Summary
हम यहां अभूतपूर्व throughput के साथ डीएनए की क्षति का धूमकेतु परख का पता लगाने की अनुमति देता है कि एक मंच का वर्णन. डिवाइस पैटर्न एक माइक्रोएरे में स्तनधारी कोशिकाओं और 96 नमूनों की समानांतर प्रसंस्करण में सक्षम बनाता है. दृष्टिकोण आधार स्तर डीएनए की क्षति, जोखिम प्रेरित डीएनए की क्षति और डीएनए की मरम्मत कैनेटीक्स के विश्लेषण की सुविधा.
Introduction
एकल कक्ष जेल वैद्युतकणसंचलन (धूमकेतु परख उर्फ) (SCGE) परख आधार घावों, abasic साइटों, एकल किनारा टूट जाता है, डबल किनारा टूट जाता है, crosslinks और संवेदनशील क्षार सहित डीएनए घावों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की मात्रा का ठहराव के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है साइटों. परख का मूल सिद्धांत क्षतिग्रस्त डीएनए undamaged डीएनए से कारण विखंडन और superhelical संरचना के नुकसान के लिए और अधिक आसानी से migrates है. प्रवास की हद तक डीएनए की क्षति की राशि के लिए आनुपातिक है, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग देखे जा सकते हैं. छवि पर कब्जा और व्यक्तिगत धूमकेतु के आकार का डीएनए की तीव्रता प्रोफाइल विश्लेषण तो एक सेल 1-4 भीतर डीएनए की क्षति के स्तर को प्रकट करने के पूंछ में इस तरह पूंछ की लंबाई, पूंछ पल, और% डीएनए के रूप में पैरामीटर माप देने.
एक) क्षारीय धूमकेतु परख और ख) तटस्थ धूमकेतु परख: वर्तमान में धूमकेतु परख की दो अधिक इस्तेमाल किया संस्करण हैं. क्षारीय धूमकेतु परख सबसे व्यापक रूप से हैइस प्रकार वैद्युतकणसंचलन पहले डीएनए खोलना करने के लिए एक उच्च पीएच बफर का उपयोग करता है और जो खेतों में संस्करण, किनारा टूट जाता है और क्षार संवेदनशील साइटों के सभी प्रकार का पता लगाता है. यह डबल helices बनाए रखने और केवल डबल किनारा टूट 2,5 पता लगाने के लिए एक तटस्थ बफर का उपयोग करता है क्योंकि तटस्थ धूमकेतु परख, दूसरे हाथ पर, कम प्रचलित है. DSBs प्रेरित कि रासायनिक और भौतिक एजेंट के लिए, SSBs संगीत कार्यक्रम में बनाए जाते हैं, और बहुत उच्च स्तर पर गठन कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, γIR प्रेरित SSBs DSBs से अधिक आम परिमाण के एक आदेश हैं). सबसे डीएनए हानिकारक निवेश के लिए, DSBs बहुत कम लगातार डीएनए की क्षति के अन्य वर्गों की तुलना में कर रहे हैं, और इसलिए पता लगाने के लिए मुश्किल है. हम पिछले प्रकाशनों में दोनों संस्करणों का पता लगाने खिड़की का प्रदर्शन किया है. 6,7
धूमकेतु परख नियमित डीएनए की क्षति और मरम्मत और genotoxicity परीक्षण 1,2,8-15 पर बुनियादी अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया गया है, परख के कारण नमूना करने वाली गरीब reproducibility के होने की सूचना दी गई हैनमूना, व्यक्ति से व्यक्ति और प्रयोगशाला करने वाली प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता. छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण श्रमसाध्य हैं क्योंकि इसके अलावा, परख कम throughput के हिस्से में है. साथ में, इन सीमाओं बड़े पैमाने पर अध्ययन में अपने अपेक्षाकृत कम स्वीकृति के लिए योगदान करते हैं. इंजीनियरिंग तकनीकों और सिद्धांतों के एकीकरण के माध्यम से, CometChip पारंपरिक धूमकेतु परख 6,7 के साथ जुड़े रहे हैं कि throughput की समस्याओं और विसंगतियों के लिए एक समाधान पेश करती है. संक्षेप में, चिप बनाने के लिए, एक ढालना एक एकल कक्ष के रूप में के रूप में छोटे व्यास के साथ microposts बनाने के लिए photolithography का उपयोग microfabricated है. मोल्ड तो जेल solidifies के बाद microwells की एक सरणी में जिसके परिणामस्वरूप, पिघला हुआ agarose पर टिकट के लिए प्रयोग किया जाता है. चिप्स विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ संगत करने के लिए चर आकार के कुओं के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए विकसित किया जा रहा है. चिप लोड करने के लिए, मीडिया में कोशिकाओं गंभीरता से कुओं में बसने की अनुमति दी जाती है; अतिरिक्त कोशिकाओं धुल जाते हैं. फँसा कोशिकाओं तो हमें समझाया रहे हैंकम पिघलने बिंदु agarose की एक पतली परत आईएनजी, और एक अथाह 96 अच्छी तरह से थाली तो इसके नीचे की सतह पर microwells के सैकड़ों के साथ 96 macrowells, प्रत्येक बनाने के लिए जेल सतह पर clamped है.
इस प्रोटोकॉल जेल तैयारी, सेल लोड हो रहा है, खुराक और मरम्मत, सेल, वैद्युतकणसंचलन, और फ्लोरोसेंट इमेजिंग में शामिल हैं जो इस चिप के साथ प्रयोगों के लिए सामान्य प्रक्रियाओं का वर्णन है. हम क्षारीय और क्रमशः परख के तटस्थ संस्करणों का उपयोग कर, जाना जाता डीएनए हानिकारक एजेंटों उजागर lymphoblast कोशिकाओं के साथ खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों के दो उदाहरण प्रदर्शित करता है. दो मरम्मत प्रयोगों भी मरम्मत प्रतिक्रिया के बाद जोखिम प्रणाली का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है कि कैसे वर्णन करने के लिए दिखाए जाते हैं.
Protocol
चिप की 1. तैयारी
- नीचे एक एक अच्छी तरह आयताकार थाली, जेल फिल्म पक्ष में पैकेज और जगह से चिप जेल निकालें.
- दो बार दोहराएँ, 15 मिनट के लिए पीबीएस 1x 25 एमएल में जेल धो लें.
- ग्लास प्लेट और तदनुसार जेल के लेबल उन्मुखीकरण पर सेट जेल.
- धीरे जेल पर एक औंधा अथाह 96 अच्छी तरह से थाली दबाएँ; अथाह अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं जेल के क्षेत्र के भीतर कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
- कांच के साथ clamping सुरक्षित करने के लिए थाली के प्रत्येक पक्ष पर 1.5 '' बांधने की मशीन क्लिप का प्रयोग करें.
- अतिरिक्त पीबीएस बंद महाप्राण अच्छी तरह से प्रत्येक में बफर.
2 लोड हो रहा प्रकोष्ठों
- सेल निलंबन की तैयारी:
- निलंबन सेल लाइनों के लिए, / एमएल 10 5 -10 6 कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया में सेल निलंबन पतला.
- पक्षपाती सेल लाइनों के लिए, सामान्य detaching / trypsinization प्रोटोकॉल और डी का पालन करें10 5 -10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए मीडिया में अलग कोशिकाओं ilute. कोशिकाओं कुल हैं, एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एक सेल फिल्टर में सेल निलंबन गुजरती हैं.
- 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें.
- जेल फिल्म के साथ कवर प्लेट मीडिया के वाष्पीकरण को रोकने के लिए.
- कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम 30 मिनट के लिए लोड करने के लिए अनुमति दें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से इनक्यूबेटर और महाप्राण मीडिया से चिप निकाल दें.
- बांधने की मशीन क्लिप और अथाह 96 अच्छी तरह से थाली निकालें; एक कोण पर कांच की थाली के साथ चिप पकड़ और धीरे agarose पर अतिरिक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ कुल्ला.
- एक 4X उद्देश्य लेंस के साथ एक चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग सेल लोडिंग की जाँच करें. अपर्याप्त लोड हो रहा है मनाया जाता है, 2.1 कदम से दोहराएँ.
- एक भी सतह (प्रयोगशाला बेंच) पर लोड चिप रखें. है कि 1% कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose के साथ ओवरले चिप 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म. लगभग प्रयोग 2̵1; एलएमपी agarose के 3 मिलीलीटर प्रत्येक चिप के लिए आवश्यक है.
- ओवरले 3 मिनट के लिए आरटी पर पहले जमना और फिर पूरा जमाना के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, फ्रिज में स्थानांतरित करने की अनुमति.
3 dosing और मरम्मत
नोट: आधारभूत डीएनए की क्षति स्तर के अध्ययन के चरण 4 पर छोड़ने के लिए.
- ध्यान से एक नए अथाह 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के साथ (पिछले clamping से बनाया) चिप के कुओं संरेखित. पुनः प्रेस बांधने की मशीन क्लिप के साथ शीर्ष और सुरक्षित clamping पर अथाह 96 अच्छी तरह से थाली.
- 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए यात्रा की खुराक के रसायन के 100 μl जोड़ें; बर्फ पर या समय के वांछित राशि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में खुराक / उपचार करते हैं.
- अच्छी तरह से प्रत्येक से, महाप्राण रसायन dosing और 1x पीबीएस का उपयोग अवशिष्ट रासायनिक दूर कुल्ला करने के बाद. प्रत्यक्ष नुकसान यहां अध्ययन किया जाता है, तो 4 कदम आगे बढ़ना.
- में सुधार करने के लिए चिप में कोशिकाओं, मरम्मत कैनेटीक्स अध्ययन की अनुमति के लिए37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया. Lyse विशिष्ट समय बिंदुओं पर (4 कदम आगे बढ़ना).
नोट: मरम्मत जुड़ी एक अथाह 96 अच्छी तरह से थाली के साथ पर चिप किया जा सकता है, या चिप अथाह 96 अच्छी तरह से थाली को हटाने के बाद अलग टुकड़ों में काटा जा सकता है.
4 Lysis
- क्षारीय धूमकेतु परख प्रदर्शन करने के लिए:
- 1% ट्राइटन X-100 सेल शेयर समाधान (2.5 एम NaCl, 100 मिमी ना 2 EDTA, 10 मिमी Tris, पीएच 10) Alkaline को जोड़कर क्षारीय lysis बफर काम कर रहे हैं. प्रत्येक चिप के लिए lysis बफर काम करने का लगभग 25 मिलीलीटर की तैयारी.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर क्षारीय lysis बफर काम कर रहे पूर्व सर्द.
- शांत काम कर क्षारीय lysis बफर में चिप डूब और सेल 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में हे / एन प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं.
- तटस्थ धूमकेतु परख प्रदर्शन करने के लिए:
- तटस्थ सेल शेयर समाधान (2.5 एम NaCl, 100 मिमी ना 2 EDTA, 10 को 1% ट्राइटन X-100 और 10% DMSO जोड़कर तटस्थ lysis बफर काम कर रहे हैंमिमी Tris, 1% एन -Lauroylsarcosine, पीएच 9.5). प्रत्येक चिप के लिए lysis बफर काम कर रहे लगभग 25 मिलीलीटर की तैयारी.
- 43 डिग्री सेल्सियस पर तटस्थ lysis बफर काम कर रहे पूर्व गर्म.
- गर्म काम कर तटस्थ lysis बफर में चिप डूब और सेल 43 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हे / एन प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं.
5 वैद्युतकणसंचलन
- क्षारीय धूमकेतु परख प्रदर्शन करने के लिए:
- 1x पीबीएस के साथ चिप कुल्ला जल्दी lysis बफर निकालें और.
- जेल फिल्म तरफ दो तरफा टेप का उपयोग कर नीचे का सामना करना पड़ के साथ एक वैद्युतकणसंचलन कक्ष में सुरक्षित चिप.
- 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे के लिए कक्ष लाओ.
- अभी जेल को शामिल किया गया है कि एक स्तर तक ठंड क्षारीय वैद्युतकणसंचलन बफर (0.3 एम NaOH, 1 मिमी ना 2 EDTA) के साथ चैम्बर भरें.
- 40 मिनट के लिए क्षारीय unwinding के लिए अनुमति दें.
- 1 वी / सेमी और ठंडे कमरे में 30 मिनट के लिए 300 मा वैद्युतकणसंचलन चलाएँ. चा में वैद्युतकणसंचलन बफर की मात्रा समायोजित करेंवांछित चल रहे मौजूदा प्राप्त करने के लिए mber.
- तटस्थ धूमकेतु परख प्रदर्शन करने के लिए:
- Lysis बफर निकालें और 2 एक्स 15 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए तटस्थ वैद्युतकणसंचलन बफर (2 मिमी ना 2 EDTA, 90 मिमी Tris, 90 मिमी बोरिक एसिड, पीएच 8.5) के साथ चिप कुल्ला.
- जेल फिल्म तरफ दो तरफा टेप का उपयोग कर नीचे का सामना करना पड़ के साथ एक वैद्युतकणसंचलन कक्ष में सुरक्षित चिप.
- 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे के लिए कक्ष लाओ.
- अभी जेल को शामिल किया गया है कि एक स्तर तक ठंड तटस्थ वैद्युतकणसंचलन बफर के साथ चैम्बर (2 मिमी ना 2 EDTA, 90 मिमी Tris, 90 मिमी बोरिक एसिड, पीएच 8.5) भरें.
- जेल में 60 मिनट के लिए ठंडे कमरे में बैठने की अनुमति.
- 0.6 वी / सेमी पर वैद्युतकणसंचलन भागो और ठंडे कमरे में 60 मिनट के लिए 6 मा. वांछित चल रहे मौजूदा प्राप्त करने के लिए कक्ष में वैद्युतकणसंचलन बफर की मात्रा समायोजित करें.
6 फ्लोरोसेंट इमेजिंग
- कर्नल से वैद्युतकणसंचलन कक्ष से चिप निकालेंडी कमरा.
- 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में 2 एक्स 15 मिनट के लिए बेअसर बफर (0.4 एम Tris, 7.5 पीएच) में जैल बेअसर.
- चुनाव के फ्लोरोसेंट डीएनए दाग के साथ चिप दाग (यानी, SYBR गोल्ड, ethidium ब्रोमाइड) कारखाने के तहत प्रक्रियाओं की सिफारिश की. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि.
7 डेटा विश्लेषण
ऐसे Komet 5.5 मानक के रूप में धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर द्वारा धूमकेतु छवियों का विश्लेषण.
Representative Results
यह पहला उदाहरण में, हम एच 2 ओ 2 का उपयोग oxidative नुकसान के लिए जोखिम के बाद मानव lymphoblastoid कोशिकाओं में डीएनए की क्षति का प्रारंभिक स्तर बढ़ाता के लिए दृष्टिकोण का वर्णन. एच 2 ओ 2 -induced आधार घावों और भी कतरा टूटता का आकलन करने के लिए, क्षारीय धूमकेतु शर्तों किया जाता है. लोड हो रहा है पूरा हो गया है और कोशिकाओं agarose ओवरले के साथ समझाया गया है, एक अथाह 96 अच्छी तरह से थाली चिप पर 96 डिब्बों बनाने के लिए सतह पर दबाया जाता है. 96 कुओं में से प्रत्येक एक अलग प्रकार या रसायनों की एकाग्रता के साथ dosed किया जा सकता है. यहां एच 2 ओ 2 के चार अलग अलग खुराक इस्तेमाल किया गया और 1x पीबीएस नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. Arrayed धूमकेतु के प्रतिनिधि छवियों गैर इलाज जहां चित्रा 1 ए, (ऊपर), 50 माइक्रोन (मध्य) और 100 माइक्रोन (नीचे) एच 2 ओ 2 -exposed नमूने धूमकेतु की पूंछ के विभिन्न स्तरों के प्रदर्शन में दिखाए जाते हैं. धूमकेतु छवियों का विश्लेषण प्रदर्शन किया जा सकता हैआम तौर पर प्रत्येक धूमकेतु की पूंछ की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता और प्रवास दूरी के आधार पर नुकसान का स्तर quantifies जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग मेड. माप आमतौर पर गणना की है 50 से 100 हालत प्रति धूमकेतु और औसत मूल्य (या तो% पूंछ डीएनए या पूंछ की लंबाई) पर प्रदर्शन कर रहे हैं. चित्रा 1 बी एच के चार अलग अलग सांद्रता के संपर्क में TK6 lymphoblastoid सेल धूमकेतु से विश्लेषण किया प्रतिशत पूंछ डीएनए प्रतिक्रिया वक्र दिखाता है 2 हे 2. स्वतंत्र प्रयोगों के बीच स्थिरता कोशिकाओं में रासायनिक उपचार के विभिन्न स्तरों से डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया का आकलन करने में इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता को दर्शाता है.
(Macrowells बीच जैसे,) और एक ही प्रयोग की दोहराता बीच नमूनों के बीच भिन्नता के बारे में जानने के लिए, अंतर नमूना और अंतर प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता क्रमशः 2A चित्रा और 2 बी में साजिश रची गई थी. 96-W के प्रत्येक प्रयोग के भीतर, प्रत्येक अच्छी तरह सेपक्ष चिप एक अलग नमूना के बराबर है और इसलिए अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से भिन्नता डिवाइस के परस्पर नमूना भिन्नता का पता चलता है. इधर, 96 अच्छी तरह से चिप के 12 कुओं में लोड TK6 कोशिकाओं एच 2 ओ 2 की एक ही खुराक के साथ इलाज किया गया और तुरंत उपचार के बाद lysed. अन्य सभी प्रयोगात्मक चरणों समानांतर में प्रदर्शन किया गया और प्रत्येक macrowell से कम से कम 50 धूमकेतु की medians 2A चित्रा में साजिश रची गया. मानक विचलन 3.99% है साथ medians के औसत, पूंछ में 77.53% डीएनए है. इन आंकड़ों से, हम नमूने के बीच भिन्नता का गुणांक इस परख 6,16 के बेहतर मजबूती का प्रदर्शन, पारंपरिक परख से गुना कम कई है, जो 5.2% है, कि गणना. परख के reproducibility के बारे में जानने के लिए, हम 75 माइक्रोन एच 2 ओ 2 के साथ एक चिप में TK6 कोशिकाओं अवगत कराया और डीएनए की क्षति की तत्काल स्तर का विश्लेषण. इस प्रयोग प्रत्येक प्रयोग के छह बार और डेटा एफ में साजिश रची गई थी दोहराया गयाigure 2 बी. समान प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, हम आंकड़ा में ग्रे सलाखों के रूप में दिखाया गया है, 57.87% से 41.76% से लेकर परिणाम प्राप्त की. छह दोहराता की औसत केवल 2.04% की मतलब की मानक त्रुटि के साथ, 49.57% है. दोहराता के बीच कम भिन्नता इस उपन्यास डिवाइस पर प्रदर्शन धूमकेतु परख अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि निकलता है.
मरम्मत कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं के इलाज के बाद नए सिरे से मीडिया में उनके डीएनए की मरम्मत के लिए अनुमति दी जाती है. विभिन्न समय बिंदुओं पर macrowells lysing समय के साथ डीएनए की क्षति में परिवर्तन का पता चलता है. एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. इस प्रयोग में, TK6 कोशिकाओं पहले, चिप में समझाया गया 50 माइक्रोन एच 2 ओ 2 के साथ व्यवहार, और 60 मिनट के बाद जोखिम अप करने के लिए सुधार करने की अनुमति दी. प्रकोष्ठों क्रमश: 0, 20, 45 और 60 मिनट में lysed गया. अलग अलग समय बिंदुओं पर प्रतिनिधि धूमकेतु छवियों चित्रा 3 ए में दिखाए जाते हैं, और समय के साथ डीएनए की क्षति के स्तर में परिवर्तन चित्रा में साजिश रची है3 बी. इस डेटा लगभग सभी क्षति के 2 ओ 2 उपचार 45 मिनट पद घंटे के भीतर मरम्मत की है कि पता चला. कई चर इस्तेमाल किया सेल लाइन और रासायनिक एजेंट के प्रकार सहित, मरम्मत की दर को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए शोधकर्ताओं प्रोटोकॉल (यानी, मरम्मत समय विस्तार) अपनी जांच में अतिरिक्त जरूरतों को पूरा करने के लिए परिवर्तन कर सकते हैं. यहाँ हम 7 methylguanine सहित आधार घावों को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है एक क्षारीकरण एजेंट TK6 कोशिकाओं को एक अलग genotoxic एजेंट एन -Methyl- एन '-Nitro- एन -Nitrosoguanidine (MNNG) के साथ चुनौती दी है जिसमें इस चिप का उपयोग कर मरम्मत प्रयोग का एक और उदाहरण है प्रदान और 3 methyladenine. इन घावों सहज depurination द्वारा या डीएनए glycosylases द्वारा एंजाइमी हटाने से या तो साइटों abasic में बदल रहे हैं. परिणामस्वरूप abasic साइट क्षारीय परिस्थितियों में cleaved है और इस तरह चिप पर पता लगाया जा सकता है. प्रारंभिक निवेश लंबे समय से स्पष्ट नुकसान में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनता हैकोशिकाओं की मरम्मत के दौरान बरकरार डीएनए बहाल रूप पूंछ, और समय के साथ इन पूंछ कम कर रहे हैं. Alkylation और oxidative नुकसान दोनों मुख्य रूप से आधार छांटना मरम्मत मार्ग की मरम्मत कर रहे हैं, उत्पन्न घावों की राशि और मरम्मत में शामिल प्रोटीन बदलती हैं. इन बदलावों साइटों, साथ ही परिणामस्वरूप abasic साइटों की मरम्मत के विभिन्न दरों abasic लिए रूपांतरण के विभिन्न दरों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. चित्रा 4 में, TK6 कोशिकाओं की मरम्मत कैनेटीक्स 0.1, 1 से अवगत कराया, और MNNG की 3 ग्राम / मिलीलीटर दिखाए जाते हैं. MNNG प्रेरित क्षति अब बच करने के लिए प्रकट होता है और एच 2 ओ 2 -induced नुकसान की तुलना में एक धीमी दर से मंजूरी दे दी है क्योंकि इस प्रयोग में, हम 2 घंटे के बाद जोखिम के लिए प्रयोग समय बढ़ाया.
तटस्थ शर्तों का उपयोग DSBs का विश्लेषण क्षारीय शर्तों का उपयोग एकल किनारा घावों के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के समान है. प्रारंभिक क्षति स्तर दिखाने के लिए, TK6 कोशिकाओं जीआईआर के चर स्तर से अवगत कराया गया, और जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं lysed और एक तटस्थ पीएच (चित्रा 5A) में electrophoresed गया. यह धूमकेतु की पूंछ की आकृति विज्ञान क्षारीय परख की स्थिति से अलग है कि उल्लेखनीय है. इस परख का उपयोग नमूदार खंडित डीएनए को प्राप्त करने के लिए, प्रयोग किया आईआर खुराक क्षारीय शर्तों का उपयोग क्षति देखने के लिए आवश्यक खुराक की तुलना में (0-100 Gy) काफी अधिक है. इसके अलावा, हम पूंछ की लंबाई तटस्थ धूमकेतु परख 7 का उपयोग करते समय डीएनए क्षति की सीमा को दर्शाती में सबसे संवेदनशील पैरामीटर है कि पाया. विश्लेषण किया खुराक प्रतिक्रिया वक्र चित्रा 5 ब में सचित्र है. कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा टूट की मरम्मत भी मूल्यांकन किया जा सकता है, और Weingeist एट द्वारा दिखाया गया है. अल. 7. साथ में ले ली, तटस्थ CometChip डीएनए DSBs के उच्च throughput विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है.
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चित्रा 1. एच 2 ओ 2 खुराक क्षारीय धूमकेतु परख का उपयोग TK6 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया. (ए) 50 माइक्रोन (मध्य) और 100 माइक्रोन से अवगत कराया इलाज TK6 lymphoblasts (ऊपर) और TK6 कोशिकाओं (नीचे) एच 2 ओ 2 से arrayed microwell धूमकेतु 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए. स्केल बार 100 मीटर है. (बी) एच एच 2 ओ 2 के विभिन्न स्तर के संपर्क में TK6 कोशिकाओं के 2 ओ 2 खुराक प्रतिक्रिया. प्रत्येक डेटा बिंदु पर कम से कम 50 व्यक्ति धूमकेतु की औसत प्रतिशत पूंछ डीएनए प्रत्येक प्रयोग में प्राप्त हुई थी जहां तीन स्वतंत्र प्रयोगों का औसत है. त्रुटि सलाखों तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. इंटर नमूना और इंटर प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता. (ए) नमूना नमूना भिन्नता. TK6 मानव lymphoblast कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से चिप के 12 कुओं में भरी हुई थी. हर अच्छी तरह से 50 माइक्रोन एच के 100 μl के संपर्क में था 2 ओ 2 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए. सेल तुरंत lysed और% टेल डीएनए के लिए assayed थे. प्रत्येक अच्छी तरह से डाटा यहाँ दिखाया गया है. प्रत्येक बॉक्स में मंझला प्रत्येक अच्छी तरह से कम से कम 50 व्यक्ति धूमकेतु का प्रतिनिधित्व करता है. 12 कुओं का मतलब मानक विचलन 3.99% है, और भिन्नता का गुणांक 5.2% होने की गणना की जाती है, 77.53% है. (बी) के प्रयोग करने के लिए प्रयोग मिलता है. TK6 मानव lymphoblast कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 75 माइक्रोन एच 2 ओ 2 के 100 μl के संपर्क में, 96 अच्छी तरह से चिप में भरी हुई थी. सेल तुरंत lysed और% टेल डीएनए के लिए assayed थे.एक ही प्रयोग 6 बार दोहराया गया था और प्रत्येक दोहराने का डेटा एक ग्रे पट्टी के रूप में दिखाया गया है. प्रत्येक बॉक्स में प्रत्येक दोहराने से कम से कम 100 व्यक्ति धूमकेतु की औसत% पूंछ डीएनए का प्रतिनिधित्व करता है. 6 दोहराता की औसत यहाँ वापस पट्टी के रूप में दिखाया गया है, 49.57% है. 6 दोहराता का मानक विचलन 4.99% है, और मतलब की मानक त्रुटि आंकड़ा में त्रुटि बार के रूप में प्रतिनिधित्व, 2.04% होने की गणना की जाती है.
TK6 lymphoblasts में चित्रा 3. एच की मरम्मत 2 हे 2 -induced क्षति. (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधि धूमकेतु के साथ मरम्मत अध्ययन की. TK6 कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए एजेंटों के साथ व्यवहार किया जाता है और सेल से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया में सुधार करने के लिए अनुमति दी जाती है. (बी) 4 & # पर 20 मिनट के लिए 50 माइक्रोन एच 2 ओ 2 के साथ उपचार के बाद TK6 कोशिकाओं की मरम्मत कैनेटीक्स176, सी. प्रत्येक डेटा बिंदु पर कम से कम 50 व्यक्ति धूमकेतु की औसत प्रतिशत पूंछ डीएनए प्रत्येक प्रयोग में प्राप्त हुई थी जहां तीन स्वतंत्र प्रयोगों का औसत है. त्रुटि सलाखों दोहरा प्रयोगों से मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
TK6 lymphoblasts में MNNG प्रेरित नुकसान का आंकड़ा 4. मरम्मत. TK6 कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.1, 1, और 3 ग्राम / मिलीलीटर MNNG के साथ इलाज किया और 120 मिनट पद के लिए ऊपर 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया में सुधार करने के लिए अनुमति दी जाती है जोखिम. कम से कम 50 व्यक्ति धूमकेतु की औसत प्रतिशत पूंछ डीएनए तीन स्वतंत्र प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए प्राप्त हुई थी. त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्वतीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब की.
40 Gy (मध्य) और 80 Gy (नीचे) गामा विकिरण के संपर्क में इलाज TK6 lymphoblasts (ऊपर) और TK6 कोशिकाओं से चित्रा 5. तटस्थ धूमकेतु परख का उपयोग TK6 कोशिकाओं की आईआर खुराक प्रतिक्रिया. (ए) arrayed microwell धूमकेतु. स्केल बार 100 मीटर है. गामा विकिरण के विभिन्न स्तर के संपर्क में TK6 कोशिकाओं (बी) आईआर खुराक प्रतिक्रिया. प्रत्येक डेटा बिंदु चिप पर छह macrowells से जमा कम से कम 300 धूमकेतु की औसत पूंछ की लंबाई (मीटर) का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
वातावरण में और भी मानव कोशिकाओं के भीतर सर्वव्यापी genotoxins अपरिहार्य तनाव और सेलुलर डीएनए को नुकसान डालती है. वास्तव में, यह स्थिर राज्य के 18 में मानव कोशिकाओं में मौजूद डीएनए घावों के 1000 से कर रहे हैं कि अनुमान लगाया गया है. मानव में क्षति संवेदनशीलता और मरम्मत कैनेटीक्स समझना न केवल बुनियादी अनुसंधान के लिए अंतर्दृष्टि लाता है, लेकिन यह भी दवा के विकास के लाभ. विडंबना यह है कि कैंसर को बढ़ावा देने के लिए डीएनए की क्षति की क्षमता के बावजूद, डीएनए हानिकारक एजेंटों, कैंसर के इलाज के डीएनए की क्षति के बारे में ज्ञान बनाने और व्यक्तिगत दवा के लिए प्रासंगिक मरम्मत करने के लिए बहुत उच्च स्तर पर किया जाता है. CometChip एक लंबे समय से अस्तित्व में डीएनए की क्षति परख में क्रांतिकारी बदलाव के लिए microfabrication प्रथाओं का इस्तेमाल करता है कि एक उपन्यास अनुसंधान उपकरण है. पारंपरिक धूमकेतु परख का एक ही सिद्धांत पर बिल्डिंग, चिप काफी उच्च throughput और बेहतर reproducibility प्रदान करता है. हम यहाँ इस चिप का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन. इसकी उपयोगिता और मजबूती स्पष्ट करने के लिए, हम fro परिणाम दिखानेएम चिप कई अलग डीएनए हानिकारक एजेंटों द्वारा प्रेरित क्षति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह डीएनए की मरम्मत का मूल्यांकन करने के लिए जहां इस्तेमाल किया गया है, जहां कई प्रयोगों. साथ में, यहाँ प्रस्तुत परिणामों चिप का उपयोग कर के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान करने और डीएनए की क्षति और मरम्मत पर अनुसंधान करने के लिए अपने व्यापक प्रयोज्यता प्रदर्शित करता है.
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक प्रभावी सेल लोड हो रहा है पूरा करने के लिए है. कई सेल लाइनों निलंबन और पक्षपाती कोशिकाओं दोनों सहित, इस प्रणाली पर परीक्षण किया गया है. दक्षता लोड हो रहा है इस तरह के सेल प्रकार, सेल आकार, लोडिंग एकाग्रता और समय के रूप में कई चर पर निर्भर करता है. ऐसे lymphoblastoid कोशिकाओं के रूप में निलंबन सेल लाइनों के साथ काम करने के लिए आसान कर रहे हैं. सेल निलंबन की एकाग्रता 96 अच्छी तरह से प्रति 4 अक्टूबर - 6 अक्टूबर कोशिकाओं से भिन्न हो सकती हैं और लदान आमतौर पर 15-30 मिनट में पूरा करती है. उच्च सेल घनत्व लोडिंग की सुविधा और microwells में व्यवस्थित करने के लिए कोशिकाओं के लिए आवश्यक समय की राशि को घटा.
पक्षपाती कोशिकाओं के लिए लोड हो रहा है मापदंडों निलंबन कोशिकाओं से अलग कर सकते हैं. इस तरह चीनी हैम्स्टर डिम्बग्रंथि (चो) कोशिकाओं, के रूप में सेल लाइनों निलंबन कोशिकाओं के रूप में इसी तरह की लोडिंग क्षमता (निम्न trypsinization) है और इस तरह समान लोडिंग की स्थिति का उपयोग करने के लिए मिला. इस तरह आसानी से निलंबन में सेल समुच्चय है कि फार्म का ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, अतिरिक्त निपटने की आवश्यकता है. निलंबन मीडिया को trypsin एक एकल कोशिका फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन गुजर रहा है और उनका कहना है लोड करने के दौरान सेल समूहों के गठन को दबा सकते हैं. अंत में, लोडिंग समय के संदर्भ में, समय 20 मिनट से 1 घंटे के लिए भिन्न हो सकते हैं microwells में पक्षपाती सेल लाइनों पर कब्जा करने के लिए जरूरी है. नतीजतन, यह उपयोगकर्ताओं को आगे की जांच के लिए आगे बढ़ने से पहले इष्टतम लोडिंग की स्थिति निर्धारित करने के लिए पायलट प्रयोगों प्रदर्शन की सिफारिश की है. लोड हो रहा है प्रभावकारिता DAPI या अन्य डीएनए के साथ समझाया कोशिकाओं धुंधला से अधिक सही पता चला एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे कल्पना या किया जा सकता हैफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन करने से पहले दाग.
इस विधि और चिप का एक प्रमुख लाभ बहुमुखी प्रतिभा है. सबसे पहले, अतिरिक्त कोशिकाओं धुल रहे हैं क्योंकि शोधकर्ताओं ने एक विशेष काम करने की सेल एकाग्रता के लिए ही सीमित नहीं हैं, और माइक्रोएरे वर्दी धूमकेतु घनत्व सुनिश्चित करता है. दूसरा, microwells विभिन्न आकार के सेल प्रकार समायोजित चर आकार के साथ बनाया जा सकता है. कई कोशिकाओं को एक एकल microwell में कब्जा कर रहे हैं कि परिस्थितियों में, बहु सेल धूमकेतु आत्म calibrated और उपज अनुरूप परिणाम एकल कक्ष धूमकेतु 6,7 की तुलना कर रहे हैं. एक माइक्रोएरे में कोशिकाओं patterning का एक अन्य लाभ सभी धूमकेतु की वजह अनफोकस्ड धूमकेतु के लिए शोर को कम करने और स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण की सुविधा, निर्धारित पदों के साथ ही फोकल हवाई जहाज़ पर फिर रहे हैं. CometChip द्वारा प्रदान throughput और संवेदनशीलता में महत्वपूर्ण सुधार बड़े आकार के अध्ययन के लिए परख के आवेदन कर सकें. साथ में ले ली, चिप प्रदानशोधकर्ताओं, toxicologists, चिकित्सकों और epidemiologists के लिए डीएनए की क्षति के आकलन के लिए एसए महत्वपूर्ण उपकरण.
धूमकेतु परख डीएनए की क्षति का एक व्यापक रेंज का पता लगाने में अपनी उत्कृष्ट संवेदनशीलता के लिए जाना जाता है, इस परख भी कम विशिष्टता से ग्रस्त है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग बहुत परख के reproducibility और throughput में सुधार, लेकिन विशिष्टता में उन्नति का प्रदर्शन नहीं करता है. बहरहाल, अन्य तरीकों के साथ परख उच्च विशिष्टता प्राप्त करने में प्रभावी होने के लिए सूचित किया गया है बहुसंकेतन. एक उदाहरण शुद्ध घाव विशेष एंजाइमों का समावेश है. इन एंजाइमों detectable किनारा टूट जाता है और abasic साइटों 1,19-21 में अन्यथा undetectable आधार घावों में बदल सकते हैं. एक व्यापक रूप से इस्तेमाल उदाहरण ऑक्सीडेटिव डीएनए संशोधनों 19,22 का पता चलता है जो मरम्मत endonuclease formamidopyrimidine-डीएनए (FPG), है. एंजाइम पाचन कदम सेल के बाद लागू किया जाता है, क्योंकि सिस्टम उसी तरह एक इलाज किया जा सकताप्रोटोकॉल के लिए परिवर्तन के बिना सा पारंपरिक agarose स्लाइड. विस्तृत प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित नहीं है हालांकि, इस दृष्टिकोण अतीत में कई पारंपरिक धूमकेतु परख उपयोगकर्ताओं द्वारा रूपांतरित किया गया है और प्रोटोकॉल आसानी से पाया जा सकता है. पिछले एक प्रकाशन में, हम फ्लोरोसेंट प्रकाश प्रेरित क्षति 22 की पहचान करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया.
इस विधि का प्रमुख लाभ पहले से लगभग असंभव थे कि पढ़ाई के लिए दरवाजे खोलता है जो यह प्रावधान throughput है. एक ही मंच पर 96 नमूने प्रक्रिया करने की क्षमता न केवल श्रम और समय कम कर देता है, लेकिन यह भी प्रयोगात्मक शोर कम कर देता है और बहुत reproducibility को बढ़ाता है. इंटर नमूना विभिन्नता इस चिप 6,7 के साथ मनाया भिन्नता से 2 गुना अधिक हो सकता है जो पारंपरिक स्लाइड करने वाली स्लाइड भिन्नता, की तुलना में काफी कम है. कम शोर भी नमूने के बीच और अधिक सूक्ष्म अंतर का पता लगाने को सक्षम करने, बेहतर संवेदनशीलता की ओर जाता है. इस उपकरण में एक स्टेशन को रोजगार क्योंकिndard 96 अच्छी तरह प्रारूप, यह सामान्य अनुसंधान उपकरण के साथ संगत है और प्रौद्योगिकियों HTS. एक औसत शोधकर्ता ~ कई दिनों के पाठ्यक्रम पर 30 गिलास स्लाइड प्रक्रिया कर सकते हैं यह सोचते हैं कि, 100 नमूनों के मूल्यांकन की आवश्यकता है कि एक अध्ययन पर विचार करें. प्रत्येक नमूना तीन प्रतियों में प्रदर्शन करने की जरूरत है कि यह देखते हुए, यह भी अनिवार्य रूप से बदलाव के नमूने के लिए नमूना से भुगतना होगा जो इस तरह के एक अध्ययन को पूरा करने के लिए लगभग एक महीने का समय लग जाएगा. इसके विपरीत, इस चिप के साथ प्रसंस्करण 100 की स्थिति, तीन प्रतियों में प्रत्येक, केवल कुछ प्लेटों की आवश्यकता है और तीन दिन में किया जा सकता है. Throughput में यह बड़ा सुधार अप्राप्य थे कि पढ़ाई करने के लिए दरवाजे खोलता है.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानक धूमकेतु परख प्रदर्शन के लिए बुनियादी प्रक्रियाओं और CometChip मंच का उपयोग करने के लिए आवश्यक संशोधित चरणों दोनों का वर्णन करता है. निहित डीएनए की क्षति के स्तर और बाद में मरम्मत प्रतिक्रिया दोनों को मापने की क्षमता के साथ, परख के लिए प्रासंगिक हैजैविक और नैदानिक अनुप्रयोगों की एक किस्म. जीनोम पर विशिष्ट रासायनिक जोखिम के प्रभाव पर सूचना बीमारी की रोकथाम और उपचार की सुविधा. इसके अलावा, डीएनए की क्षति संवेदनशीलता और व्यक्तियों 23,24 के बीच की मरम्मत की क्षमता में बदलाव का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हित भी है. इस तकनीक को इस तरह के बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए आवश्यक throughput प्रदान करता है. परस्पर व्यक्तिगत विविधताओं के बारे में ज्ञान अतिसंवेदनशील लोगों की पहचान करने के लिए और व्यक्तिगत उपचारों या preventions रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ प्रस्तुत प्रौद्योगिकी निकट भविष्य में एक मानक पद्धति बनने की क्षमता है कि एक उच्च throughput, उद्देश्य और मात्रात्मक डीएनए की क्षति विश्लेषण मंच प्रदान करता है, साथ में ले ली.
Acknowledgments
यह काम मुख्य रूप से 1-R21-ES019498 और R44-ES021116 से आंशिक समर्थन के साथ 5 UO1-ES016045 द्वारा समर्थन किया गया था. डीएमडब्ल्यू पर्यावरण विष विज्ञान T32-ES007020 में NIEHS प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. उपकरण पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान P30-ES002109 के लिए केंद्र द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-well plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5' binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
References
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