Summary
Mikroflödessyrekontroll ger mer än bara bekvämlighet och hastighet över hypoxiska kammare för biologiska experiment. Speciellt när förs via diffusion genom ett membran, kan mikroflödes syre ger samtidig vätska och gasfas modulationer på mikronivå. Denna teknik möjliggör dynamiska fler parametriska experiment kritiska för att studera holme patofysiologi.
Abstract
Samtidig syresättning och övervakning av glukos stimulus-sekrekopplingsfaktorer i en enda teknik är avgörande för modellering patofysiologiska tillstånd av holme hypoxi, speciellt i transplantations miljöer. Standard hypoxiska kammar tekniker kan inte modulera båda stimuli samtidigt och inte heller ger realtidsövervakning av glukos stimulus-sekrekopplingsfaktorer. För att lösa dessa problem, tillämpade vi en mångbottnad mikroflödessystem teknik för att integrera både vatten-och gasfas moduleringar via en diffusionsmembran. Detta skapar en stimulans smörgås runt microscaled holmar i den genomskinliga polydimetylsiloxan (PDMS) enhet, som möjliggör övervakning av de ovannämnda kopplingsfaktorer via fluorescensmikroskopi. Dessutom är ingångsgasen styrs av ett par microdispensers, ger kvantitativa, sub-minuten modulationer av syre mellan 0-21%. Denna intermittenta hypoxi används för att undersöka ett nytt fenomen på önt prekonditionering. Dessutom, beväpnade med multimodal mikroskopi, kunde vi titta på detaljerade kalcium och K ATP kanaldynamik under dessa hypoxiska händelser. Vi ser framför oss mikroflödes hypoxi, särskilt denna samtidiga dubbla fas teknik, som ett värdefullt verktyg för att studera holmar samt många ex vivo vävnader.
Introduction
Dynamisk hypoxi är viktigt i biologi, särskilt för holme transplantationer
Dynamisk hypoxi är en viktig fysiologisk och patofysiologisk parameter i många biologiska vävnader. Förändring av syre, till exempel, är en potent utvecklingssignal i angiogenes. Dessutom, rumsliga och tidsmässiga mönster i hypoxi modulera HIF1-alfa och spela roller i sjukdomar som cancer i bukspottkörteln. Hypoxia är också en påverkande faktor som påverkar holme transplantationsresultat. Nyligen har tidsmässigt svängningar av hypoxi, eller intermittent hypoxi (IH) visade fördelar i "prekonditionerande" holmar 1. Men både statiska och övergående hypoxi effekter på holme fysiologi har ännu inte förstått eller studerade, främst på grund av brist på lämpliga verktyg för att kontrollera holme s mikromiljö.
Holmar välvaskulariserade in vivo
Pankreasöar är 50-400 56, m sfäriska aggregat av endokrina celler, inklusive betaceller och alfaceller som är ansvariga för glukoshomeostas. När cellöar exponeras för stimulerande glukos i blodet, upptag och glykolys ledningen till ATP-produktion, vilket öppnar upp ATP-känsliga kalium (KATP) kanaler och resulterar i kalciuminflöde som utlöser exocytos av insulin granuler. Syre är viktigt för att driva detta hårt ämnesomsättning och insulinutsöndring är avsevärt påverkad av dynamiken i blodflödet och syretillförseln förutom glukos gradienter. Holmar utföra lätt denna glukos-insulinsvar in vivo eftersom de är mycket perfusion i bukspottkörteln, var och en inom en cell längd från en kapillär fartyg. Dock är det tätt nät av intraislet kapillärer bort av kollagenas under holme isolering 2,3. Följaktligen är både syre och näringsämnen leveranser begränsas till en 100 ìm omkrets på grund av diffusion begränsningar.
steg "> Aktuella tekniker har begränsad framgång i att återskapa holme mikromiljöÅter holme infödda syre-och glukosdynamik, nyckeln till modellering fysiologiska och patofysiologiska förhållanden, är svårt att uppnå med standard hypoxiska kammare som kräver genomarbetade flöde och saknar kontinuerlig övervakning av ö-funktioner. Dessutom transplantationsterapier för typ I-diabetes utsätta isolerade öar till hypoxi i leverportalsystem 4, som har mycket lägre pO 2 (<2%, 5-15 mm Hg) jämfört med fysiologisk bukspottkörteln (5,6%, 40 mm Hg). Efter transplantationen, öarna transplantat ta två veckor eller mer ska revascularized. Det har visat sig att hypoxisk exponering försämrar islet glukos-insulin-kopplingsmekanism. Bland de stimulus-sekrekopplingsfaktorer, kalcium signalering, mitokondriella potentialer och insulin kinetik kan enkelt kontrolleras med hjälp av mikrofluidik. Vår tidigare mikroflödesteknik visade denna real-tid övervakning med exakt modulering av den vattenbaserade mikromiljö runt enda holme 5,6. Dock är kvantifiering av holmen är hypoxisk försämring brottats med bristen på samtidiga stimulans-och övervakningsteknik. Därför kan kombinera mikroflödeskontroll av syre och holme övervakning förbättra holme hypoxi studier.
Mikrofluidik kan återskapa och modulera den vattenbaserade och syre mikromiljö
Den standardteknik på mjuk-och kultur hypoxi studier har baserats på hypoxiska kammare. I allmänhet är de hypoxiska kamrarna ger enkla syrehalter med ekvilibreringstider i ~ 10-30 min, oförenliga med minut-skalas dynamisk hypoxi. Två nya studier använde små anpassade kammare för intermittent hypoxi exponering på hela möss, med motstridiga resultat på glukos-inducerad insulinsvaret 7,8. Tänk på att i hela djurnivån, är det respireras syret inte direkt trantänkt att holme kapillär PO2, på grund av kontrollerna i andningsorganen. Dessutom har dessa studier inte har standardiserade syrenivåer, och inte heller ge realtid åtgärder på vävnadsnivå holmar.
Å andra sidan kan syre mikrofluidik träffa dessa begränsningar genom att reglera syre via gas-kanalnätverk. Dessutom är mikrofluidik kompatibel med levande avbildning under syremodulering, en bedrift för tillfället inte möjligt med vanliga hypoxiska kammare. Ett antal av dessa nya mikrofluidik närmar utnyttja gas permeabilitet polydimetylsiloxan att lösa syrehalter i mikrokanaler som strömmar media över målceller 9-14. Dessa enheter har också integrerat flera diskreta syrehalter, fluorescensbaserade syresensorer, samt även kemisk syregenerering på chip.
Vätskekristallbaserade mikrofluidik har svårt att bibehålla stabila, kontinuerliga gradienter som jagt är beroende av konvektiv blandning, som är känslig för flödesförhållandena. I jämförelse, den teknik som vi använder här är inriktad på att minska diffusion path of syreavgivning. Gasen solvatisering och skjuvflöde elimineras genom direkt diffunderar syre över ett membran besås med celler eller holme vävnader. Detta tar bort de extra mikrofluidik som krävs för att styra solvatisering och förhindrar onödig skjuvspänning till holmarna, som i sig kan utlösa insulinfrisättning. Denna plattform har använts för att visa att reaktiva syreradikaler (ROS) uppreglering både hyperoxic och hypoxiska ytterligheter (2-97% O 2) i cellkultur 1,15. På grund av den direkta leveransen av syre och avlägsnande av skjuvning flöde, ger vår diffusion-baserad plattform den optimala mikroflödes lösningen för att studera holme hypoxi.
Multimodal stimulans och övervakning
Diffusion-baserade mikroflödes innebär också ytterligare fördelar när anpassad för att studera holme milcrophysiology. Genom att använda ett membran som en diffusionsbarriär kan vätskan vara isolerad från de syre modulationer, vilket möjliggör kontroll av vattenhaltiga glukos stimuleringar oberoende av hypoxiska stimuleringar. Detta skapar en sandwichliknande samtidig stimulering som rumsligt pin-points leverans till holmarna. Dessutom, eftersom gasen är tidsmässigt moduleras via datorise microinjectors, kan vi modulera syrekoncentrationen 21-0% digitalt med övergående tid mindre än 60 sek. De dynamiska kontroller av syre och glukos mikromiljö vid mikroskopet tillåter en realtid multimodal protokoll som inte skulle vara möjligt eller utomordentligt besvärlig med vanliga hypoxiska kammare. Med hjälp av denna enhet, var kalciumsignalering (Fura-AM), mitokondriella potentialer (Rhodamine 123), och insulin kinetik (ELISA) övervakas för att ge en fullständig bild av den dynamiska glukos-insulin svar under hypoxi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Mouse Islets
- Dissekera C57BL / 6 möss och isolera cellöar genom kollagenasdigestion och Ficoll densitetsgradient separation. (Se Jove artiklar som hänvisas till i 2,3).
- Inkubera cellöar i RPMI-1640-medium innehållande 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 20 mM HEPES i petriskålar (37 ° C, 5% CO2). Post-isolering, cellöar odling under 24 h före användning i experimenten. Använd holmar inom 1-2 dagar för att säkerställa jämna resultat.
2. Göra Microfluidic Platform
- Generera mikrogeometrier på fotomasker öppenhet för varje enhet lager: 1) in-och utlopps, 2) Glukos mikroflödes skikt med perifusion kammare (8 mm diameter x 3 mm, 150 l), 3) 200 ìm membran med mikrobrunnar (500 nm i diameter, 100 ^ m djup), och 4) gas mikroflödesskikt.
- För att tillverka in-och utlopp lager, häll avgasade, förblandade PDMS tillen höjd av 1,5 mm i en tom petriskål och härdning vid 80 ° C under 2 timmar. Stansa 2 mm diameter in / ut-portar.
- För att tillverka den glukos microfluidic skiktet, spinna två 350 ^ m skikt av SU8-2150 för att bilda en enda 700 | am skikt på ett 4 i kiselskiva.
- Exponera UV-ljus genom en lämplig fotomask för att överföra mikrokanalmönster på SU8 efter utveckling, producerar en 700 nm lång herre.
- Häll avgasade, förblandade PDMS på denna herre till en höjd av 3 mm och härda vid 80 ° C under 2 timmar. Skär det PDMS att forma med ett rakblad.
- Stansa 2 mm diameter / O portar samt kammare med 8 mm diameter.
- För att tillverka den 200 ^ m membran med mikrobrunnar, snurra SU8-2100 till 100 | im. Applicera samma UV-litografi för att överföra mikro mönster på denna 100 nm lång herre.
- Spin avgasas, förblandade PDMS på detta mästare på 900 varv per minut under 30 sek och härda vid 80 ° C under 10 min. Spina andra skikt på toppen av den första med användning av samma betingelser, vilket resulterar i en 200 ^ m PDMS membran innehållande mikrobrunnmönster.
- Stansa 2 mm diameter in / utportar genom detta membran
- För att tillverka den gas mikroflödesskiktet, snurra SU8-2100 till 100 | im. Applicera samma UV-litografi för att överföra gas mikroflödesmönster på detta 100 nm lång herre.
- Häll avgasade, förblandade PDMS på denna herre till en höjd av 1,5 mm och härda vid 80 ° C under 2 timmar. Skär PDMS att forma med ett rakblad.
- Stansa 2 mm diameter in / utportar genom detta skikt
- För att förbinda de multipla skikten, förbereda dem genom att rengöra med scotch tape, utsätta för korona båge, och sedan rikta in för hand i följande ordning.
- Bond membranet till bottnen gasskikt med mikrobrunnar uppåt.
- Bond glukos microfluidic ovanpå mikromembranet.
- Bond inloppet och utloppet skiktet on högst upp, kapsla in hela monteringen.
- Förstärk bindningen genom att tillsätta 1 kg vikt på toppen och bakning vid 100 ° C under 3 timmar.
- Läck testa den fullbordade enheten genom att ladda in vatten i det vattenhaltiga skiktet, därefter sänka ned hela anordningen under vatten. Därefter strömmar luften genom den gas skikt med en tom spruta.
- Sterilisera läckagefria enheter med 70% etanol genom det vattenhaltiga skiktet spola sedan med PBS-buffert, i vilken anordningen är lagrad vid 4 ° C fram till användning.
3. Microdispenser Setup
- Skaffa 2 microdispensers, 5 V och 20 V DC nätaggregat och en digital I / O-kort för att konstruera syreblandning och leveransinställningar.
- Anslut microdispensers kontrollsystem leder till de inkluderade drivenheter.
- Anslut drivrutinerna till den digitala I / O-kortet i hamnar motsvarande Labview kontroller.
- Anslut 5 V och 20 V strömförsörjning till motsvarande kontakter på driv units.
- Anslut den digitala I / O till en bärbar dator för att köra Labview koder för gaskontroll (bilaga).
- Anslut en microdispenser till kväve medan en annan till tryckluft, båda med 5% CO2. Ställ båda gaserna till 2 psi. Haka upp automater resultat på en T-korsning före in i mikroflödessystem enhet.
- Med hjälp av en läcka-testad enhet, karakterisera transientsvar syre modulering genom att cykla de microdispensers mellan 5-21% syre, samtidigt mäta löst syre i vatten med en fiberoptisk syresensor (se utrustningslista och representativa resultat).
4. Inställning vid mikroskopi
- Montera anordningen till den upphettade stadiet på inverterat mikroskop.
- Anslut 0% och 21% O 2 gaser till enheten och kalibrera med syresensorn.
- Anslut utporten av glukos mikrofluidik till en fraktionsuppsamlare.
- Förbered Krebs Ringer bikarbonatbuffert (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCOs 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1 mM CaCl2 • 2 H2O, 1,2 mM MgSO 4 · 7 H2O, 10 mM HEPES pH 7,35 till 7,40 , 2 mM basal glukos och 5% FBS.
- Bered två buffertlösningar innehållande 2 mM och 14 mM glukos respektive i 50 ml koniska rör som badar i 37 ° C vattenbad.
- Anslut en peristaltisk pump för att dra buffert vid 250 | il / min in i slangen. Flöde slangen över en 37 ° C kokplatta innan mikroflödessystem enhet.
- Att färga cellöarna, till Fura-02:00 i DMSO och Rh123 i 100% etanol till 2 ml KRB att nå slutliga färgämneskoncentrationer av 5 | iM och 2,5 ^ iM, respektive.
- Plocka upp holmar med en 10 l pipett och inkubera i färgämnen för 30 minuter vid 37 ° C.
- Fyll på ca 20 holmar i enheten via glukosmikrokanalinloppet. Rikta holmar in i kammaren genom priming buffert från utloppet tillbaka till than inlopp.
- BEGJUTA cellöarna i buffert under 10 min för att tvätta bort överskott av färgämnen.
5. Köra Samtidig syre och glukos Stimulering
- Leverera en glukosstimuleringspuls med 5 min av utgångsvärdet fastställts av KRB2, följt av 15 min av 14 mM stimulering, tvätta sedan i 15 minuter i KRB2.
- Record 340/380 nm excitation våglängd för Fura-2 och 534 utsläpp för Rh123.
- Gör mätningar av en normal puls (14 mM normoxisk) före varje experiment.
- För syre modulation (hypoxi / intermittent hypoxi), endast gäller buffertflöde under stimulering och tvättsteg och inget flöde i andra åtgärder, för att minimera konvektiva störningar.
- Samla avloppsvatten från glukos uttag på 1 minuters intervall för ELISA-insulin-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Centralt för denna islet hypoxi teknik är förmågan att modulera vattenhaltig och gasformig fas stimulering i samma mikroflödeskammare med minut skala transienter. Figur 1 är ett representativt resultat av a) dubbla stimuleringar och B) snabb module mäts inom holmen kammaren. Vattenbaserad modulation, visad genom införande av fluorescein i kammaren, uppnår jämvikt i 3-4 minuters blandning. Dessutom kan syre intensifieras 5-21% med snabba transienter, som möjliggör cykling syre med perioder så korta som 2 min. Olika cykel djup och frekvenser kan också uppnås som visas i figur 2.
När denna cykling appliceras för att skapa intermittent hypoxi hos cellöarna kan man observera fördelarna med förkonditionering cellöar mot hypoxi, i jämförelse med en regelbunden, normoxisk puls, figur 3a. Eftersom den intracellulära kalciumflödes-signalerings mechanism av insulinutsöndring-övervakas i realtid, kan observeras effekter av hypoxi och IH i översväng och oscillering dämpning av kalcium transienter, figur 3b. Dessa är viktiga parametrar som är förknippade med KATP-kanaler som föreslagits för att styra förkonditionering processen. Dessutom kan mitokondrierna s länk till ämnesomsättningen och hypoxi visualiseras genom att övervaka mitokondriella potentialer med hjälp Rh123. Slutligen, insamling av mikroflödes utsläpp tillåter ELISA-analys av den totala insulinmängd. Kalcium, mitokondriell potential, och insulin är tre parametrar som börjar att bygga en multimodal bild av glukos-insulinsvar under hypoxiska transienter, figur 3c.
Figur 1. Samtidig syre och glukos stimuli. (a) Fasta kontroller. Överst: kammar införandet av FITC-molekyl på 250 l / min stabiliseras inom 3 min av blandningstid. Nederst: gas kontroll tillhandahåller stabil leverans av 5, 10, och 21% syre vid membranet (b) Temporal kontroll.. Cykling av syre mellan 5-21% är möjlig med 1 min period mätt både på gas-leverans (diffust) och ytan av mikrobrunnar (löst).
Figur 2. Mikrofluidumanordning kan också generera andra syreprofiler. Olika IH profiler kan erhållas genom att variera djupet (5-10-15%) samt de perioder (3-6-1 min) i cykel via gas blanda från de dato microinjectors .
3 "fo: innehåll-width =" 5.5 tum "fo: src =" / files/ftp_upload/50616/50616fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50616/50616fig3.jpg "/>
Figur 3. IH förkonditioneras cellöar har förbättrat svar på hypoxi. (A) representativ översikt av förkonditionering med användning av IH, sammanlagt 30 min exponering vid 5%, vilket visar förbättrad hypoxisk svar jämfört med normoxisk puls (samma islet satsvis i ett tidigare experiment). 10 minuter med efterföljande hypoxi fortfarande kvar konditioneringsfasen. (B) överlagrade jämförelse av medel normoxisk, hypoxisk, och konditioneras hypoxiska svar. Infällda bilden visar representativa spår med återvinning av svängningsbeteendet (c) Multimodal Fura-2, insulin, och Rh123 svar för olika syrgas och kemiska förhållanden:. 21% syre, 5% syre, prekonditionerande (P +5%), diazoxid (D + 5%) och 5HD (5HD + P 5%). Diazoxide är förenlig med förkonditionering medan 5HD negerar fördelarna av förkonditionering genom att öppna och Blocking KATP-kanaler, respektive. Tvåsidiga t-test: 5% vs 21%, 5% vs P +5%, D +5% vs 5HD + P +5%, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De olika formerna integrerade i denna holme hypoxi teknik presentera flera punkter noteras här för felsökning. Först de isolerade öarna fortsätter att brytas ned och upplösas i kultur på grund av matsmältningsenzymer från körtelceller. Standardisera försök till 1-2 dagar efter holme isolering är alltså avgörande för att få konsekventa resultat. För det andra, det vattenhaltiga flödet stoppas under hypoxi och intermittent hypoxi för att förhindra konvektiv clearance vid gränsen mellan laminärt flöde och diffusion. Detta verkar för att begränsa varaktigheten av ö prekonditionering. Framtida integrering av ett gasutbyte i vattenkanalen kan eliminera denna mindre avslut samtidigt tillåta snabba gas modulationer på membranet. För det tredje, samtidigt laddar holmarna, vattenslangen ska kopplas noggrant i omvänd ordning (utlopp inlopp sedan) för att undvika att droppa luftbubblor. Slutligen kan framtida enhet kompletteras med en expanderande mikroflödes distributör, för att hjälpa till distributionte klustret av cellöar över hela kammaren, på botten av vilket kan vara mönstrad med en array om Trapper fickor. Denna mikroflödesfördelning utöver fickarrangemanget kommer att bidra till att skapa en positions samling av holmar för hög genomströmning experiment.
Före denna microfluidic islet hypoxi teknik var de snabbaste intermittenta hypoxi modulationer uppnås på 1-3 minuters cykler genom att använda små anpassade hypoxiska kammare med högt flöde av trycksatt gas. Dock kan dessa endast användas på hela djur och inte på enskild holme nivån. Förutom osäkerheten i själva hypoxi nivån uppnås i hela djurens bukspottkörteln (efter andnings jämvikt) finns det också en oförmåga att sondera glukos-insulin svar i realtid, välkontrollerade mikromiljöer. I jämförelse, är både vattenbaserade och gas stimuli styrs till minut tidsperspektiv i vår mikrofluidik. Dessa moduleringar är också monteras direkt på mikroskopet for multiparameter övervakning. Inför vår teknik, har repeterbar och väldefinierad holme förutsättning inte varit möjligt. Syrekänsliga ex vivo vävnader såsom holmar är optimalt anpassade till denna mikroflödessystem plattform som deras microscaled dimensioner (dvs. 100 ìm radie) är fångade mellan mindre cell-kulturplattform och större kammarapparat. Bortom holmar, ett antal ex vivo vävnader-inklusive hjärtvävnad, hjärnan skivor, och embryon-kan undersökas med hjälp av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 DK091526 (JO), NSF 0.852.416 (DTE), och Chicago Diabetes Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in | |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
