Summary
Microfluidic ऑक्सीजन नियंत्रण जैविक प्रयोगों के लिए hypoxic कक्षों से अधिक सिर्फ सुविधा और गति की तुलना में अधिक प्रदान करता है. एक झिल्ली के माध्यम से प्रसार के माध्यम से लागू किया है, खासकर जब microfluidic ऑक्सीजन microscale स्तर पर एक साथ तरल और गैस चरण modulations प्रदान कर सकते हैं. इस तकनीक आइलेट pathophysiology के अध्ययन के लिए गतिशील बहु पैरामीट्रिक प्रयोगों महत्वपूर्ण सक्षम बनाता है.
Abstract
एक ही तकनीक में ग्लूकोज प्रोत्साहन स्राव युग्मन कारकों की एक साथ oxygenation और निगरानी विशेष रूप से प्रत्यारोपण के वातावरण में, आइलेट हाइपोक्सिया के pathophysiological राज्यों मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है. स्टैंडर्ड hypoxic कक्ष तकनीक एक ही समय में दोनों stimulations मिलाना न ही ग्लूकोज प्रोत्साहन स्राव युग्मन कारकों का वास्तविक समय की निगरानी प्रदान नहीं कर सकते. इन कठिनाइयों के समाधान के लिए, हम एक प्रसार झिल्ली के माध्यम से जलीय और गैस चरण modulations दोनों को एकीकृत करने के लिए एक बहुस्तरीय microfluidic तकनीक लागू होता है. इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से aforementioned युग्मन कारकों की निगरानी को सक्षम, पारदर्शी polydimethylsiloxane (PDMS) डिवाइस के भीतर microscaled टापू के चारों ओर एक उत्तेजना सैंडविच बनाता है. साथ ही, गैस इनपुट 0-21% के बीच ऑक्सीजन की मात्रात्मक, उप मिनट modulations प्रदान करने, microdispensers की एक जोड़ी द्वारा नियंत्रित किया जाता है. इस रुक - रुक कर हाइपोक्सिया टापू की एक नई घटना की जांच के लिए लागू किया जाता हैटी शर्त. इसके अलावा, बहुविध माइक्रोस्कोपी के साथ सशस्त्र, हम इन hypoxic घटनाओं के दौरान विस्तृत कैल्शियम और कश्मीर एटीपी चैनल गतिशीलता को देखने में सक्षम थे. हम टापू का अध्ययन करने के साथ ही कई पूर्व vivo ऊतकों में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में, microfluidic हाइपोक्सिया, विशेष रूप से इस एक साथ दोहरी चरण तकनीक कल्पना.
Introduction
गतिशील हाइपोक्सिया विशेष रूप से आइलेट प्रत्यारोपण के लिए, जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण है
गतिशील हाइपोक्सिया कई जैविक ऊतकों में एक महत्वपूर्ण शारीरिक के साथ ही pathophysiological पैरामीटर है. ऑक्सीजन में परिवर्तित करें, उदाहरण के लिए, angiogenesis में एक शक्तिशाली विकास संकेत है. इसके अलावा, हाइपोक्सिया में स्थानिक और लौकिक पैटर्न HIF1 अल्फा मिलाना और अग्नाशय के कैंसर जैसे रोगों में भूमिका निभाते हैं. हाइपोक्सिया भी आइलेट प्रत्यारोपण परिणामों को प्रभावित करने वाले एक confounding कारक है. हाल ही में, हाइपोक्सिया, या रुक - रुक कर हाइपोक्सिया (एच) की अस्थायी दोलनों "शर्त" टापू 1 में लाभ का प्रदर्शन किया है. हालांकि, आइलेट शरीर क्रिया विज्ञान पर स्थिर और क्षणिक दोनों हाइपोक्सिया प्रभाव अच्छी तरह से मुख्य रूप से आइलेट के microenvironment नियंत्रित करने के लिए उपयुक्त उपकरणों की कमी के कारण या समझ का अध्ययन किया जाना बाकी है.
आइलेट्स अच्छी तरह vivo में vascularized रहे हैं
अग्नाशय islets 50-400 हैं 56, बीटा कोशिकाओं और ग्लूकोज homeostasis के लिए जिम्मेदार हैं कि अल्फा कोशिकाओं सहित अंत: स्रावी कोशिकाओं, के एम गोलाकार समुच्चय. टापू एटीपी संवेदनशील पोटेशियम (कश्मीर एटीपी) चैनलों और इंसुलिन कणिकाओं के एक्सोसाइटोसिस हो सके कि कैल्शियम बाढ़ में परिणाम खुल जो एटीपी उत्पादन, के लिए रक्त, तेज और ग्लाइकोलाइसिस नेतृत्व में उत्तेजक ग्लूकोज के संपर्क में हैं. आक्सीजन इस भारी चयापचय की प्रक्रिया को ड्राइव करने के लिए और इंसुलिन स्राव काफी ग्लूकोज ढ़ाल के अलावा रक्त प्रवाह और ऑक्सीजन की आपूर्ति की गतिशीलता से प्रभावित होता है महत्वपूर्ण है. वे अत्यधिक प्रत्येक, अग्न्याशय में perfused हैं के रूप में आइलेट्स आसानी से एक केशिका पोत से एक सेल लंबाई के भीतर विवो में इस ग्लूकोज इंसुलिन की प्रतिक्रिया करते हैं. हालांकि, intraislet capillaries के घने नेटवर्क आइलेट अलगाव 2,3 दौरान collagenase द्वारा हटा दिया जाता है. नतीजतन, ऑक्सीजन और पोषक तत्व दोनों की आपूर्ति के कारण प्रसार सीमाओं को एक 100 मीटर परिधि के लिए विवश कर रहे हैं.
आइलेट microenvironment पुनः बनाने में कदम "> वर्तमान तकनीक सीमित है सफलतापुनः आइलेट के मूल निवासी ऑक्सीजन और ग्लूकोज की गतिशीलता, शारीरिक और pathophysiological शर्तों मॉडलिंग की कुंजी, व्यापक प्रवाह की आवश्यकता होती है और आइलेट कार्यों की सतत निगरानी की कमी है कि मानक hypoxic कक्षों से हासिल करना मुश्किल है. इसके अलावा, प्रकार के प्रत्यारोपण के उपचारों मैं मधुमेह शारीरिक अग्न्याशय (5.6%, 40 एमएमएचजी) की तुलना में काफी कम पीओ 2 (<2%, 5-15 एमएमएचजी) है जो यकृत पोर्टल प्रणाली 4 में हाइपोक्सिया के लिए अलग टापू बेनकाब. बाद प्रत्यारोपण, आइलेट grafts revascularized होने के लिए दो सप्ताह या उससे अधिक ले. यह hypoxic जोखिम आइलेट के ग्लूकोज इंसुलिन युग्मन तंत्र कि impairs प्रदर्शन किया गया. प्रोत्साहन स्राव युग्मन कारकों, संकेत कैल्शियम, mitochondrial क्षमता, और इंसुलिन कैनेटीक्स के बीच आसानी से microfluidics उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. हमारे पिछले microfluidic तकनीक इस पुनः प्रदर्शन कियाअल समय एकल आइलेट 5,6 चारों ओर जलीय microenvironment के सटीक मॉडुलन के साथ निगरानी. हालांकि, आइलेट के hypoxic हानि की मात्रा का ठहराव एक साथ उत्तेजना और निगरानी तकनीक की कमी से stymied है. इसलिए, ऑक्सीजन और आइलेट निगरानी की microfluidic नियंत्रण के संयोजन आइलेट हाइपोक्सिया पढ़ाई में सुधार कर सकते हैं.
Microfluidics जलीय और ऑक्सीजन microenvironment विश्राम और न्यूनाधिक कर सकते हैं
ऊतक और संस्कृति हाइपोक्सिया के अध्ययन के लिए मानक तकनीक hypoxic कक्षों के आधार पर किया गया है. सामान्य में, hypoxic कक्षों मिनट पर पहुंचा गतिशील हाइपोक्सिया के साथ असंगत ~ 10-30 मिनट में संतुलन बार, साथ ही ऑक्सीजन सांद्रता प्रदान करते हैं. दो हाल के अध्ययनों से ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन प्रतिक्रिया 7,8 पर परस्पर विरोधी परिणामों के साथ, पूरे चूहों पर रुक - रुक कर हाइपोक्सिया जोखिम के लिए छोटे कस्टम कक्षों का इस्तेमाल किया. पूरे जानवरों के स्तर पर, respired ऑक्सीजन सीधे ट्रॅन नहीं है कि मन में रखिएकारण श्वसन प्रणाली में नियंत्रण करने के लिए, पो 2 केशिका आइलेट की उम्मीद. इसके अलावा, इन अध्ययनों मानकीकृत ऑक्सीजन का स्तर नहीं है, और न ही वे islets के ऊतक स्तर पर वास्तविक समय उपाय प्रदान करते हैं.
दूसरी ओर, ऑक्सीजन microfluidics गैस चैनल नेटवर्क के माध्यम से ऑक्सीजन को नियंत्रित करने से इन सीमाओं को पार कर सकते हैं. इसके अलावा, microfluidics, ऑक्सीजन मॉडुलन के दौरान मानक hypoxic कक्षों के साथ एक करतब फिलहाल संभव नहीं रहते इमेजिंग के साथ संगत है. इन उपन्यास microfluidics के एक नंबर लक्ष्य कोशिकाओं 9-14 से अधिक मीडिया प्रवाह कि microchannels में ऑक्सीजन सांद्रता भंग करने polydimethylsiloxane की गैस पारगम्यता उपयोग दृष्टिकोण. इन उपकरणों को भी कई असतत ऑक्सीजन सांद्रता, प्रतिदीप्ति आधारित ऑक्सीजन सेंसर, और पर चिप भी रासायनिक ऑक्सीजन पीढ़ी एकीकृत है.
लिक्विड solvation आधारित microfluidics मैं के रूप में एक कठिन समय स्थिर, निरंतर ढ़ाल को बनाए रखने के लिए हैटी स्थितियों के प्रवाह के प्रति संवेदनशील है जो संवहनी मिश्रण पर निर्भर करता है. इसकी तुलना में, हम यहाँ का उपयोग तकनीक ऑक्सीजन प्रसव के प्रसार पथ को कम करने पर केंद्रित है. गैस solvation और कतरनी प्रवाह सीधे कोशिकाओं या आइलेट ऊतकों के साथ वरीयता प्राप्त एक झिल्ली भर में ऑक्सीजन diffusing से समाप्त हो जाते हैं. इस solvation को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त microfluidics निकालता है और खुद इंसुलिन रिलीज ट्रिगर कर सकते हैं जो टापू, को अनावश्यक कतरनी तनाव को रोकता है. इस मंच प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ऊपर विनियमन सेल संस्कृति 1,15 में hyperoxic और hypoxic दोनों चरम सीमाओं (2-97% 2 हे) पर. क्योंकि ऑक्सीजन और कतरनी प्रवाह को हटाने के प्रत्यक्ष वितरण के, हमारे प्रसार आधारित प्लेटफॉर्म आइलेट हाइपोक्सिया के अध्ययन के लिए इष्टतम microfluidic समाधान प्रदान करता है.
मल्टीमॉडल उत्तेजना और निगरानी
आइलेट मील के अध्ययन के लिए अनुकूलित जब प्रसार आधारित microfluidics भी अतिरिक्त लाभ लाता हैcrophysiology. एक प्रसार बाधा के रूप में एक झिल्ली का उपयोग करके, तरल hypoxic stimulations से स्वतंत्र रूप से जलीय ग्लूकोज stimulations के नियंत्रण को सक्षम करने, ऑक्सीजन modulations से अलग किया जा सकता है. इस टापू को कि स्थानिक पिन अंक वितरण एक सैंडविच की तरह एक साथ उत्तेजना पैदा करता है. गैस अस्थायी कम्प्यूटरीकृत microinjectors माध्यम संग्राहक है के रूप में इसके अलावा, हम 60 सेकंड से भी कम समय क्षणिक समय के साथ डिजिटल रूप 21-0% से ऑक्सीजन एकाग्रता न्यूनाधिक कर सकते हैं. माइक्रोस्कोप में ऑक्सीजन और ग्लूकोज microenvironment के गतिशील नियंत्रण मानक hypoxic कक्षों का उपयोग संभव है या असाधारण बोझिल नहीं होगा कि एक वास्तविक समय बहुविध प्रोटोकॉल अनुमति देते हैं. इस उपकरण का उपयोग करना, कैल्शियम संकेतन (Fura-AM), mitochondrial क्षमता (Rhodamine 123), और इंसुलिन कैनेटीक्स (एलिसा) हाइपोक्सिया के तहत गतिशील ग्लूकोज इंसुलिन प्रतिक्रिया की एक पूरी तस्वीर प्रदान करने के लिए निगरानी की गई.
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Protocol
1. माउस आइलेट्स की तैयारी
- C57BL 6 / चूहों काटना और collagenase पाचन और Ficoll घनत्व ढाल जुदाई से टापू अलग. (2,3 में संदर्भित जौव लेख का उल्लेख).
- 10% FBS, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और पेट्री डिश में 20 मिमी HEPES युक्त RPMI 1640 मध्यम में टापू सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2). बाद अलगाव, संस्कृति प्रयोगों में उपयोग करने के लिए पिछले 24 घंटे के लिए आइलेट्स. अनुरूप परिणाम सुनिश्चित करने के लिए 1-2 दिनों के भीतर टापू का प्रयोग करें.
2. Microfluidic मंच बनाना
- प्रत्येक डिवाइस परत के लिए पारदर्शिता photomasks पर microstructure geometries उत्पन्न: 1) इनलेट और आउटलेट, perifusion कक्ष के साथ 2) ग्लूकोज microfluidic परत (8 मिमी व्यास x 3 मिमी, 150 μl), microwells साथ 3) 200 माइक्रोन झिल्ली (500 माइक्रोन व्यास, 100 गहरी माइक्रोन), और 4) गैस microfluidic परतें.
- इनलेट और आउटलेट परत बनाना, के लिए degassed, premixed PDMS डालना2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक खाली पेट्री डिश और इलाज में 1.5 मिमी की ऊंचाई. 2 मिमी व्यास इनपुट / बाहर बंदरगाहों पंच.
- ग्लूकोज microfluidic परत बनाना, सिलिकॉन वेफर में एक 4 पर एक भी 700 माइक्रोन परत फार्म SU8-2150 के दो 350 माइक्रोन परतों स्पिन.
- एक 700 मीटर लंबा मास्टर उत्पादन, विकास के बाद SU8 पर microchannel पैटर्न हस्तांतरण के लिए उपयुक्त photomask के माध्यम से यूवी प्रकाश बेनकाब.
- 3 मिमी की ऊंचाई तक यह मास्टर पर degassed, premixed PDMS डालो और 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इलाज. इस कटौती के एक रेजर ब्लेड के साथ आकार PDMS.
- 2 मिमी व्यास इनपुट / आउटपुट बंदरगाहों के साथ ही 8 मिमी व्यास कक्ष पंच.
- Microwells साथ 200 माइक्रोन झिल्ली बनाना, 100 माइक्रोन तक SU8-2100 स्पिन. यह 100 मीटर लंबा मास्टर पर microwell पैटर्न स्थानांतरित करने के लिए एक ही यूवी लिथोग्राफी लागू करें.
- स्पिन 30 सेकंड के लिए 900 rpm पर इस मास्टर पर, premixed PDMS degassed और 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इलाज. SPImicrowell पैटर्न युक्त 200 माइक्रोन PDMS झिल्ली में जिसके परिणामस्वरूप एक ही शर्तों का उपयोग पहले के ऊपर NA दूसरी परत,.
- यह झिल्ली के माध्यम से 2 मिमी व्यास के इनपुट / आउटपुट बंदरगाहों पंच
- गैस microfluidic परत बनाना, 100 माइक्रोन तक SU8-2100 स्पिन. यह 100 मीटर लंबा मास्टर पर गैस microfluidic पैटर्न स्थानांतरित करने के लिए एक ही यूवी लिथोग्राफी लागू करें.
- 1.5 मिमी की ऊंचाई तक यह मास्टर पर degassed, premixed PDMS डालो और 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इलाज. एक धार के साथ आकार करने के लिए PDMS कट.
- इस परत के माध्यम से 2 मिमी व्यास इनपुट / आउटपुट बंदरगाहों पंच
- , कई परतों बंधन, स्कॉच टेप के साथ सफाई कोरोना चाप को उजागर, और उसके बाद निम्न क्रम में हाथ से संरेखित करके उन्हें तैयार करने के लिए.
- Microwells का सामना करना पड़ के साथ नीचे गैस की परत को झिल्ली बंधन.
- Microwell झिल्ली के शीर्ष पर ग्लूकोज microfluidic बांड.
- इनलेट और आउटलेट परत ओ बंधनn पूरे विधानसभा encapsulating बहुत ऊपर,.
- शीर्ष पर 1 किलो वजन जोड़ने और 3 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर पाक द्वारा संबंधों को सुदृढ़.
- पानी के तहत पूरे डिवाइस जलमग्न तो, जलीय परत में पानी लोड करके पूरा डिवाइस रिसाव का परीक्षण. फिर, एक खाली सिरिंज के साथ गैस परत के माध्यम से हवा का प्रवाह.
- डिवाइस उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है, जिसमें पीबीएस बफर के साथ फिर फ्लश जलीय परत के माध्यम से 70% इथेनॉल के साथ रिसाव से मुक्त उपकरणों जीवाणुरहित.
3. Microdispenser सेटअप
- ऑक्सीजन के मिश्रण और वितरण सेटअप के निर्माण के लिए 2 microdispensers, 5 वी और 20 वी डीसी बिजली की आपूर्ति, और एक डिजिटल मैं / हे बोर्ड प्राप्त करते हैं.
- शामिल चालक इकाइयों को microdispensers 'नियंत्रण सुराग कनेक्ट करें.
- Labview नियंत्रण करने के लिए इसी बंदरगाहों पर डिजिटल मैं / हे बोर्ड के लिए ड्राइवरों कनेक्ट करें.
- ड्राइव विश्वविद्यालय को संपर्कों इसी को 5 वी और 20 वी बिजली की आपूर्ति कनेक्टटीएस.
- गैस नियंत्रण (परिशिष्ट) के लिए Labview कोड निष्पादित करने के लिए एक लैपटॉप के लिए डिजिटल मैं / ओ कनेक्ट करें.
- जबकि एक और संपीड़ित हवा के लिए, दोनों के साथ 5% सीओ 2 नाइट्रोजन के लिए एक microdispenser कनेक्ट करें. 2 साई को दोनों गैसों सेट करें. पूर्व microfluidic डिवाइस में प्रवेश करने के लिए एक टी जंक्शन में dispensers 'outputs को हुक.
- एक रिसाव का परीक्षण उपकरण का उपयोग कर, (उपकरण सूची और प्रतिनिधि परिणाम देखें) एक फाइबर ऑप्टिक ऑक्सीजन संवेदक के साथ पानी में घुलित ऑक्सीजन को मापने, जबकि 5-21% ऑक्सीजन के बीच microdispensers साइकिल द्वारा ऑक्सीजन मॉडुलन के क्षणिक प्रतिक्रिया विशेषताएँ.
4. माइक्रोस्कोपी पर सेट करना
- उलटा माइक्रोस्कोप पर गरम चरण के लिए डिवाइस माउंट.
- इस उपकरण के लिए 0% और 21% 2 हे गैसों कनेक्ट और ऑक्सीजन संवेदक के साथ जांच करना.
- एक अंश कलेक्टर को ग्लूकोज की microfluidics आउटपुट पोर्ट से कनेक्ट करें.
- क्रेब्स घंटी बाइकार्बोनेट की तैयारीबफर (KRB): 129 मिमी NaCl, 5 मिमी 3 NaHCO, 4.7 मिमी KCl, 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 1 मिमी 2 CaCl · 2H 2 हे, 1.2 मिमी 4 MgSO · 7 2 हे, 10 मिमी HEPES पीएच 7.35-7.40 , 2 मिमी बेसल ग्लूकोज, और 5% FBS.
- शंक्वाकार ट्यूबों 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नहाया 50 मिलीलीटर में क्रमशः 2 मिमी और 14 मिमी ग्लूकोज युक्त दो बफर समाधान तैयार करें.
- ट्यूबिंग में 250 μl / मिनट पर बफर आकर्षित करने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से कनेक्ट करें. Microfluidic डिवाइस में प्रवेश करने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस hotplate अधिक ट्यूबिंग प्रवाह.
- टापू दाग, क्रमशः, अंतिम डाई 5 माइक्रोन की सांद्रता और 2.5 माइक्रोन तक पहुँचने के लिए KRB के 2 मिलीलीटर के लिए 100% इथेनॉल में DMSO और Rh123 में Fura-2:00 जोड़ें.
- एक 10 μl विंदुक के साथ टापू उठाओ और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए रंगों में सेते
- ग्लूकोज microchannel प्रवेश के माध्यम से डिवाइस में लगभग 20 टापू लोड करें. वापस टी में दुकान से बफर भड़काना द्वारा चेंबर में टापू प्रत्यक्षवह इनलेट.
- अतिरिक्त रंगों दूर धोने के लिए 10 मिनट के लिए बफर में टापू छिड़कना.
5. एक साथ ऑक्सीजन और ग्लूकोज उत्तेजना रनिंग
- 14 मिमी उत्तेजना के 15 मिनट के द्वारा पीछा KRB2 द्वारा स्थापित आधारभूत के 5 मिनट के साथ एक ग्लूकोज उत्तेजना पल्स देने, तो KRB2 में 15 मिनट के लिए धो लो.
- Rh123 के लिए Fura-2 और 534 उत्सर्जन रिकॉर्ड 340/380 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य.
- प्रत्येक प्रयोग से पहले एक सामान्य नाड़ी (14 मिमी normoxic) की माप करना.
- ऑक्सीजन मॉडुलन (हाइपोक्सिया / रुक - रुक कर हाइपोक्सिया) के लिए, केवल संवहनी गड़बड़ी को कम करने के लिए, उत्तेजना और वाशिंग कदम और अन्य कदमों में कोई प्रवाह के दौरान बफर प्रवाह लागू होते हैं.
- एलिसा इंसुलिन परख के लिए 1 मिनट के अंतराल पर ग्लूकोज आउटलेट से अपशिष्ट लीजिए.
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Representative Results
इस आइलेट हाइपोक्सिया तकनीक को सेंट्रल मिनट पैमाने पर यात्रियों के साथ ही microfluidic कक्ष में जलीय और गैसीय अवस्था उत्तेजना मिलाना करने की क्षमता है. चित्रा 1 ए) के एक प्रतिनिधि परिणाम है आइलेट कक्ष के भीतर मापा दोहरी stimulations और ख) तेजी से modulations. चेंबर में fluorescein के लागू होने से दिखाया जलीय मॉडुलन, मिश्रण के तीन से चार मिनट में संतुलन प्राप्त होता है. इसके अलावा, ऑक्सीजन 2 मिनट के रूप में के रूप में कम समय के साथ ऑक्सीजन की साइकिल को सक्षम करने, तेजी से यात्रियों के साथ 5-21% से कदम रखा जा सकता है. चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में विभिन्न साइकिल चालन गहराई और आवृत्तियों भी प्राप्त किया जा सकता है.
इस साइकिल टापू पर रुक - रुक कर हाइपोक्सिया बनाने के लिए लागू किया जाता है जब एक नियमित, normoxic नाड़ी, चित्रा 3 ए की तुलना में, एक, हाइपोक्सिया के खिलाफ टापू शर्त के लाभों का निरीक्षण कर सकते हैं. Intracellular कैल्शियम प्रवाह संकेत mechanis क्योंकिइंसुलिन का मीटर स्राव है वास्तविक समय में निगरानी, हाइपोक्सिया और IH का प्रभाव कैल्शियम यात्रियों, चित्रा 3 बी की overshoot और कंपन भिगोना में मनाया जा सकता है. ये कश्मीर एटीपी चैनलों शर्त प्रक्रिया को नियंत्रित करने के सुझाव के साथ जुड़े महत्वपूर्ण मानकों हैं. इसके अलावा, चयापचय और hypoxia के लिए mitochondria की कड़ी Rh123 का उपयोग mitochondrial क्षमता की निगरानी के द्वारा देखे जा सकते हैं. अंत में, microfluidic अपशिष्ट का संग्रह कुल इंसुलिन मात्रा की एलिसा परख की अनुमति देता है. कैल्शियम, mitochondrial क्षमता है, और इंसुलिन hypoxic यात्रियों, चित्रा -3 सी के तहत ग्लूकोज इंसुलिन प्रतिक्रिया की बहुविध देखने का निर्माण शुरू हो कि तीन मानकों हैं.
चित्रा 1. एक साथ ऑक्सीजन और ग्लूकोज stimulations. (एक) स्टेटिक नियंत्रण. शीर्ष: 250 μl में FITC अणु के चैंबर परिचय / मिनट समय मिश्रण के 3 मिनट के भीतर स्थिर. नीचे: गैस नियंत्रण स्थिर 5 का वितरण, 10, और झिल्ली में 21% ऑक्सीजन प्रदान करता है (ख) अस्थायी नियंत्रण.. (भंग) गैस वितरण (विसरित) पर और सतह microwells के दोनों मापा के रूप में 5-21% के बीच ऑक्सीजन की साइकिलिंग 1 मिनट की अवधि के साथ संभव है.
चित्रा 2. Microfluidic युक्ति भी अन्य ऑक्सीजन प्रोफाइल उत्पन्न कर सकते हैं. विभिन्न IH प्रोफाइल के गैस कम्प्यूटरीकृत microinjectors से मिश्रण के माध्यम से गहराई (5-10-15%) बदलती के साथ ही साइकिल की अवधि (3-6-1 मिनट) से प्राप्त किया जा सकता है .
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चित्रा 3. IH टापू हाइपोक्सिया के लिए प्रतिक्रियाओं में सुधार हुआ है preconditioned. IH का उपयोग शर्त के (ए) प्रतिनिधि सिंहावलोकन, normoxic नाड़ी (पिछले एक प्रयोग में एक ही आइलेट बैच) की तुलना में बढ़ाया hypoxic प्रतिक्रिया दिखा, 5% से कम 30 मिनट के लिए जोखिम का कुल. बाद में हाइपोक्सिया के 10 मिनट अभी भी शर्त रखता है. मतलब normoxic, hypoxic, और preconditioned hypoxic प्रतिक्रियाओं का (बी) मढ़ा तुलना. इनसेट दोलन व्यवहार की वसूली के साथ प्रतिनिधि निशान से पता चलता अलग ऑक्सीजन और रासायनिक स्थितियों के लिए (ग) मल्टीमॉडल Fura-2, इंसुलिन, और Rh123 प्रतिक्रियाएं:. 21% ऑक्सीजन, 5% ऑक्सीजन, शर्त (पी 5%), diazoxide (डी + 5%), और 5HD (5HD + पी 5%). 5HD उद्घाटन और BLOCKï द्वारा शर्त के लाभों को नकारती है, जबकि Diazoxide शर्त के अनुरूप हैक्रमशः एनजी KATP चैनलों,. * पी <0.05, ** पी <0.01, *** 5HD बनाम पी बनाम 5% बनाम 21%, 5% 5%, डी 5% + पी 5%: टी परीक्षण दो पूंछ पी <0.001.
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Discussion
इस आइलेट हाइपोक्सिया तकनीक में एकीकृत एकाधिक रूपरेखा मौजूद कई बिंदुओं समस्या निवारण के लिए यहाँ का उल्लेख किया. सबसे पहले पृथक टापू को नीचा दिखाना और कारण कोष्ठकी कोशिकाओं से पाचन एंजाइमों के लिए संस्कृति में बिखर जारी है. आइलेट अलगाव के बाद 1-2 दिनों के लिए प्रयोगों का मानकीकरण अनुरूप परिणाम प्राप्त करने में इस प्रकार महत्वपूर्ण है. दूसरा, जलीय प्रवाह लामिना का प्रवाह और प्रसार के बीच सीमा पर संवहनी निकासी को रोकने के लिए हाइपोक्सिया और रुक - रुक कर हाइपोक्सिया के दौरान बंद कर दिया गया था. इस आइलेट शर्त की अवधि सीमित करने के लिए लगता है. अभी भी झिल्ली में तेजी से गैस modulations की अनुमति है जबकि जलीय चैनल में एक गैस विनिमय के भविष्य का एकीकरण इस नाबालिग मंजूरी समाप्त कर सकते हैं. टापू लोड करने के दौरान तीसरा, जलीय ट्यूबिंग हवाई बुलबुले फँसाने से बचने के लिए (आउटलेट तो इनलेट) उल्टे क्रम में ध्यान से reconnected किया जाना चाहिए. अन्त में, भविष्य डिवाइस वितरण में मदद करने के लिए, एक को हवा दे दी आउट microfluidic के वितरक के साथ संवर्धित किया जा सकता हैTrapper जेब से एक सरणी के साथ किया जा सकता नमूनों जो के तल पर, पूरे चैम्बर से अधिक islets के क्लस्टर ते. जेब सरणी के अलावा इस microfluidic वितरण उच्च throughput प्रयोगों के लिए islets की एक स्थितीय सरणी बनाने में मदद मिलेगी.
पहले इस microfluidic आइलेट हाइपोक्सिया तकनीक के लिए, सबसे तेजी से रुक - रुक कर हाइपोक्सिया modulations दबाव गैस की उच्च प्रवाह के साथ छोटे कस्टम hypoxic कक्षों का उपयोग करके 1-3 मिनट के चक्र में प्राप्त किया गया. हालांकि, इनमें से केवल एक छोटा सा टाप स्तर पर पूरी पशुओं और नहीं पर इस्तेमाल किया जा सकता है. (श्वसन संतुलन के बाद) पूरे 'जानवरों अग्न्याशय में हासिल की वास्तविक हाइपोक्सिया स्तर की अनिश्चितता के अलावा वास्तविक समय, अच्छी तरह से नियंत्रित microenvironments में ग्लूकोज इंसुलिन की प्रतिक्रिया की जांच करने में असमर्थता भी वहाँ है. इसकी तुलना में, दोनों जलीय और गैस stimulations हमारे microfluidics में मिनट समय तराजू को नियंत्रित कर रहे हैं. ये modulations यह भी के लिए माइक्रोस्कोप पर सीधे बढ़ रहे हैंआर multiparametric निगरानी. पिछले हमारी तकनीक को, repeatable और अच्छी तरह से विशेषता आइलेट पूर्व शर्त प्राप्त नहीं किया गया है. ऐसे टापू के रूप में ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील पूर्व vivo ऊतकों बेहतर छोटे सेल संस्कृति मंच और बड़े कक्ष तंत्र के बीच फंस रहे हैं उनके microscaled आयाम (यानी 100 मीटर त्रिज्या) के रूप में इस microfluidic मंच के लिए अनुकूल हैं. टापू के अलावा, के एक नंबर के पूर्व vivo ऊतकों सहित हृदय ऊतक, मस्तिष्क स्लाइस, और भ्रूण कर सकते हैं इस तकनीक का उपयोग कर जांच की जा.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य अनुदान R01 DK091526 (जो), NSF 0852416 (DTE) के राष्ट्रीय संस्थानों, और शिकागो मधुमेह परियोजना द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in | |
References
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