ / - 1,52)
- Misurare la posizione ventrale della parte superiore del cranio da utilizzare come riferimento dopo il pozzo viene perforato.
- Praticare un foro con una punta sterile alla coordinata desiderata. Controllare che l'ago può entrare senza interruzioni attraverso il cranio.
- Abbassare l'ago alla coordinata ventrale desiderato.
- Una volta che la coordinata è raggiunto, dip 0,015 millimetri sotto per ~ 10 sec per creare una piccola tasca per il vettore virale.
- Iniettare il volume desiderato di vettore virale a una velocità di ~ 0,1 ml / min. Attendere 3 minuti per il vettore virale per diffondere completamente. Sollevare la punta dell'ago 0,015 millimetri e attendere un ulteriore 2 min.
- Immergere l'ago (se facendo iniezioni angolati) nella direzione opposta. Ancora, registrare la posizione ventrale come riferimento per la parte superiore del cranio.
- Ripetete la stessa procedura sul primo lato di iniettare vettore virale sul lato opposto (se facendo iniezioni bilaterali).
- Applicare la cera ossea per entrambi i fori per sigillarli con il fine di legno di una sterile cotton-fioc.
- Suturare il cuoio capelluto.
- Applicare il blocco del nervo alla zona ferita.
- Rimuovere il mouse da stereotax e mettere in gabbia riscaldata sul blocco di calore per recuperare per 45 min.
- Monitorare i segni di dolore, tra cui: riduzione dell'attività complessiva o irrequietezza, diminuzione del consumo di cibo e acqua o maggiore vocalizzazione. Buprenorfina (0,05 - 0,2 mg / kg) può essere somministrato due volte al giorno per una settimana, se necessario, per il dolore. Alternative accettabili includono: meperidina (20-60 mg / kg), pentazocina (10 mg / kg), nalbufina (4-8 mg / kg).
3. Condizionata Luogo Preferenza: Acquisition, Extinction e Ripristino
- Topi posto nella camera centrale di un luogo apparato preferenza a tre camere (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) per un secondo periodo di 60 assuefazione con porte a ghigliottina chiusi.
- Dopo assuefazione, porte a ghigliottina aperti e consentire topi libera esplorazione di tutti e 3 camere per 1.200 secondi, con il tempo trascorso in ciascuna camera di essere registrati utilizzando il software MedPC IV (Med Associates, Inc.).
- Assegnare topi per camere di condizionamento in base al loro rendimento durante il pre-test. Usando un disegno di parte, coppia somministrazione del farmaco durante i successivi 3 giorni con il vano che era meno preferito durante la linea di base pre-test.
- Nel corso dei prossimi 3 giorni di condizionamento, iniettare topi con la cocaina (10 mg / kg, ip), durante la sessione del mattino e li limita nella loro camera assegnata per 1.200 sec immediatamente dopo l'iniezione. Topi tornare alle loro gabbie a casa dopo la sessione. Dopo 4 ore, iniettare topi con soluzione salina (0,01 ml / gdi peso corporeo) e relegarli alla camera opposto per il secondo turno pomeridiano 1.200.
- Per eseguire il test per l'acquisizione, posto topi in camera centrale con porte a ghigliottina chiuse per un secondo periodo di adattamento 60. Porte a ghigliottina aperte e consentire l'esplorazione libera per 1.200 secondi, con il tempo trascorso in tutte le camere registrati dal software MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calcola preferenza sottraendo la quantità di tempo trascorso nella camera salina-accoppiati dalla quantità di tempo trascorso nella camera di cocaina ea coppia.
- Per spegnere la preferenza luogo, esporre topi per due sessioni di 20 min di libera esplorazione quotidiana dello stesso apparato, separati da almeno 2 ore, con inizio 24 ore dopo la prova di acquisto. Tempo trascorso in tutte le camere occorre nuovamente registrata e la grandezza del CPP iniziale deve essere confrontata con quella di ogni sessione estinzione.
- Determinare se i topi hanno spento la preferenza indotta da farmaci da valutare se la preferenza per un parcamera di particolare attraverso due giorni di estinzione consecutivi è significativamente inferiore rispetto al punteggio di preferenza acquisizione.
- Reintegrare topi con una dose primaria di cocaina (5 o 10 mg / kg, ip), e ri-esporre l'apparecchio che consente di esplorazione libera e registrare il tempo trascorso in ogni vano.
- Somministrare soluzione eutanasia Euthasol (150 mg / kg). Transcardially perfusione topi con 4% paraformaldeide (PFA) ed effettuare un esame istologico per confermare il posizionamento corretto microiniezione.
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Representative Results
CPP
Dopo aver eseguito CPP sui topi microiniettati, si dovrebbe verificare che il gruppo di controllo a iniezione (rAAV-GFP) topi hanno normalmente acquisito preferenza per la camera di farmaco-accoppiato (Figura 1A, 1B). I topi sono considerati di aver acquisito la preferenza per una particolare camera di preferenza quando la cocaina (tempo trascorso nella camera di cocaina-accoppiato meno tempo trascorso in camera salina-accoppiato) è significativamente più alto rispetto al basale punteggio di preferenza (Figura 1B, A vs B) . Se, come una coorte, i topi di controllo a iniezione non mostrano una preferenza per la camera di cocaina-accoppiato, o mostrano una certa avversione, il posizionamento deve essere verificata immediatamente tramite istologia (vedi rAAV Iniezioni sottosezione) e topi con il posizionamento errato deve essere eliminata.
Se la preferenza è stata normalmente acquisita dalla coorte di controllo a iniezione, si può estendere successivamente il paradigma di estinzione inizio (Figura 1A (Figura 1B, E3, E4, E5 vs A). In questo momento, si può ripristinare con un farmaco primaria (Figura 1A, 1B). Se il punteggio di preferenza dopo la somministrazione del farmaco principale è statisticamente indistinguibile da quella di acquisizione, poi che coorte si dice che abbia reintegrato la preferenza indotta da farmaci per la camera di droga ea coppia (Figura 1B, R vs A).
rAAV microiniezioni
Prima di perseguire la strategia sperimentale rAAV-Cre all'interno di qualsiasi paradigma comportamentale si dovrebbe verificare che rAAV-Cre ha infatti eliminato il gene di interesse nei topi microiniettati da qPCR (Figura 1C) e / o Western Blot o analisi immunoistochimica 18 </ Sup>. Ad esempio, a seguito di microiniezione di rAAV-Cre-GFP nel NAc dei topi che avevano il L-tipo calcio canale isoforma Ca v 1.2 floxed, rAAV-Cre pugni iniettati mostrano una riduzione significativa dell'espressione genica (Figura 1C). Inoltre, abbiamo dimostrato con analisi immunoistochimica che rAAV-Cre può ko Ca v 1.2 proteina nel cervello di topo 18. A seguito di tutte le analisi comportamentali, i topi dovrebbero essere transcardially perfusi con paraformaldeide 4% e l'immunoistochimica fluorescente dovrebbe essere eseguita per la proteina fluorescente verde (GFP). Se le strutture bilaterali sono stati presi di mira, il corretto posizionamento bilaterale vanno verificate mediante colorazione fluorescente immunoistochimica (Figura 1D, rappresentante di mira il NAC). Se l'area corretta è stata infatti mirati, colorante deve essere visualizzato esclusivamente nella regione previsto e non fuori di esso. Se una o entrambe le iniezioni sono off-target, i topi dovrebbero essere retroattivamente escluso dalla serie di dati CPP. Un'altra strategia per la visualizzazione di un puntamento preciso della virali regioni cerebrali vettori infetti e successiva dissezione della zona infetta per le analisi biochimiche, può essere raggiunto utilizzando una torcia elettrica GFP-illuminante, come descritto in Li e Wolf (2011) 19.
Figura 1A. Timeline Sperimentale di rAAV-Cre microiniezione e luogo fasi di acquisizione, l'estinzione e la reintegrazione preferenza condizionata. RAAV-Cre è microiniettato nella regione di interesse 2-3 settimane prima dell'inizio dei test comportamentali. Conditioned place preference inizia con un pre-test per accertare eventuali pregiudizi iniziali, seguiti da 3 giorni di condizionamento con la cocaina (10 mg / kg, ip). Quattro ore dopo ogni sessione condizionata cocaina, topisono trattati con soluzione salina e confinato alla camera opposta. I seguenti topi giorni sono testati per l'acquisizione di un CPP. Formazione estinzione inizia 24 ore dopo e coinvolge due sessioni giornaliere, che sono separati da almeno 2 ore, che consentono l'accesso gratuito a tutto l'apparato. Una volta che i topi hanno raggiunto il criterio di estinzione, che vengono somministrati una iniezione di adescamento di cocaina (10 mg / kg, ip) e il loro tempo trascorso in tutte le camere dell'apparato è valutato per verificare la reintegrazione di cocaina comportamento di ricerca. Figura 1B. Risultati rappresentativi della linea di base, l'acquisizione, la formazione di estinzione, e la reintegrazione. WT C57BL/6J topi sono stati trattati con la cocaina durante i giorni 2, 3 e 4 del condizionamento. I topi esposti acquisizione, l'estinzione e la reintegrazione indotta dalla cocaina (10 mg / kg ip cocaina primo). *** P <0.001 rispetto al basale (B); # p <0,05 verso acquisizione (A). Baseline, B; Acquisizione, A; Estinzione, E; Ripristino, R. figura 1C. Stereotaxconsegna ic di rAAV-Cre-GFP nel NAc di Ca v 1.2 topi floxed diminuito significativamente Ca v 1.2 mRNA. omozigoti Ca v 1.2 topi floxed stati microiniettati con controllo (rAAV-GFP) o sperimentali (rAAV-Cre-GFP) vettori virali . Dopo l'attivazione Cre massima, i topi sono stati sacrificati e mRNA è stato isolato e livelli di espressione relativi sono stati esaminati mediante PCR quantitativa usando Ca v 1.2 primer specifici. Consegna stereotassica di rAAV-Cre-GFP nel NAc di Ca v 1.2 topi floxed diminuito significativamente Ca v 1.2 i livelli di mRNA, rispetto ai topi trattati con AAV-GFP. † † p <0.001 vs rAAV-GFP. Figura 1D. Neuroni microiniettati con rAAV-GFP nel topo NAC. Omozigoti Ca v 1.2 topi floxed stati microiniettati con rAAV-GFP per verificare il corretto posizionamento bilaterale nel NAc. I topi sono stati perfusi con 4% PFA e immunoistochimica è stata eseguita. GFP colorazione dimostrazionetes corretta Targeting bilaterale del NAC. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Regionalmente e temporalmente specifici ablazione genica tramite microiniezione stereotassico di vettori virali combinati con CPP che include estinzione e le fasi di rimessa permette di indagine dei contributi specifici di geni di tre distinte fasi di comportamenti di dipendenza simile. Mentre knockout condizionale che viene realizzato utilizzando il sistema Cre-loxP tradizionale prevede spazio-temporalmente limitato ablazione genica, stereotaxically microinjecting Cre-ricombinasi in aree distinte del cervello di topi floxed permette ancora più stretto il controllo di quando e dove un gene è buttato giù. Inoltre, questo elude la possibilità di modifiche compensative che si verificano durante lo sviluppo, che a volte una rappresenti limitata variazione fenotipica osservata nei topi knockout. Inoltre, utilizzando schiere di topi che sono stati microiniettati in vari momenti durante il comportamento può consentire di nessi causali da effettuare tra un cambiamento di espressione genica e di un cambiamento nel comportamento. Importantly, questa tecnica può essere applicata a diversi paradigmi comportamentali cocaina tra cui auto-somministrazione e psicomotoria sensibilizzazione.
E 'importante attendere almeno 10-14 giorni dopo interventi chirurgici al fine di garantire che l'attivazione massima di Cre ricombinasi è verificato 20. Cominciando test comportamentali prima di questo può comportare l'uso di topi con una quantità sconosciuta di espressione sub-massimale Cre, rendendo rilevamenti comportamentali di difficile interpretazione. Attivazione massima di Cre risultati in knockout completa di un gene, tuttavia, questo si verifica solo in cellule che sono in realtà infetti. A seconda del volume e il titolo del vettore virale, circa il 50-70% delle cellule sono infettate per una data regione causando la corrispondente quantità di mRNA e knockout proteina che può portare a qualche espressione genica residuo (Figura 1C). Tuttavia, abbiamo dimostrato che un mRNA 50-60% questo tipo di knockout è sufficiente ad alterare l'espressionedi sensibilizzazione psicomotoria 14. Inoltre, questo metodo è ideale per paradigmi comportamentali più come un tempo di attivazione Cre avviene in vivo, la sua espressione e il corrispondente gene knockout dura per almeno 6 mesi 21.
Se uno è interessato a esaminare il ruolo di un gene per un periodo più discreto di tempo però, questo non è possibile con questo metodo particolare. Per l'espressione più breve termine, herpes simplex vettori virali (HSV) possono essere utilizzati, che preferenzialmente infettare neuroni 22. Rispetto alla espressione rAAV di Cre ricombinasi, che persiste per periodi più lunghi come il promotore non viene tacitato dopo giorni o settimane in vivo 23 vettori HSV sono da preferire per l'espressione transiente in quanto esprimono in vivo per giorni. Vettori HSV sono anche vantaggioso in quanto dimostrano l'ampia efficienza di trasduzione e che gli helper stock di virus-esenti esistere 22. Inoltre, i vettori HSV possono anche esprimere Cre recombinase e mediare l'escissione di sequenze floxed sia in coltura e in vivo 24. Tuttavia, è stato trovato citotossicità occasionale.
Quasi ogni regione all'interno del cervello può essere mirata utilizzando questa tecnica microiniezione. Quando si tenta di indirizzare subregioni più piccole all'interno di una regione più ampia, uno potrebbe essere necessario ottimizzare la quantità di vettore virale usato. Per esempio, abbiamo microiniettati 0,5 l di rAAV-Cre-GFP di indirizzare il NAC e dell'area ventrale tegmentale (VTA) 14, mentre quando il targeting grandi strutture come l'ippocampo e la corteccia, Ahmed e colleghi hanno usato 20 0,8 ml di rAAV-Cre. In alternativa, esplorando varie opzioni sierotipo che ogni hanno diffusione differenziale e proprietà infettività (vedi Choi et al. (2005), 25 per la revisione) può aiutare nella mira un minore, l'area più definito. Al contrario, se il tentativo di indirizzare una regione più ampia, si può aumentare il volume del vettore virale microiniettati. Questo is più efficace che utilizzando elevati titoli vettoriali come probabilmente resa infezioni aggiuntive per cella a differenza di un alto numero di cellule totali infettate 22. Inoltre, si possono eseguire più iniezioni all'interno di una regione o in più regioni, per infettare in modo più efficace di una zona più ampia 26.
Utilizzo di vettori rAAV è anche vantaggioso se confrontato con altri vettori virali che vengono utilizzati per esaminare la funzione cerebrale e malattie. In particolare, i vettori tradizionali adenoviral rivelata problematica in quanto indotti risposte infiammatorie gravi, mentre altri vettori, come retrovirus e lentivirus possono comportare problemi di mutagenesi inserzionale. rAAV è un parvovirus benigno e non vi è alcuna malattia nota associata ad infezione rAAV. Inoltre, a differenza di altri vettori virali, trasduzione con rAAV avviene senza l'espressione di proteine virali native AAV 27, rendendo effetti secondari su cellule bersaglio molto meno di una preoccupazione.rAAV vettori possono essere prodotti in titoli elevati e possono trasdurre neuroni post-mitotici nel cervello in modo altamente spazialmente localizzato 21,28. Inoltre, i vettori rAAV sono ora generati che può avere come bersaglio specifici sottotipi di neuroni nel cervello di topo 29 e sistemi di espressione rAAV Cre-dipendenti sono anche sempre più diffuso (vedi (2010), Zhang et al. 30 per la revisione).
In sintesi, la cocaina CPP serve come strumento comportamentale semplice ma informativo per studiare cocaina apprendimento contestuale rilevanti per l'acquisizione, l'estinzione, e la reintegrazione di cocaina comportamento di ricerca. Una combinazione di utilizzare rAAV esprimono Cre ricombinasi in topi portatori di un allele floxed con CPP fornisce una potente strategia per esplorare il ruolo dei geni bersaglio in specifiche regioni cerebrali che mediano il comportamento di ricerca della cocaina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Anni Lee e Maureen Byrne per il loro aiuto nello stabilire il luogo protocollo esteso preferenza condizionata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
| Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
| rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
| rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |
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