Summary
Микрофлюидных контроль кислорода дает больше, чем просто удобство и скорость в течение гипоксии камер для биологических экспериментов. Особенно, когда осуществляется путем диффузии через мембрану, Микрожидкостных кислород может обеспечить одновременное жидкости и газовой фазы модуляции на микроуровне уровне. Этот метод позволяет динамические мульти-параметрические эксперименты важны для изучения островок патофизиологии.
Abstract
Одновременное оксигенации и мониторинг глюкозы стимул-секреции факторов связи в одном техники имеет решающее значение для моделирования патофизиологические состояния островков гипоксии, особенно в трансплантации средах. Стандартные гипоксические методики камерные не может модулировать как стимуляции в то же время и не предоставляет мониторинг в реальном времени глюкозы стимул-секреции факторов связи. Для решения этих трудностей, мы применили многослойную микрофлюидных технику, чтобы интегрировать как водные и газовой фазы модуляции с помощью диффузионной мембраны. Это создает бутерброд стимуляции вокруг microscaled островков внутри прозрачного полидиметилсилоксана (PDMS) устройства, что позволяет контролировать вышеупомянутых факторов связь через флуоресцентной микроскопии. Кроме того, ввод газа регулируется с помощью пары микродиспенсерами, обеспечивая количественные, суб-минутные модуляции кислорода между 0-21%. Это прерывистый гипоксия применена к исследованию новое явление островат предварительная. Кроме того, на вооружении мультимодальных микроскопии, мы были в состоянии смотреть на подробной кальция и динамики канала К АТР в эти гипоксии событий. Мы предполагаем микрофлюидных гипоксии, особенно это одновременное технику двойного фазы, как ценный инструмент в изучении островки, а также многие бывшие естественных условиях ткани.
Introduction
Динамический гипоксия играет важную роль в биологии, специально для трансплантации островковых клеток
Динамический гипоксия является важным физиологическим а также патофизиологические параметр во многих биологических тканей. Изменение кислорода, например, является мощным сигналом развития ангиогенеза. Кроме того, пространственные и временные закономерности в гипоксии модулировать HIF1-альфа и играть роли в таких болезней, как рак поджелудочной железы. Гипоксия также смешанным фактором, влияющим на островковых результаты пересадки. В последнее время во времени колебания гипоксии или прерывистой гипоксии (IH) продемонстрировали преимущества в "предварительной подготовки" островках 1. Тем не менее, как статические, так и переходные эффекты гипоксии на островок физиологии до сих пор не понятны или учились, в первую очередь из-за отсутствия соответствующих инструментов для управления микросреду островок в.
Островки хорошо васкуляризации в естественных условиях
Панкреатических островков являются 50-400 56; м сфероидальные агрегаты эндокринных клеток, в том числе бета-клеток и альфа-клеток, которые отвечают за гомеостазе глюкозы. Когда островки подвергаются стимуляции глюкозы в крови, поглощения и гликолиза приводит к продукции АТФ, что открывает АТФ-чувствительные калиевые (K ATP) каналы и результаты в притока кальция, который вызывает экзоцитоз гранул инсулина. Кислород важно управлять этим сильно метаболический процесс и секреция инсулина в значительной мере определяется динамикой кровотока и доставки кислорода в дополнение к градиентов глюкозы. Островки легко выполнить эту реакцию глюкозы к инсулину в естественных условиях, так как они очень перфузии в поджелудочной железе, каждый в пределах одной длины клеток из капиллярной судна. Тем не менее, густая сеть intraislet капилляров удаляют коллагеназы во островок изоляции 2,3. Следовательно, оба кислорода и питательных материалы ограничены к периметру 100 мкм из-за диффузионных ограничений.
шаг "> Современные методы имеют ограниченный успех в воссоздании островок микросредуРодные динамики кислорода и глюкозы воссоздания островок, ключевой для моделирования физиологических и патофизиологических условий, трудно достичь с помощью стандартных гипоксии камер, которые требуют сложного поток и не имеют постоянного мониторинга функций островков. Кроме того, трансплантации терапии для диабета типа I подвергать изолированные островки к гипоксии в печеночную воротную систему 4, который имеет значительно более низкую рО 2 (<2%, 5-15 мм рт.ст.) по сравнению с физиологическим поджелудочной железы (5,6%, 40 мм рт.ст.). Постпересадки, что трансплантаты островковых клеток взять две недели или больше, чтобы быть реваскуляризации. Было показано, что гипоксическая воздействие ухудшает глюкозо-инсулин соединительный механизм островок в. Среди стимул-секреции соединительные факторов, сигнальных кальция, митохондриальные потенциалов и инсулина кинетики может быть легко контролируется с использованием микрофлюидики. Наш предыдущий микрофлюидных техника продемонстрировала эту ремониторинга аль-время с точным модуляции водной микросреды вокруг одного островка 5,6. Однако количественная оценка гипоксического обесценение островок в тупике из-за отсутствия одновременной стимуляции и мониторинга методов. Таким образом, комбинируя микрофлюидных контроль кислорода и мониторинга островков может улучшить островковых исследования гипоксии.
Microfluidics может воссоздать и модулировать водный и кислородный микросреду
Стандартная техника для тканей и культура гипоксии исследований было основано на гипоксии камер. В общем, гипоксические камеры обеспечивают одно-концентрации кислорода со временем уравновешивания в ~ 10-30 мин, несовместимых с минутным масштабных динамической гипоксии. Два недавних исследования использовали небольшие пользовательские камеры для периодического воздействия гипоксии на всей мышей, с противоречивыми результатами по индуцированной глюкозой инсулинового ответа 7,8. Имейте в виду, что в целом уровень животного, respired кислород непосредственно не переходпланируется островок капилляр рО 2, в связи с управления в дыхательную систему. Кроме того, эти исследования не имеют стандартизированные уровни кислорода, и они не обеспечивают меры в реальном времени на тканевом уровне островков.
С другой стороны, кислород микрофлюидики может превзойти эти ограничения, контролируя кислород газа через сети каналов. Кроме того, микрофлюидики совместим с живого изображения при модуляции кислорода, подвиг в настоящий момент невозможно со стандартными гипоксии камер. Ряд этих новых микрофлюидики подходы использовать газопроницаемость полидиметилсилоксана распустить концентрации кислорода в микроканалов, которые текут качестве носителя клеток-мишеней 9-14. Эти устройства также интегрированы несколько дискретных концентрации кислорода, флуоресценция на основе кислородных датчиков, и даже химическую поколение кислорода на-чипе.
Жидкие сольватационные основе микрофлюидики иметь трудное время поддержания стабильных, непрерывные градиенты, как ят зависит от конвективного перемешивания, который чувствителен к течь условия. Для сравнения, метод мы используем здесь фокусируется на уменьшении путь диффузии доставки кислорода. Сольватация и расхода газа сдвига устраняются непосредственно диффузии кислорода через мембрану засеянного клетками или островковых тканей. Это устраняет лишние микрофлюидики необходимые для управления сольватацию и предотвращает ненужное напряжение сдвига к островков, которые само по себе может вызвать высвобождение инсулина. Эта платформа была использована для демонстрации активных форм кислорода (АФК) до регулирования в обоих гипероксических и гипоксии экстремальных значений (2-97% O 2) в клеточной культуре 1,15. Из-за прямой доставки кислорода и удаления сдвигового течения, наша диффузии-платформа обеспечивает оптимальное микрофлюидных решение для изучения островок гипоксии.
Мультимодальные стимулирование и контроль
Распространение на основе микрофлюидики также приносит дополнительные выгоды, если она адаптирована для изучения островковых миcrophysiology. При использовании мембраны в качестве диффузионного барьера, жидкость может быть выделен из кислорода модуляции, позволяя управления водного стимуляции глюкозы независимо от гипоксии стимуляции. Это создает сэндвич-как одновременное стимулирование, что пространственно пин-точек поставки в островках. Кроме того, как газ временно модулированного с помощью компьютеризированных microinjectors, можно модулировать концентрации кислорода от 21-0% цифровой с переходным время меньше, чем 60 сек. Динамические элементы управления кислорода и микросреды глюкозы в микроскоп позволяет в режиме реального времени мультимодальные протокол, который не был бы возможным или чрезвычайно громоздким, используя стандартные гипоксические камеры. С помощью этого устройства, сигнализация кальция (Фура-AM), митохондриальные потенциалов (родамина 123), и инсулина кинетика (ELISA) были проверены, чтобы обеспечить полное представление о динамических характеристик глюкозо-инсулин под гипоксии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка мыши Islets
- Проанализируйте мышей C57BL / 6 и изолировать островки на коллагеназой и Ficoll плотности разделения градиента. (См. статьи Юпитера ссылки в 2,3).
- Инкубировать островков в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 20 мМ HEPES в чашках Петри (37 ° C, 5% CO 2). После изоляции, культура островков в течение 24 часов до использования в экспериментах. Используйте островки в течение 1-2 дней, чтобы обеспечить устойчивые результаты.
2. Создание Микрофлюидных Платформа
- Генерирование микроструктуры геометрии на прозрачность фотошаблонов для каждого слоя устройства: 1) впускные и выпускные, 2) Глюкоза Микрожидкостных слоя с perifusion камеры (8 мм диаметр х 3 мм, 150 мкл), 3) 200 мкм мембрана с лунок (диаметр 500 мкм, 100 мкм в глубину), и 4) микрофлюидных слои газа.
- Для изготовления слой входе и выходе, залить дегазированный предварительно смешанные PDMS, чтобывысота 1,5 мм в пустой чашке Петри и лечения при 80 ° С в течение 2 часов. Удар диаметром 2 мм ввода / из портов.
- Для изготовления микрожидкостных слой глюкозы, спина два 350 мкм слои SU8-2150 образуют единый 700 мкм слой на 4 в кремниевой пластине.
- Expose ультрафиолетовый свет через соответствующий фотошаблонов для передачи микроканальную шаблон на SU8 после разработки, производя высокий мастер 700 мкм.
- Налейте дегазируют предварительно смешанные PDMS на этой мастера на высоту 3 мм и вылечить при 80 ° С в течение 2 часов. Вырезать это PDMS формировать с лезвием бритвы.
- Удар диаметром 2 мм портов ввода / вывода, а также 8 мм камеру диаметра.
- Чтобы изготовить 200 мкм мембрану с лунок, спина SU8-2100 до 100 мкм. Применить же УФ-литографии передать образцы микролуночные на этого высокого мастера 100 мкм.
- Спин дегазируют, предварительно смешанные PDMS на этой мастера при 900 оборотах в минуту в течение 30 сек и вылечить при 80 ° С в течение 10 мин. Спипа второй слой поверх первого, используя те же условия, в результате чего мкм PDMS мембраны 200, содержащего шаблоны микролуночные.
- Удар 2 мм портов ввода / вывода диаметра, через эту мембрану
- Чтобы изготовить газа микрофлюидных слой, спина SU8-2100 до 100 мкм. Применить же УФ-литографии для передачи газа микрофлюидных узоры на этого высокого мастера 100 мкм.
- Налейте дегазируют предварительно смешанные PDMS на этой мастера на высоту 1,5 мм и вылечить при 80 ° С в течение 2 часов. Разрежьте PDMS формировать с лезвием бритвы.
- Удар 2 мМ портов ввода / вывода диаметра через этот слой
- Для связывания нескольких слоев, подготовить их путем очистки скотчем, обнажая в коронном дуги, а затем выравнивание вручную в следующем порядке.
- Бонд мембрану на нижний слой газа с микролунки вверх.
- Бонд Микрожидкостных глюкозы в верхней части микропланшетным мембраны.
- Бонд входе и выходе слоя Oн самый верх, инкапсуляции весь узел.
- Усиление св зывание добавлением 1 кг массы сверху и обжига при 100 ° С в течение 3 часов.
- Герметичные проверить заполненную устройства путем загрузки воды в водный слой, а затем погружение все устройство под водой. Затем воздушный поток через слой газа с пустой шприц.
- Стерилизовать утечек устройств с 70% этанола через водный слой затем промойте их PBS буфера, в котором устройство не хранится при температуре 4 ° С до использования.
3. Microdispenser установки
- Получить 2 микродозаторов 5 В и 20 В источника постоянного тока, а также цифровой платы ввода / вывода для построения смешивание кислорода и настройку доставки.
- Подключите управляющие кабели микродиспенсерами "к прилагаемому динамиками.
- Подключите драйверы с цифровой платы ввода / вывода в портах, соответствующих LabVIEW управления.
- Подключите блок питания 5 В и 20 В до соответствующих контактов на диске универец.
- Подключите цифровых входов / выходов к ноутбуку выполнять LabVIEW коды газового контроля (приложение).
- Подключите один microdispenser в азот, а другой для сжатого воздуха, и с 5% СО 2. Установите оба газов до 2 фунтов на квадратный дюйм. Подключите выходы дозаторы 'в Т-образном перекрестке перед входом в микрожидкостных устройств.
- Используя устройство утечки проверенные, характеризуют переходную характеристику модуляции кислорода на велосипеде в микродиспенсерами между 5-21% кислорода, в то время как измерения растворенного кислорода в воде с датчиком оптического волокна кислорода (см. список оборудования и репрезентативные результаты).
4. Настройка на микроскопии
- Установите устройство к нагретой этапе на инвертированный микроскоп.
- Подключите 0% и 21% O 2 газов к устройству и калибровки с датчиком кислорода.
- Подключите выходной порт из микрофлюидики глюкозы в коллектор фракций.
- Подготовка бикарбонат Кребс звонкабуфер (КРФ): 129 мм NaCl, 5 мМ NaHCO 3, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 1 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 1,2 ммоль MgSO 4 · 7H 2 O, 10 мМ HEPES рН 7,35-7,40 , 2 мМ базального уровня глюкозы и 5% FBS.
- Приготовьте два буферных растворов, содержащих 2 мм и 14 мМ глюкозы соответственно в 50 мл конические пробирки купались в 37 ° С водяной бане.
- Подключите перистальтического насоса для рисования буфер при 250 мкл / мин в трубке. Перед входом в микрожидкостных устройств потока трубки над плитой 37 ° C.
- Чтобы окрасить островки, добавить Фура-2 утра в ДМСО и Rh123 в 100% этаноле до 2 мл KRB достичь концентрации окончательные красителя 5 мкм и 2,5 мкм, соответственно.
- Встреча островки с 10 мкл пипетки и инкубировать в красителей в течение 30 мин при 37 ° С
- Загрузить около 20 островков в устройство через входное отверстие микроканальной глюкозы. Направьте островки в камеру на грунтовки буфер из розетки обратно в тна входе он.
- Заливать островки в буфере в течение 10 мин, чтобы смыть избыток краски.
5. Запуск Одновременная кислорода и глюкозы стимуляция
- Доставка импульс стимуляции глюкозы с 5 мин базовой линии, установленной KRB2, а затем 15 мин 14 мМ стимуляции, затем промыть в течение 15 мин в KRB2.
- Запись 340/380 нм длина волны возбуждения для Фура-2 и 534 эмиссии для Rh123.
- Произвести измерения нормального импульса (14 мм нормоксических) перед каждым экспериментом.
- Для модуляции кислорода (гипоксия / прерывистый гипоксия), применяются только буфера потока во время стимуляции и стадий промывки и без потока в других шагов, чтобы свести к минимуму конвективные возмущения.
- Сбор сточных вод от розетки глюкозы в минутными интервалами 1 для ELISA инсулина анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Центральное место в этой технике островок гипоксии является способность модулировать водной и газовой фазы стимуляции в той же камере с микрофлюидный минут масштабных переходных процессов. Рисунок 1 является представителем результат а) двойной стимуляции и б) быстро модуляции, измеренные в островковых камеры. Водный модуляции, показано введение флуоресцеина в камеру, достигает равновесия в 3:57 минут после смешивания. Кроме того, кислород можно вышел из 5-21% с быстрыми переходными, что позволяет на велосипеде кислорода с периодами как короткие, как 2 мин. Различные глубины велосипедные и частоты также может быть достигнуто, как показано на рисунке 2.
Когда это езда на велосипеде применяется для создания прерывистого гипоксии в островках, можно наблюдать преимущества предварительной подготовки островки против гипоксии, по сравнению с обычным, Normoxic импульсов, фиг.3а. Потому потока внутриклеточного кальция сигнализации mechanisм инсулина секреции-отслеживается в реальном времени, эффекты гипоксии и IH можно наблюдать в овершут и затухания колебаний кальция переходных процессов, рисунке 3b. Это важные параметры, связанные с каналов К ATP предлагаемых контролировать процесс предварительной подготовки. Кроме того, ссылка митохондрий в метаболизме и гипоксии могут быть визуализированы с помощью мониторинга митохондриальные потенциалов с использованием Rh123. И, наконец, набор микрофлюидальных сточных вод позволяет ELISA анализа от общего количества инсулина. Кальций, митохондриальная потенциал, и инсулин три параметра, которые начинают строить мультимодальный вид на ответ глюкозо-инсулин под гипоксии переходных процессов, 3в.
Рисунок 1. Одновременное кислорода и глюкозы стимуляции. (а) статические элементы управления. Топ: камера введение FITC молекулы при 250 мкл / мин стабилизирует течение 3 мин время смешивания. Внизу: газового контроля обеспечивает стабильную доставку 5, 10, и 21% кислорода в мембране (б) временного контроля.. Велоспорт кислорода между 5-21% возможно с 1-минутного периода, измеренная как на поставки газа (рассеянного) и поверхность лунок (в растворенном виде).
Рисунок 2. Микрофлюидных устройство также может генерировать другие профили кислорода. Различные профили IH можно получить путем изменения глубины (5-10-15%), а также периоды (3-6-1 мин) из велоспорта через газосмешивающее от компьютеризированных microinjectors .
3 "FO: содержание-шир =" 5.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50616/50616fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50616/50616fig3.jpg "/>
Рисунок 3. IH выдержано островки улучшились ответов к гипоксии. (А) представитель обзор предварительной использованием IH, на общую сумму 30 мин экспозиции на уровне 5%, показывая повышенную реакцию гипоксического сравнению с нормоксических импульса (же островок пакетном в предыдущем эксперименте). Больше 10 минут последующей гипоксии-прежнему сохраняет предварительной подготовки. (Б) Overlaid сравнение средней нормоксических, гипоксических и предварительно обработанных ответов гипоксии. Вставка показывает репрезентативные следы с восстановлением поведения колебаний (с) мультимодальные Fura-2, инсулин и Rh123 ответы для различных кислорода и химических условий:. 21% кислорода, 5% кислорода, предобусловливания (P +5%), Диазоксид (D + 5%), и 5HD (5HD + P +5%). Диазоксид согласуется с предварительной а 5HD сводит на нет преимущества предварительной путем открытия и Blockiнг KATP каналов, соответственно. Два-белохвост т-тесты: 5% против 21%, 5% по сравнению с P +5%, D +5% против 5HD + P +5%; * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in | |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
