Summary
En este artículo se describe cómo microinject vectores virales en el cerebro del ratón y luego probar en un paradigma de preferencia un lugar acondicionado que incluye una fase de adquisición, extinción y reintegro.
Abstract
Microinyección recombinante vectores virales adenoasociados (rAAV) que expresan la recombinasa Cre en distintas regiones del cerebro del ratón se convierte selectivamente genes knockout de interés permite un mejor control temporal y regionalmente específica de supresión de genes, en comparación con los métodos existentes. Mientras que la supresión condicional también se puede lograr por los ratones de apareamiento que expresan la recombinasa Cre bajo el control de promotores de genes específicos con ratones que portan un gen floxed, microinyección estereotáxica permite la selección de las zonas discretas del cerebro en puntos de tiempo experimentador-determinadas de interés. En el contexto de la cocaína lugar acondicionado preferencia, y otros paradigmas de comportamiento cocaína tales como la auto-administración o sensibilización psicomotora que puede implicar la retirada, extinción y / o fases de reinstalación, esta técnica es particularmente útil en la exploración de la contribución única de los genes diana a estos distintos fases de los modelos de comportamiento de plasticidad inducida por la cocaína. Específicamente,esta técnica permite la ablación selectiva de los genes diana durante las fases discretas de un comportamiento a prueba su contribución al comportamiento a través del tiempo. En última instancia, este conocimiento permite terapias más específicas que están en mejores condiciones para hacer frente a los factores de riesgo más potentes que se presentan durante cada fase de la conducta adictiva.
Introduction
La cocaína es un psicoestimulante altamente de refuerzo. Después de la exposición repetida, varias adaptaciones moleculares y celulares que ocurren en la recompensa correspondiente circuitos del cerebro que se cree que resulta en compulsiva búsqueda de drogas, lo que provocó altas tasas de recaída que representan un grave problema clínico 1. La cocaína ejerce estos efectos en el comportamiento de larga duración mediante la regulación de la expresión génica. Para estudiar las adaptaciones que surgen del uso crónico de la cocaína, modelos de roedores preclínicos se han utilizado ampliamente. Uno de estos modelos es el lugar de preferencia paradigma condicionado (CPP). Este modelo implica el desarrollo de una asociación entre un medio ambiente aprendido previamente neutro y las propiedades de recompensa de la cocaína. Después de varias parejas de cocaína con una cámara en particular, los animales se les permite explorar libremente los entornos de cocaína apareadas y no apareadas cocaína y si prefieren el compartimiento de las drogas de pares, que se dice que han adquirido una plac inducida por cocaínapreferencia de correo. Por otra parte, después de un período de entrenamiento de extinción, este paradigma se puede utilizar para estudiar el restablecimiento contexto específico de la cocaína de la conducta de búsqueda.
En comparación con otros modelos de comportamiento de comportamiento adictivo-como, tales como la sensibilización psicomotora, que se utiliza para estudiar a largo plazo inducida por la cocaína y la plasticidad de comportamiento molecular de 2,3 y la auto-administración (SA), que se cree que con más precisión imitan adictivo un comportamiento similar se encuentra en los seres humanos, el paradigma CPP es un procedimiento simple para estudiar la cocaína aprendizaje contextual 4. Protocolos de CPP pueden ser convenientemente ampliarse para incluir la extinción y fases de reintegro, al igual que SA, que permiten la investigación de los mecanismos que subyacen ansia por la droga y la recaída 5-7 y que se cree que recapitular los aspectos de lo que ocurre en el hombre la búsqueda de drogas y el narcotráfico - y cue-inducida recaída 8-10.
Un mecanismo que subyace a lainducido por cocaína plasticidad de comportamiento que es característico de cada una de las distintas fases de la CPP, incluyendo la adquisición, la extinción, y el restablecimiento, es la activación de firmas únicas de la expresión de genes dentro de las diferentes regiones del cerebro. Para probar directamente que los genes dentro de las regiones cerebrales relevantes para mediar recompensa inducido por cocaína cambios de comportamiento, es útil ser capaz de manipular de forma selectiva de una manera regionalmente específica. Una forma de lograr esto es a microinject recombinantes vectores virales adenoasociados (rAAV) que expresan la recombinasa Cre utilizando la cirugía estereotáxica, en distintas áreas del cerebro de ratones que tienen genes diana flanqueado por sitios LoxP (ratones floxed). Este método permite un control temporal y regional muy preciso sobre el momento y donde los genes se realiza la ablación, tanto en neuronas que dividen y que no se dividen, sin inducir respuestas inmunes 11-13. Este nivel de control representa una importante ventaja sobre la tecnología tradicional Cre-loxP de criar ratones floxed with ratones que expresan la recombinasa Cre bajo el control de un promotor de gen endógeno, en el que el tiempo y distribución de supresión de genes pueden ser reguladas con más fuerza. Además, viral génica mediada por vectores evita posibles efectos compensatorios de desarrollo que pueden producirse utilizando estrategias knockout tradicionales.
En adición a la cocaína CPP, que se describe aquí, la microinyección de rAAV-Cre en el cerebro de los ratones floxed para evaluar el papel de los genes específicos se puede aplicar ubicua a paradigmas de comportamiento que implican fases separadas, incluyendo la auto-administración y la sensibilización psicomotora. Por ejemplo, nuestro laboratorio ha utilizado la tecnología de rAAV-Cre para estudiar el papel de Ca v 1.2 2 canales tipo L de Ca + en cocaína sensibilización psicomotora 14. Específicamente, rAAV-Cre se microinyectó en el núcleo accumbens (NAc) de ratones con el gen que codifica Ca v 1.2 floxed, para demostrar que el Ca v 14,15. Sin embargo, la estrategia de rAAV-Cre no se puede utilizar si no existen ratones con un gen floxed de interés, como fue nuestra experiencia cuando la evaluación de la función de Ca v 1.3 2 canales de tipo L Ca + en la sensibilización psicomotora. Por lo tanto, una limitación de la utilización de rAAV-Cre se presenta si los ratones condicionales no existen para un gen particular de interés. Sin embargo, rAAVs que expresan siRNA se puede utilizar para los genes diana desmontables, como lo hemos hecho para examinar el papel de Ca v 1.3 canales 14,15.
Microinyección de rAAV-Cre en regiones discretas del cerebro de ratones floxed y luego ponerlos a prueba en el paradigma de la CPP permite la investigación de los genes específicos que median en las diversas fases de comportamiento adictivo-como y donde están actuando. El uso de este paradigma ha ayudado en nuestra comprensión de cómo la administración repetida de cocaína, en esencia, secuestra el brains circuito de recompensa causando cambios inadaptadas en las vías de transducción de señales moleculares y la expresión génica que conducen al estado de adicción 1,16,17.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con el Weill Cornell Medical College Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión reglas.
1. Preparación y configuración de la administración estereotáxica de vectores virales
- Si un instrumento, hisopo estéril, o la mano usando guantes estériles están contaminados por el contacto con una superficie no estéril, deseche o volver a esterilizar el instrumento con un esterilizador de cuentas caliente, deseche el hisopo o cambiar a los nuevos guantes estériles.
- Coloque una jaula del ratón con ropa de cama en un bloque de calor para calentar para la recuperación post-operatorio.
- Configure afeitadora eléctrica para afeitarse la cabeza y el etanol y el yodo para esterilizar el cuero cabelludo.
- Limpie los oídos bares y bodegas de la boca del stereotax con etanol al 70%.
- Usando una jeringa de 5 l Hamilton, elaborará 5 l de vector viral (1 x 10 6 partículas virales / l) y creada en el soporte de jeringa stereotax.
- Microondas almohadilla térmica o gire la almohadilla eléctrica sobre unº lugar en stereotax. Cubrir con una almohadilla absorbente limpio para reducir el riesgo de quemaduras. Monitor de temperatura del cuerpo del ratón (entre 97 a 99,5 ° F) con frecuencia durante todo el procedimiento.
- Inyectar ratón (con un peso entre 22-35 g) con una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (20 mg / kg). Una vez que el ratón está anestesiado, pizca punta de la cola para comprobar los reflejos del ratón y tenga en cuenta cualquier movimiento o respuesta para asegurar que el ratón está adecuadamente anestesiado.
- Afeitarse la cabeza entre las orejas y los ojos.
- Limpie la cabeza rapada con etanol y yodo aplicadores de algodón estériles alterna.
- Traslado mouse pad de calefacción en stereotax.
2. La microinyección estereotáxica de vectores virales
- Use guantes estériles durante toda la cirugía. Si los guantes se contaminan en cualquier momento al tocar superficies no estériles, cambiar los guantes.
- Zero barra dentada y las escalas de barras para los oídos.
- Establecer los dientes en la barra de diente.
- Atornille hocico. Si se mueve o bigote movimientoción se observó en cualquier momento, administrar una dosis de refuerzo IP (~ 0,05 cc) de una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (20 mg / kg).
- Atornille las barras de oído.
- Lubricar los ojos con PuraLube.
- Cortar el cuero cabelludo abierto a apenas detrás de las orejas con un bisturí.
- Pinzas para sujetar papeles a cabo en las esquinas del cuero cabelludo a pelar la piel lejos de cráneo. Bregma y lambda debe ser fácilmente visible.
- Asegúrese de sutura a bregma lambda se alinea directamente. Si la sutura es el posicionamiento reajuste torcida de la cabeza.
- Asegúrese de que todos los ajustes del stereotax se ponen a cero.
- Coloque la punta de aguja en su lugar a bregma.
- Mida las coordenadas tanto para bregma y lambda. Esto incluye coordenadas dorsal / ventral, medial / lateral y anterior / posterior.
- Ajuste de la cabeza hasta que las coordenadas ventrales para bregma y lambda son dentro de 0,02 mm el uno del otro.
- Una vez alineados, desde el bregma ir medialmente a las coordenadas medial / lateral (M / L). Cerciorarselos lados izquierdo y derecho están alineados dentro de 0,02 mm el uno del otro.
- Re-centro de la punta de la aguja en bregma y a partir de ahí se mueve en la dirección anterior / posterior (A / P) para la coordenada anterior / posterior deseada.
- Si es necesario la aguja, el ángulo en una dirección y asegúrese de que el stereotax está bloqueado. Ir a la izquierda M / L de coordenadas (+ / - 1,52)
- Medir la posición ventral de la parte superior del cráneo para usar como una referencia después se perfora el pozo de sondeo.
- Perforar un pozo con una broca de estériles en la coordenada deseada. Compruebe que la aguja puede entrar sin interrupción a través del cráneo.
- Baje la aguja hasta la cota deseada ventral.
- Una vez alcanzada la cota, dip 0.015 mm por debajo de ~ 10 segundos para crear un pequeño espacio para el vector viral.
- Inyectar el volumen deseado de vector viral a una velocidad de ~ 0,1 l / min. Espere 3 minutos para el vector viral para difundir completamente. Levante la punta de la aguja de 0,015 mm y esperar otros 2 min.
- Sumergir la aguja (si haciendo inyecciones en ángulo) en la dirección opuesta. Una vez más, registrar la posición ventral como una referencia para la parte superior del cráneo.
- Repita los mismos pasos que en el primer lado para inyectar vector viral en el lado opuesto (en caso de hacer inyecciones bilaterales).
- Aplicar cera de hueso a ambos agujeros para sellarlos con el final de madera de un extremo del aplicador de algodón estéril.
- Suturar el cuero cabelludo.
- Aplicar el bloqueo del nervio a la zona de la herida.
- Retire ratón desde stereotax y colocar en la jaula calentado en el bloque de calor para recuperar durante 45 min.
- Vigilar los signos de dolor que incluyen: disminución de la actividad en general, inquietud, disminución de alimentos y el consumo de agua o el aumento de la vocalización. La buprenorfina (0,05-0,2 mg / kg) se puede administrar dos veces al día durante una semana si es necesario para el dolor. Alternativas aceptables incluyen: meperidina (20-60 mg / kg), pentazocina (10 mg / kg), nalbufina (4-8 mg / kg).
3. Preferencia de lugar condicionado: acquisition, extinción y reintegro
- Coloque los ratones en la sala central de un aparato de preferencia lugar de tres cámaras (Med Associates Inc., St. Albans, VT, EE.UU.) durante un periodo de habituación 60 segundos con puertas de guillotina cerrados.
- Después de habituación, puertas de guillotina abierta y permitir que los ratones sin la exploración de las 3 cámaras para 1200 seg, con el tiempo transcurrido en cada cámara está grabando con el software MedPC IV (Med Associates, Inc.).
- Asignar ratones para cámaras de acondicionamiento en base a su desempeño durante el pre-test. El uso de un diseño, administración arbitraria par medicamento durante los siguientes 3 días con el compartimiento que era menos preferido durante el pre-test basal.
- Durante los próximos 3 días acondicionado, se inyectan ratones con la cocaína (10 mg / kg, ip) durante la sesión de la mañana y confinarlos en su cámara asignada para 1200 segundos inmediatamente después de la inyección. Ratones Volver a sus jaulas después de la sesión. Después de 4 horas, se inyectan ratones con solución salina (0,01 ml / gpeso corporal) y las confinan a la cámara opuesta para la sesión de la tarde 1200 seg.
- Para la prueba de adquisición, lugar ratones en la cámara central con puertas de guillotina cerrados por un periodo de habituación 60 seg. Puertas de guillotina abierta y permitir la libre exploración de 1.200 seg, con el tiempo pasado en todas las cámaras grabadas por software MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calcular preferencia restando la cantidad de tiempo gastado en la cámara de solución salina-emparejado de la cantidad de tiempo gastado en la cámara de cocaína-dos a dos.
- Para apagar la preferencia de lugar, exponer ratones a dos sesiones de 20 min de la exploración libre de diarios en el mismo aparato, separados por al menos 2 horas, a partir de las 24 horas después de la prueba para la adquisición. El tiempo pasado en todas las cámaras de nuevo debe ser registrada y la magnitud de la CPP inicial debe ser comparado con el de cada sesión de extinción.
- Determinar si los ratones han apagado la preferencia inducida por medicamentos, evaluando si la preferencia por un parparticular a través de la cámara de dos días consecutivos de extinción es significativamente menor en comparación con la puntuación de preferencia de adquisición.
- Restablecer los ratones con una dosis de cebado de la cocaína (5 ó 10 mg / kg, ip) y volver a exponer al aparato que permite la exploración libre y registrar el tiempo empleado en cada compartimiento.
- Administrar solución de la eutanasia Euthasol (150 mg / kg). Transcardially perfundir ratones con 4% de paraformaldehído (PFA) y le realizará un examen histológico para validar la colocación correcta microinyección.
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Representative Results
CPP
Después de realizar CPP en ratones microinyectados, se debe verificar que la cohorte de control de inyección de (rAAV-GFP) ratones han adquirido normalmente preferencia por la cámara de drogas emparejado (Figura 1A, 1B). Los ratones se considera que han adquirido preferencia por una cámara en particular cuando preferencia cocaína (tiempo de permanencia en la cámara de la cocaína de pares de menos tiempo de permanencia en la cámara de solución salina-emparejado) es significativamente mayor en comparación con puntuación de preferencia línea de base (Figura 1B, A vs B) . Si, como una cohorte, los ratones de control inyectados no muestran una preferencia por la cámara de la cocaína de pares, o muestran una aversión, la colocación debe ser verificada de inmediato a través de la histología (ver rAAV Inyecciones subsección) y ratones con la colocación incorrecta debe ser desechada.
Si la preferencia ha sido normalmente adquirida por el grupo de control de inyección, se puede ampliar posteriormente el paradigma de inicio extinción (Figura 1A (Figura 1B, E3, E4, E5 vs A). En este momento, se puede restablecer con un primer fármaco (Figura 1A, 1B). Si la puntuación de preferencia después de la administración del primer fármaco es estadísticamente indistinguible de la de adquisición, a continuación, se dice que la cohorte de haber restablecido la preferencia inducida por fármacos para la cámara de droga-dos a dos (Figura 1B, R vs A).
rAAV microinyecciones
Antes de proseguir la estrategia experimental rAAV-Cre dentro de cualquier paradigma de comportamiento se debe verificar que rAAV-Cre se ha eliminado, de hecho, el gen de interés en ratones microinyectados por qPCR (Figura 1C) y / o western blot o el análisis inmunohistoquímico 18 </ Sup>. Por ejemplo, después de la microinyección de rAAV-Cre-GFP en el NAc de ratones que tenían el calcio de tipo L canal isoforma Ca v 1.2 floxed, rAAV-Cre golpes inyectados muestran una disminución significativa en la expresión de genes (Figura 1C). Además, hemos demostrado por el análisis inmunohistoquímico que rAAV-Cre puede proteína nocaut Ca v 1.2 en el cerebro del ratón 18. Después de todos los análisis de comportamiento, los ratones deben ser transcardially perfundidos con paraformaldehído al 4% y la inmunohistoquímica fluorescente se debe realizar para la proteína fluorescente verde (GFP). Si fueron atacados estructuras bilaterales, la colocación bilateral adecuada debe ser verificada mediante fluorescencia tinción inmunohistoquímica (Figura 1D, representante de la focalización de la NAC). Si el área correcta de hecho ha sido el blanco, la tinción debería ser visualizada exclusivamente en la región deseada y no fuera de él. Si una o ambas de las inyecciones son fuera de objetivo, los ratones deben ser retroactivaLY excluido del conjunto de datos CPP. Otra estrategia para la visualización de una orientación precisa de las regiones del cerebro infectadas por vectores virales y la posterior disección de la zona infectada para los análisis bioquímicos, se puede lograr utilizando una linterna GFP-iluminadora como se describe en Li y Wolf (2011) 19.
Figura 1A. Línea de tiempo experimental de rAAV-Cre microinyección y la preferencia de lugar de adquisición, extinción y el restablecimiento fases acondicionado. RAAV-Cre se microinyectó en la región de interés 2-3 semanas antes de la iniciación de las pruebas de comportamiento. Lugar acondicionado preferencia comienza con un pre-prueba para determinar los posibles sesgos iniciales, seguido por 3 días de acondicionamiento con la cocaína (10 mg / kg, ip). Cuatro horas después de cada sesión de condicionamiento cocaína, ratonesson tratados con solución salina y se limita a la cámara opuesta. Los siguientes días los ratones se ponen a prueba para la adquisición de un CPP. Formación Extinción comienza 24 horas después y supone 2 sesiones diarias, que están separados por al menos 2 horas, que permiten el libre acceso a todo el aparato. Una vez que los ratones han cumplido el criterio de extinción, se administran una inyección de cebado de la cocaína (10 mg / kg, ip) y el tiempo que pasan en todas las cámaras del aparato se evalúa para poner a prueba para el restablecimiento de la conducta de búsqueda de cocaína. Figura 1B. Los resultados representativos de línea de base, la adquisición, la extinción de formación, y de reinstalación. WT ratones C57BL/6J se trataron con cocaína durante los días 2, 3 y 4 de acondicionado. Los ratones expuestos adquisición, extinción y reintegro inducida por la cocaína (10 mg / kg ip de cocaína prime). *** P <0,001 frente a línea de base (B); # p <0,05 frente a la adquisición de (A). Línea de base, B, Adquisición, A; Extinction, E; Restablecimiento, R. Figura 1C. Stereotaxentrega ic de rAAV-Cre-GFP en el NAC de Ca 1,2 v ratones floxed disminuyó significativamente Ca v 1.2 mRNA. homocigotos Ca 1,2 v ratones floxed se microinyectaron con control (rAAV-GFP) o experimental (rAAV-Cre-GFP) vectores virales . Después de la activación máxima Cre, los ratones fueron sacrificados y se aisló el ARNm y los niveles relativos de expresión fueron examinados a través de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa usando Ca v 1.2 cebadores específicos. Administración estereotáxica de rAAV-Cre-GFP en el NAC de Ca 1,2 v ratones floxed Ca disminuyó significativamente los niveles de mRNA v 1.2, en comparación con los ratones inyectados con AAV-GFP. 1D † † p <0,001 frente rAAV-GFP. Figura. Las neuronas microinyectaron con rAAV-GFP en el ratón NAC. Homocigotos Ca 1,2 v ratones floxed se microinyectaron con rAAV-GFP para revisar la colocación bilateral adecuada en el NAC. Los ratones se sometieron a perfusión con PFA y se realizó inmunohistoquímica 4%. GFP tinción demostraciónTES orientación bilateral adecuada de la NAC. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
Regional-y la ablación génica temporal específica mediante microinyección estereotáxica de vectores virales combinadas con CPP, que incluye las fases de extinción y reintegro posibilite la investigación de las contribuciones específicas de genes en tres fases distintas de comportamiento adictivo similar. Mientras knockout condicional que se logra utilizando el sistema Cre-loxP tradicional prevé espacio-temporalmente la ablación génica restringidos, estereotáxicamente microinyección Cre-recombinasa en áreas discretas del cerebro de los ratones floxed permite un control aún más estricto de cuándo y dónde un gen es eliminado. Además, este evita la posibilidad de cambios compensatorios que ocurren durante el desarrollo, que a veces en cuenta la variación fenotípica limitada observada en los ratones knockout. Por otra parte, el uso de cohortes de ratones que fueron microinyectados en diversos puntos temporales durante el comportamiento puede permitir enlaces causales que se harán entre un cambio en la expresión génica y un cambio en el comportamiento. Importantly, esta técnica se puede aplicar a varios paradigmas de comportamiento diferentes de cocaína, incluyendo la auto-administración y la sensibilización psicomotora.
Es importante esperar por lo menos 10 a 14 días después de cirugía para asegurar que la activación máxima de la recombinasa Cre se ha producido 20. A partir de las pruebas de comportamiento antes de que esto puede resultar en el uso de ratones con una cantidad desconocida de expresión sub-máxima Cre, por lo que los resultados de comportamiento difícil de interpretar. La activación máxima de Cre resultado anulación completa de un gen, sin embargo, esto sólo ocurre en las células que son, de hecho, infectados. Dependiendo del volumen y el título del vector viral, aproximadamente el 50-70% de las células están infectadas de una región determinada que resulta en la cantidad correspondiente de ARNm y knockout de la proteína que puede dar lugar a cierta expresión génica residual (Figura 1C). Sin embargo, hemos demostrado que el ARNm de un 50-60% de este tipo de golpe de gracia es suficiente para alterar la expresiónde sensibilización psicomotora 14. Por otra parte, este método es ideal para los paradigmas de comportamiento ya como una vez se produce la activación Cre in vivo, su expresión y el correspondiente gen knockout tiene una duración de al menos 6 meses 21.
Si uno está interesado en examinar el papel de un gen en un período más discreto de tiempo, sin embargo, eso no es posible con este método en particular. Para la expresión a corto plazo, del herpes simple (HSV vectores virales) pueden ser usados, que preferentemente infectar neuronas 22. En comparación con la expresión rAAV de la recombinasa Cre, que persiste durante más tiempo que el promotor no se silencia después de días o semanas en vivo 23, se prefieren los vectores HSV para la expresión transitoria ya que expresan in vivo para el día. Vectores de HSV también son ventajosos en que demuestran la eficacia de transducción y amplia que las existencias libres de virus helper existir 22. Por otra parte, los vectores HSV también puede expresar Cre recombinase y mediar en la escisión de las secuencias de floxed tanto en cultivo e in vivo 24. Sin embargo, se ha observado citotoxicidad ocasional.
Casi cualquier región dentro del cerebro puede ser dirigido usando esta técnica de microinyección. Cuando se trata de orientar las subregiones más pequeñas dentro de una región más grande, uno puede necesitar para optimizar la cantidad de vector viral utilizado. Por ejemplo, nos microinyectados 0,5 l de rAAV-Cre-GFP para orientar la NAC y el área tegmental ventral (VTA) 14, mientras que cuando la orientación de las estructuras más grandes, tales como el hipocampo y la corteza, Ahmed y sus colegas utilizaron 20 0,8 l de rAAV-Cre. Alternativamente, explorando diversas opciones serotipo que cada uno tiene propagación diferencial y propiedades de infectividad (ver Choi et al. (2005) 25 para la revisión) puede ayudar en la selección de un área más pequeña, más definida. Por el contrario, si se intenta orientar una región más grande, se puede aumentar el volumen de vector viral microinyección. Este is más eficaz que la utilización de vector títulos más altos, ya que probablemente producen infecciones adicionales por célula en contraposición a un mayor número total de células infectadas 22. Además, uno puede realizar múltiples inyecciones dentro de una región, o a través de múltiples regiones, para infectar más eficazmente un área más grande 26.
El uso de vectores de VAAr es también ventajoso en comparación con otros vectores virales que se utilizan para examinar la función cerebral y la enfermedad. Específicamente, los vectores adenovirales tradicionales demostraron ser problemático en que indujeron respuestas inflamatorias severas, mientras que otros vectores, tales como retrovirus y lentivirus pueden implicar problemas con la mutagénesis de inserción. rAAV es un parvovirus benigna y no hay ninguna enfermedad conocida asociada con la infección por rAAV. Por otra parte, a diferencia de otros vectores virales, la transducción con rAAV se produce sin la expresión de las proteínas virales de AAV nativas 27, por lo que los efectos secundarios sobre las células diana mucho menos de una preocupación.vectores de rAAV se pueden producir en títulos elevados y pueden transducir neuronas post-mitóticas en el cerebro de una manera altamente espacialmente localizado 21,28. Además, ahora se están generando vectores rAAV que puede apuntar subtipos específicos de neuronas en el cerebro del ratón 29 y sistemas de expresión rAAV Cre-dependientes también son cada vez más ampliamente utilizado (véase Zhang et al. (2010) 30 para su revisión).
En resumen, la cocaína CPP sirve como una herramienta conductual simple pero informativo para estudiar la cocaína aprendizaje contextual correspondiente a la adquisición, extinción y el restablecimiento de la cocaína el comportamiento de búsqueda. Una combinación de la utilización de rAAV que expresa la recombinasa Cre en los ratones que llevan un alelo floxed con CPP proporciona una poderosa estrategia para explorar el papel de los genes diana en regiones específicas del cerebro que median la conducta de búsqueda de cocaína.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Anni Lee y Maureen Byrne por su ayuda en el establecimiento del protocolo de preferencia un lugar acondicionado extendida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
| Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
| rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
| rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |
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