Summary
Vi beskriver her en platform, der giver comet assay påvisning af DNA-skader med en hidtil uset overførselshastighed. Enheden mønstre pattedyr celler i en microarray og muliggør parallel behandling af 96 prøver. Den tilgang letter analysen af basisniveau DNA-skader eksponering-induceret DNA-skader og DNA reparation kinetik.
Introduction
Enkelt celle gel elektroforese (SCGE) assay (aka comet assay) er en meget anvendt teknik til kvantificering af et bredt spektrum af DNA-læsioner, herunder base-læsioner, abasiske steder, enlige strengbrud, dobbelt strengbrud, tværbindinger og alkali følsomme websteder. Det underliggende princip for analysen er, at beskadiget DNA vandrer lettere end ubeskadiget DNA på grund af fragmentering og tab af superspiraldensitet struktur. Omfanget af migration er proportional med mængden af DNA-skader, og kan visualiseres ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Image-opsamling og intensitet profil analyse af de enkelte komet-formede DNA derefter levere parameter målinger såsom hale længde, hale øjeblik, og% DNA i halen til at afsløre omfanget af DNA-skader i en celle 1-4.
I øjeblikket er der to almindeligt anvendte versioner af comet assay: a) alkalisk comet assay og b), neutrale comet assay. Den alkaliske comet assay er det mestBrugte udgave, som bruger en høj pH buffer til at slappe af DNA før elektroforese og dermed registrerer alle typer af streng brud og til alkali-følsomme steder. Den neutrale comet assay på den anden side er mindre øvede fordi den bruger en neutral buffer til at opretholde de dobbelte helixer og detektere kun dobbeltstrengede brud 2,5. For kemiske og fysiske midler, der inducerer DSB'er er SSB'er skabt i koncerten, og er dannet ved meget højere niveauer (f.eks γIR-inducerede SSB'er er en størrelsesorden mere udbredt end DSBs). For de fleste DNA-ødelæggende engagementer DSB'er er langt sjældnere end andre klasser af DNA-skader, og er derfor sværere at opdage. Vi har vist i tidligere udgivelser detektionsvinduet af begge versioner. 6,7
Selvom kometen assay er blevet rutinemæssigt anvendes til grundforskning på DNA-skader og reparation og genotoksicitet 1,2,8-15 er analysen blevet rapporteret at have dårlig reproducerbarhed på grund af prøve-til-prøve, person-til-person, og lab-til-lab variabilitet. Desuden er assayet lav gennemstrømning, delvis fordi erhvervelse billede og dataanalyse er arbejdskrævende. Tilsammen udgør disse begrænsninger bidrager til den relativt lille accept i store studier. Gennem integration af tekniske teknologier og principper, CometChip bringer en løsning på problemerne med gennemløb og uoverensstemmelser, der er forbundet med den traditionelle comet assay 6,7. Kort fortalt, for at skabe chippen er en støbeform mikrofremstillet hjælp fotolitografi at skabe microposts med diametre så små som en enkelt celle. Formen er derefter anvendt til at stemple den smeltede agarose, hvilket resulterer i et array af mikrobrønde efter gel størkner. Chips bliver udviklet til at give forskerne med variabel størrelse brønde til kompatible med forskellige celletyper. For at indlæse chippen, er celler i medierne lov til at bosætte sig i brøndene ved hjælp af tyngdekraften; overskydende celler vaskes væk. Trapped celler indkapsles derefter osing et tyndt lag af agarose med lavt smeltepunkt, og et bundløst 96 brøndplade klemmes derefter til gelen overflade for at skabe 96 macrowells, hver med hundredvis af mikrobrønde på dens bundflade.
Denne protokol beskriver de generelle procedurer til forsøg med denne chip, som omfatter forberedelse gel, celle lastning, dosering og reparation, cellelysis, elektroforese, og fluorescerende billeddannelse. Vi viser to eksempler på dosis-respons eksperimenter med lymfoblast-celler udsat kendt DNA-ødelæggende midler, ved hjælp af alkaliske og neutrale udgaver af assayet hhv. To reparation eksperimenter er også vist sig at beskrive, hvordan reparere reaktion efter eksponering kan evalueres ved hjælp af systemet.
Protocol
1. Fremstilling af Chip
- Fjern chip gel fra emballagen og sted i en et-godt rektangulær plade, gel film nedad.
- Vask gel i 25 ml 1x PBS i 15 minutter, gentages to gange.
- Set gel på glasplade og etiket orientering gel i overensstemmelse hermed.
- Tryk forsigtigt en inverteret bundløse plade med 96 brønde på gelen; sørge for, at alle huller i bundløse brønds plade inden for det område af gelen.
- Brug 1.5 '' bindemiddel klip på hver side af pladen for at sikre fastspænding med glasset.
- Aspirer overskydende PBS-buffer i hver brønd.
2. Ilægning Celler
- Forbered cellesuspensioner:
- Til suspension cellelinjer, fortyndes cellesuspension i medium til opnåelse af en slutkoncentration på 10 5 -10 6 celler / ml.
- For vedhængende cellelinier følge den normale AFMONTERER / trypsinisering protokoller og dilute løsnede celler i mediet til en slutkoncentration på 10 5 -10 6 celler / ml. Hvis cellerne aggregerer, pass cellesuspension i en celle-filter til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
- Tilsæt 100 pi af cellesuspension til hver brønd af 96-brønds plade.
- Dækplade med gelen filmen for at forhindre fordampning af mediet.
- Tillad celler til at indlæse mindst 30 minutter i 37 ° C inkubator.
- Fjern chip fra inkubatoren og aspiratprøver medier fra hver brønd.
- Fjern bindemiddel klip og bundløse plade med 96 brønde; holde chippen med glasplade i en vinkel og forsigtigt skylle med 1x PBS for at fjerne overskydende celler på agarose.
- Tjek celle pålæsning med et lyst felt mikroskop med en 4X objektiv. Hvis der observeres utilstrækkelig lastning, gentag fra trin 2.1.
- Placer indlæst chip på en jævn overflade (lab bænk). Overlay chip med 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose, der er forvarmet ved 37 ° C. Brug ca 2̵1, 3 ml LMP agarose er nødvendig for hver chip.
- Tillad overlay at størkne først ved stuetemperatur i 3 minutter og derefter flytte til 4 ° C køleskab i 5 min til fuldstændig gelering.
3. Dosering og reparation
BEMÆRK: For at studere baseline DNA-skader niveau, skal du springe til Trin 4.
- Ret omhyggeligt brøndene af chippen (skabt af tidligere fastspænding) med brøndene i en ny bundløs 96-brønds plade. Tryk igen på den bundløse 96-brønds plade på toppen og sikker fastspænding med bindemiddel klip.
- Tilsæt 100 pi kemisk af den ønskede dosis til hver brønd af 96-brønds plade; udføre dosering / behandling på is eller i 4 ° C køleskab for den ønskede tid.
- Efter dosering aspiratprøver kemikalier fra hver brønd og skylles væk kemikalierester hjælp 1x PBS. Hvis de direkte skader er undersøgt her, gå til trin 4.
- For at undersøge reparation kinetik tillade cellerne i chippen til at reparere imedier ved 37 ° C. Lyse (fortsæt til trin 4) på bestemte tidspunkter.
BEMÆRK: reparation kan udføres på chippen med et bundløst 96-brønds plade fastgjort, eller at chippen kan skæres i separate stykker efter fjernelse af den bundløse 96-brønds plade.
4. Lysis
- For at udføre alkalisk comet assay:
- Gør arbejder alkalisk lysepuffer ved tilsætning af 1% Triton X-100 til alkalisk lyse stamopløsning (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10). Forbered ca. 25 ml arbejde lysebuffer for hver chip.
- Pre-chill arbejder af alkalisk lysis-buffer ved 4 ° C.
- Sænk chip i køligt arbejder alkalisk lysisbuffer og tillade lyse for at udføre O / N i 4 ° C køleskab.
- For at udføre neutral comet assay:
- Gør arbejder neutralt lysepuffer ved tilsætning af 1% Triton X-100 og 10% DMSO til neutral lyse stamopløsning (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Forbered ca. 25 ml arbejder lyseringsbuffer til hver chip.
- Pre-varme arbejder neutralt lysepuffer ved 43 ° C.
- Nedsænkes chip i varmt arbejde neutralt lysisbuffer og tillade lysering at udføre O / N i 43 ° C inkubator.
5. elektroforese
- For at udføre alkalisk comet assay:
- Fjern lysepuffer og hurtigt skylles chip med 1x PBS.
- Sikker chip i en elektroforese kammer med gel film nedad ved hjælp af dobbeltklæbende tape.
- Bring kammer til et 4 ° C koldt rum.
- Fyld kammeret med koldt basisk elektroforese-buffer (0,3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) til et niveau, der kun dækker gelen.
- Tillad for alkalisk afvikling i 40 min.
- Kør elektroforese på 1 V / cm, og 300 mA i 30 minutter i det kolde rum. Juster lydstyrken for elektroforese buffer i Chamber for at opnå ønsket driftsstrøm.
- For at udføre neutral comet assay:
- Fjern lysepuffer og skyl chip med neutral elektroforese buffer (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borsyre, pH 8,5) i 2 x 15 minutter ved 4 ° C.
- Sikker chip i en elektroforese kammer med gel film nedad ved hjælp af dobbeltklæbende tape.
- Bring kammer til et 4 ° C koldt rum.
- Fyld kammeret med kold neutrale elektroforese buffer (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borsyre, pH 8,5) til et niveau, der kun dækker gelen.
- Tillad gelen at sidde i koldt rum i 60 min.
- Kør elektroforese ved 0,6 V / cm og 6 mA i 60 minutter i det kolde rum. Juster lydstyrken for elektroforese buffer i kammeret for at opnå de ønskede kører strøm.
6. Fluorescent Imaging
- Fjern chip fra elektroforese kammer fra Cold rum.
- Neutraliseres gelerne i neutraliseringsbuffer (0,4 M Tris, pH 7,5) i 2 x 15 minutter i 4 ° C køleskab.
- Farv chippen med fluorescerende DNA-farve valg (dvs. SYBR Gold, ethidiumbromid) under fabrikken anbefalede procedurer. Billedet ved hjælp af fluorescerende mikroskopi.
7. Dataanalyse
Analyser komet Billeder efter standard comet assay software såsom Komet 5.5.
Representative Results
I dette første eksempel beskriver vi fremgangsmåde til kvantificering af indledende niveauer af DNA-skader i humane lymfoblastoide celler efter udsættelse for oxidativ beskadigelse ved hjælp af H 2 O 2. For at vurdere H 2 O 2 inducerede base-læsioner og enlige strengbrud er alkaliske komet anvendte betingelser. Efter lastning er afsluttet, og cellerne er indkapslet med agarose overlay er et bundløst 96-brønds plade presses mod overfladen for at skabe 96-rum på chippen. Hver af de 96 brønde kan doseres med en anden type eller koncentration af kemikalier. Her fire forskellige doser af H 2 O 2 blev anvendt og 1x PBS blev anvendt som negativ kontrol. Repræsentative billeder af grupperede kometer er vist i figur 1A, hvor ikke-behandlede (øverst), 50 uM (i midten) og 100 uM (nederst) H 2 O 2 -exposed prøver demonstrerede forskellige niveauer af komet haler. Analyse af Comet billeder kan forbedre præstationenwith anvendelse af kommercielt tilgængeligt software, som generelt kvantificerer skader niveauer baseret på den samlede fluorescensintensitet og migration afstanden for hver komet hale. Målinger almindeligvis udføres på 50 til 100 kometer pr tilstand og medianværdien (enten% hale DNA eller hale længde) beregnes. Figur 1B illustrerer den procentvise hale-DNA-responskurven analyseret fra TK6 lymfoblastoide celle kometer udsat for fire forskellige koncentrationer af H 2 O 2. Konsistensen blandt uafhængige forsøg viser effekten af denne tilgang i vurderingen af DNA-skade respons fra forskellige niveauer af kemiske behandlinger i cellerne.
At lære om variation blandt prøver (fx blandt macrowells) og blandt gentagelser af samme eksperiment blev inter-prøve og inter-eksperimentel variabilitet afbildet i figur 2A og 2B hhv. Inden for hvert forsøg, hver brønd i 96-well chippen svarer til en anden prøve, og dermed vel-til-godt variation afslører den inter-prøve variation af enheden. Her blev TK6 celler indlæst i 12 brønde af 96-brønds chip behandlet med den samme dosis af H 2 O 2 og umiddelbart lyseret efter behandlingen. Alle andre eksperimentelle trin blev udført parallelt og medianerne i mindst 50 kometer fra hver macrowell blev plottet i figur 2A. Gennemsnittet af medianerne er 77,53% DNA i halen, med standardafvigelsen er 3,99%. Ud fra disse data, vi beregne, at variationskoefficienten blandt prøver er 5,2%, hvilket er flere gange lavere end den traditionelle analyse, der viser den forbedrede robusthed denne analyse 6,16. At lære om reproducerbarheden af assayet, vi udsat TK6 celler i en chip med 75 pM H 2 O 2 og analysere den umiddelbare niveau af DNA-skader. Dette eksperiment blev gentaget seks gange og data fra hvert forsøg blev afbildet i FIGUR 2B. Under identiske eksperimentelle betingelser vi opnået resultater, der spænder fra 41,76% til 57,87%, vist som grå søjler i figuren. Gennemsnittet af seks gentagelser er 49,57%, med standardafvigelse af gennemsnittet af kun 2,04%. Den lave variation blandt gentagelser indebærer, at comet assay udført på denne roman enhed er særdeles reproducerbar.
At evaluere reparation kinetik cellerne lov til at reparere deres DNA i frisk medier efter behandling. Lysering macrowells på forskellige tidspunkter viser ændringen i DNA-skade over tid. Et eksempel er vist i figur 3. I dette eksperiment blev TK6 cellerne først indkapslet i chippen, behandlet med 50 pM H2O 2, og får lov til at reparere op til 60 minutter efter eksponering. Celler blev lyseret ved 0, 20, 45 og 60 minutter hhv. Repræsentative komet billeder på forskellige tidspunkter, er vist i figur 3A, og ændringen i DNA-skader niveauer over tid er afbildet i fig3B. Disse data viste, at næsten alle de skader er repareret inden 45 minutter efter H 2 O 2 behandling. Mange variabler kan påvirke hastigheden af reparation, herunder typen af cellelinien og kemisk middel, der anvendes. Derfor kan forskerne foretage ændringer til protokollen (dvs. strækker reparation tid) til at rumme yderligere behov i deres undersøgelser. Her giver vi endnu et eksempel på reparation eksperiment ved hjælp af denne chip, hvor TK6 celler bliver udfordret med et andet genotoksisk stof N-methyl-N '-Nitro- N-nitrosoguanidin (MNNG) er et alkyleringsmiddel kendt for at inducere basere læsioner, herunder 7-methylguanin og 3-methyladenin. Disse læsioner konverteres til abasiske steder enten ved spontan depurinering eller ved enzymatisk fjernelse af DNA glycosylaser. Den resulterende abasiske sted kan spaltes under basiske betingelser og således detekteres på chippen. Indledende eksponering forårsager en betydelig stigning i skader, fremgår det langehaler, og over tid disse haler nedsættes som cellerne genoprette intakt DNA under reparation. Selvom alkylering og oxidative skader er begge primært repareret af basen excision reparation gangsti, mængden af læsioner frembragt og involveret i reparation proteiner varierer. Disse variationer kan føre til forskellige satser for omregning til abasiske steder, samt forskellige satser for reparation af de resulterende abasiske steder. I figur 4, reparation kinetik TK6 celler eksponeret for 0,1, 1 og 3 ug / ml MNNG er vist. I dette eksperiment, vi udvidet eksperimentet tid til 2 timer efter eksponering, fordi MNNG-induceret skade synes at vare længere, og er ryddet i et langsommere tempo i forhold til H 2 O 2-induceret skade.
Analyse af DSBs anvender neutrale vilkår er meget lig den protokol til analyse af enkeltstrengede læsioner ved hjælp af alkaliske forhold. For at vise oprindelige skade niveauer blev TK6 celler udsat for varierende niveauer af GIR, og de resulterende celler blev lyseret og udsat for elektroforese ved en neutral pH-værdi (figur 5A). Det er bemærkelsesværdigt, at morfologien af komet haler er forskellig fra de alkaliske assaybetingelser. For at opnå observerbare fragmenteret DNA ved anvendelse af dette assay IR anvendte dosis er betydeligt højere (0-100 Gy) end den dosis, der kræves for at se skader ved hjælp af de alkaliske betingelser. Endvidere fandt vi, at halens længde er den mest følsomme parameter, der afspejler omfanget af DNA-skader ved anvendelse af neutral comet assay 7. De analyserede dosisresponskurve er illustreret i figur 5B. Reparation af DNA-dobbelt-strengbrud i celler kan også bedømmes, og er blevet vist ved Weingeist et. al. 7. Tilsammen den neutrale CometChip tilbyder et værdifuldt værktøj til high throughput analyse af DNA DSB'er.
1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. H2O 2 dosisrespons TK6 celler under anvendelse af alkalisk comet assay. (A) array mikrobrønde kometer fra ubehandlede TK6 lymfoblaster (øverst) og TK6 celler udsat for 50 uM (i midten) og 100 uM (nederst) H 2 O 2 i 20 minutter ved 4 ° C. Målestokken er 100 um. (B) H 2 O 2 dosisrespons TK6 celler udsat for forskellige niveau H 2 O 2. Hvert datapunkt er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg, hvor den gennemsnitlige procentdel hale-DNA på mindst 50 individuelle kometer blev opnået i hvert forsøg. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien fra tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Inter-Sample og Inter-Eksperimentel Variabilitet. (A) Prøve-til-prøve variation. TK6 humane lymfoblast-celler blev fyldt i 12 brønde af 96-brønds-chip. Hver brønd blev udsat for 100 pi 50 pM H2O 2 i 20 minutter ved 4 ° C. Cell straks blev lyseret og analyseret for% tail DNA. Data for hver brønd er vist her. Hver boks repræsenterer medianen mindst 50 individuelle kometer fra hver brønd. Gennemsnittet af 12 brønde er 77,53%, standardafvigelse er 3,99%, og variationskoefficienten beregnes til at være 5,2%. (B) Eksperiment-til-Eksperiment variation. TK6 humane lymfoblast-celler blev anbragt i 96-brønds-chip, udsættes for 100 pi 75 pM H 2 O 2 i 20 min ved 4 ° C. Cell straks blev lyseret og analyseret for% tail DNA.Det samme eksperiment blev gentaget 6 gange og data for hver gentagelse er vist som en grå bjælke. Hver kasse repræsenterer medianen% hale-DNA på mindst 100 individuelle kometer fra hver gentagelse. Gennemsnittet af 6 gentagelser er 49.57%, vist som bagsiden bar her. Standardafvigelsen på 6 gentagelser er 4,99%, og standardafvigelsen af middelværdien beregnes til at være 2,04%, repræsenteret fejlen bar i figuren.
Figur 3. Reparation af H 2 O 2-induceret skade i TK6 Lymfoblaster. (A) Skematisk af reparation studie med repræsentative kometer. TK6 celler behandles med skadelige stoffer og fik lov til at reparere i medier ved 37 ° C før lysering. (B) Reparation kinetik TK6 celler efter behandling med 50 pM H 2 O 2 i 20 min ved 4 & #176; C. Hvert datapunkt er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg, hvor den gennemsnitlige procentdel hale-DNA på mindst 50 individuelle kometer blev opnået i hvert forsøg. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien fra at gentage eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Reparation af MNNG-induceret skade TK6 lymfoblaster. TK6 celler behandles med 0,1, 1 og 3 ug / ml MNNG i 30 minutter ved 4 ° C og fik lov til at reparere i medier ved 37 ° C op til 120 minutter efter eksponering. Den gennemsnitlige procentdel hale-DNA på mindst 50 individuelle kometer blev opnået for hver af de tre uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsenaf middelværdien fra tre uafhængige eksperimenter.
Figur 5. Dosis IR-respons på TK6 celler under anvendelse af neutral comet assay. (A) Iført mikrobrønde kometer fra ubehandlede TK6 lymfoblaster (øverst) og TK6 celler udsat for 40 Gy (midten) og 80 Gy (nederst) gammabestråling. Målestokken er 100 um. (B) IR dosisrespons TK6 celler udsat for forskellige niveau af gamma-bestråling. Hvert datapunkt repræsenterer medianen hale længde (um) på mindst 300 kometer samlet fra seks macrowells på chippen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Allestedsnærværende genotoxins i miljøet, og også inden for humane celler udøve uundgåelige stress og skader på cellulært DNA. Faktisk er det blevet anslået, at der er 1.000 s af DNA-læsioner til stede i humane celler ved steady state 18. Forståelse skader modtagelighed og reparation kinetik hos mennesker ikke kun bringer indsigt til grundforskning, men gavner også lægemiddeludvikling. Ironisk nok, på trods af muligheden for DNA-skader til fremme af kræft, er DNA-ødelæggende midler, der anvendes ved meget høje niveauer til behandling af cancer, hvilket gør viden om DNA-skader og reparation relevant for skræddersyet medicin. Den CometChip er en roman forskning enhed, der udnytter microfabrication praksis for at revolutionere en lang eksisterede DNA-skader analyse. Chippen bygger på de samme principper for den traditionelle comet assay, giver betydeligt højere gennemløb og bedre reproducerbarhed. Vi beskriver her metoder til anvendelse af denne chip. For at tydeliggøre dens anvendelighed og robusthed, viser vi resultater from adskillige eksperimenter, hvor chippen er blevet anvendt til at vurdere skader fremkaldt af flere forskellige DNA-ødelæggende midler, og hvor det har været anvendt til at vurdere DNA-reparation. Sammen resultater præsenteres her giver nyttige oplysninger om brug af chip og vise sin brede anvendelighed til forskning i DNA-skader og reparation.
Et af de vigtigste skridt i denne protokol er at opnå en effektiv celle belastning. Mange cellelinier er blevet afprøvet på dette system, herunder både affjedring og adhærente celler. Henter effektivitet afhænger af mange variabler som celletype, cellestørrelse, lastning koncentration og tid. Suspension cellelinjer, såsom lymfoblastoide celler er lettest at arbejde med. Koncentration af cellesuspensionen kan variere fra APRIL 10-juni 10 celler pr 96 brønde og lastning normalt afslutter i 15-30 min. Højere celledensitet letter lastning og forkorter den tid, der kræves for celler at bosætte sig i mikrobrøndene.
Indlæses parametre for adhærente celler kan variere fra suspensionsceller. Cellelinjer, såsom kinesisk hamster ovarie (CHO) celler, viste sig at have lignende lastning effektivitet som suspensionsceller (efter trypsinisering), og dermed bruger lignende belastningsforhold. Andre celletyper, såsom tumorceller, der let danner celleaggregater i suspension, kræver yderligere håndtering. Passing cellesuspensioner gennem en enkelt celle filter og tilsætte trypsin til suspensionen medierne kan undertrykke dannelsen af celleklynger under lastning. Endelig, hvad angår lastning tid, den tid der kræves til at opfange adhærente cellelinier i mikrobrønde kan variere fra 20 min til 1 time. Som et resultat, anbefales det, at brugerne udfører pilotforsøg for at bestemme optimale belastningsforhold, før man går videre til yderligere undersøgelser. Indlæses effekt kan visualiseres under et lysfelt mikroskop eller mere præcist afsløret ved farvning af indkapslede celler med DAPI eller andet DNApletter før evalueringen under fluorescerende mikroskop.
En væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde og chip er alsidighed. For det første er forskerne ikke begrænset til en særlig arbejdsgruppe celle koncentration fordi overskydende celler vaskes væk, og microarray sikrer ensartet komet-tæthed. For det andet kan mikrobrøndene gøres med variable størrelser til at rumme celletyper i forskellige størrelser. Under omstændigheder, der flere celler er fanget i en enkelt mikrobrønd, flercellede kometer er selvstændige kalibreret og udbytte konsistente resultater sammenlignet med encellede kometer 6,7. En anden fordel ved mønstring celler i en microarray er, at alle kometer er derefter i samme fokale plan med faste positioner, hvilket reducerer støj på grund af ufokuserede kometer og lette automatiseret billedbehandling og analyse. De væsentlige forbedringer i gennemløb og følsomhed, som det CometChip på anvendelse af analysen for storstilet studier. Tilsammen chippen giverSA værdifuldt redskab for DNA-skader vurdering af forskere, toksikologer, klinikere og epidemiologer.
Mens comet assay er kendt for sin fremragende følsomhed i detektion af en bred vifte af DNA-skader, denne analyse lider også af lav specificitet. Brug af denne protokol i høj grad forbedrer reproducerbarhed og gennemløb af analysen, men ikke demonstrerer avancement i specificitet. Alligevel multiplekse assayet med andre metoder er blevet rapporteret at være effektiv til at opnå højere specificitet. Et eksempel er integration af oprensede læsion-specifikke enzymer. Disse enzymer kan konvertere ellers udetekterbare uædle læsioner i påviselige streng pauser og abasiske steder 1,19-21. Et meget brugt eksempel er reparation endonuclease formamidopyrimidine-DNA-glycosylase (FPG), som afslører oxidativ DNA-ændringer 19,22. Fordi enzymfordøjelse trin påføres efter cellelysis, kan systemet blive behandlet på samme måde som enSA traditionelle agarose dias uden ændringer af protokollen. Selv om den detaljerede protokol ikke er beskrevet her, har denne fremgangsmåde blevet tilpasset af mange traditionelle comet assay brugere i de sidste og de protokoller, let kan findes. I en tidligere publikation, vi brugte denne metode til at identificere fluorescerende lys-induceret skade 22.
Den største fordel ved denne metode er gennemløbet det giver, som åbner dørene til undersøgelser, der tidligere var næsten umuligt. Evnen til at behandle 96 prøver på samme platform ikke kun reducerer arbejdskraft og tid, men også reducerer eksperimentelle lyde og i høj grad forbedrer reproducerbarhed. Inter prøve variation er betydeligt lavere end den traditionelle slide-til-slide variation, som kan være 2 gange højere end variationen observeret med denne chip 6,7. Reduceret støj også fører til forbedret følsomhed, så påvisning af mere subtile forskelle mellem prøver. Fordi enheden anvender en standard 96-brønds format, det er foreneligt med generel forskning udstyr og HTS teknologier. Overvej en undersøgelse, der kræver evaluering af 100 prøver, forudsat at en gennemsnitlig forsker kan behandle ~ 30 objektglas i løbet af flere dage. Da hver prøve skal udføres i tre eksemplarer, vil det tage omkring en måned til at en sådan undersøgelse, som også vil uundgåeligt lide fra prøve til prøve variation. I modsætning hertil, forarbejdning 100 betingelser, hver i tre eksemplarer, med denne chip kræver kun et par plader og kan udføres i tre dage. Denne store forbedring i gennemløb åbner døren til studier, der tidligere var uopnåelige.
Protokollen præsenteres her beskriver både de grundlæggende procedurer til at udføre standard comet assay og de modificerede trin, der kræves for at bruge CometChip platformen. Med evnen til at måle både iboende DNA-skader niveauer og efterfølgende reparation reaktion assayet er yderst relevant foren række biologiske og kliniske anvendelser. Oplysninger om virkningen af specifikke kemiske eksponeringer på genomet letter forebyggelse og behandling af sygdomme. Desuden er der også stor interesse for bestemmelse af variationer i DNA-skader følsomhed og reparation kapacitet blandt individer 23,24. Denne teknik giver gennemløb nødvendige for sådanne store studier. Viden om inter-individuelle variationer er afgørende for at identificere modtagelige mennesker og for at designe individualiserede behandlinger eller forebyggelsestiltag strategier. Tilsammen teknologien præsenteres her giver en høj kapacitet, objektiv og kvantitativ DNA-skader analyse platform, der har potentiale til at blive en standardmetode i nær fremtid.
Acknowledgments
Dette arbejde var primært støtte med 5-UO1-ES016045 med delvis støtte fra 1-R21-ES019498 og R44-ES021116. DMW blev støttet af NIEHS Training Grant i Environmental Toxicology T32-ES007020. Udstyr blev leveret af Center for Environmental Health Sciences P30-ES002109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-well plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5' binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
References
- Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
- Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
- Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
- Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
- Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
- Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
- McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
- Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
- Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
- Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
- Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
- Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
- Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
- Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
- Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
- Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).
