Summary
Mikroakışkan oksijen kontrol biyolojik deneyler için hipoksik odaları üzerinde sadece kolaylık ve hız daha fazla bahşeder. Bir zarından difüzyon yoluyla uygulanan, özellikle mikrofluidik oksijen mikro-düzeyde eşzamanlı sıvı ve gaz fazı modülasyon sağlayabilir. Bu teknik, adacık patofizyolojisi çalışmak için dinamik çok kritik parametre deneyler sağlar.
Abstract
Tek bir teknik glikoz uyarıcı salgılama birleştirme faktörler aynı anda oksijen ve izlenmesi özellikle transplant ortamlarda, adacık hipoksi fizyopatolojik durumlarını modellemek için çok önemlidir. Standart hipoksik odası teknikler aynı anda hem uyarılmalara modüle ne glikoz uyarı-sekresyon bağlama faktörlerin gerçek zamanlı izleme sağlayamaz. Bu zorlukları gidermek için, bir difüzyon membranı aracılığı ile sulu ve gaz fazı modülasyon hem de entegre bir katmanlı mikroakışkan tekniği uygulandı. Bu floresan mikroskobu ile yukarıda belirtilen birleştirme faktörlerin izlenmesi sağlayan saydam polidimetilsiloksan (PDMS) cihazı içinde microscaled adacık etrafında bir uyarım sandviç oluşturur. Buna ek olarak, gaz giriş% 0-21 arasındaki oksijen kantitatif, alt dakika modülasyonu sağlayan microdispensers bir çifti tarafından kontrol edilir. Bu aralıklı hipoksi ada yeni bir fenomen araştırmak için uygulanırt önşartlandırma. Ayrıca, multimodal mikroskobu ile donanmış, bu hipoksik olaylar sırasında ayrıntılı kalsiyum ve K ATP kanal dinamiklerine bakmak başardık. Biz adacıklar okuyan yanı sıra birçok ex vivo dokular değerli bir araç olarak, mikroakışkan hipoksi, özellikle bu eş zamanlı çift faz tekniği öngörülüyor.
Introduction
Dinamik hipoksi özellikle adacık nakli için, biyolojide önemli
Dinamik Hipoksi çok biyolojik dokuda önemli bir fizyolojik hem de patofizyolojik bir parametredir. Oksijen değişim, örneğin, anjiyojenezin güçlü bir gelişim sinyaldir. Ayrıca, hipoksi mekansal ve zamansal desenler HIF1-alfa modüle ve pankreas kanseri gibi hastalıklarda rol oynar. Hipoksi aynı zamanda adacık nakli sonuçlarını etkileyen karıştırıcı bir faktör olduğunu. Son zamanlarda, hipoksi veya aralıklı hipoksi (İH) zamansal olarak salınımları "önşartlama" adacık 1 faydalar göstermiştir. Ancak, adacık fizyoloji statik ve geçici hem hipoksi etkisi de öncelikle nedeniyle islet en mikroçevreyi kontrol etmek için uygun araçlar eksikliği anlaşılan ya, incelenecek henüz.
Islets iyi in vivo vaskülarize edilir
Pankreas adacıkları olan 50-400 56, beta-hücreleri ve glukoz homeostazı sorumlu olan alfa-hücreleri de dahil olmak üzere endokrin hücreleri, m küremsi agrega. Adacıklar ATP'ye duyarlı potasyum (K ATP) kanal ve insülin granül eksositosizini tetikler kalsiyum girişine sonuçlar açılır ATP üretimi için kan alımı ve glikoliz kurşun uyarıcı glikoz maruz kalır. Oksijen, bu ağır metabolik süreci götürmek ve insülin salgısı belirgin glukoz geçişlerini ek olarak kan akımı ve oksijen kaynağı dinamikleri tarafından etkilenir önemlidir. Bunlar son derece her biri, pankreas perfüze edildiği gibidir Islets kolayca kılcal bir tekneden bir hücre uzunluğu içinde in vivo olarak bu glukoz, insülin yanıtı gerçekleştirin. Bununla birlikte, adacık içi bir kapiller yoğun ağ doku adacığı izolasyonu 2,3 sırasında kolajenaz ile çıkarılır. Sonuç olarak, oksijen ve besin hem malzemeleri nedeniyle difüzyon sınırlamaları 100 mikron çevresine kısıtlı.
adacık mikroortam yeniden adım "> Güncel teknikler sınırlı başarıYeniden islet yerli oksijen ve glikoz dinamikleri, fizyolojik ve patofizyolojik koşulları modelleme anahtar, ayrıntılı akışını gerektiren ve adacık fonksiyonlarının sürekli izlenmesi eksikliği standart hipoksik odaları ile elde etmek zordur. Ayrıca, Tip nakli tedavileri ben diyabet pankreas fizyolojik (% 5.6, 40 mmHg) kıyasla çok daha düşük pO 2 (<% 2, 5-15 mmHg) olan hepatik portal sistem 4 hipoksi izole adacıklar maruz. Post-transplant, adacık greft Revaskülarize gereken iki hafta veya daha fazla sürebilir. Bu hipoksik maruz islet glikoz insülin bağlama mekanizmasını olumsuz etkileri gösterilmiştir. Uyarı-sekresyon bağlama faktörler, kalsiyum sinyalizasyon, mitokondriyal potansiyelleri, ve insülin kinetik arasında kolayca mikroflüidik kullanılarak izlenebilir olabilir. Bizim önceki microfluidic tekniği bu yeniden gösterdiEl-zamanlı tek adacık 5,6 civarında sulu mikro hassas modülasyonu ile izlenmesi. Ancak, adacık hipoksik bozulma ölçümü aynı anda uyarılması ve izleme teknikleri eksikliği stymied edilir. Bu nedenle, oksijen ve adacık izleme mikrofluidik kontrol birleştirerek adacık hipoksi çalışmaları artırabilir.
Mikroakiskan sulu ve oksijen mikroortam yeniden ve modüle edebilir
Doku ve kültürü hipoksi çalışmaları için standart teknik hipoksik odaları dayalı olmuştur. Genel olarak, hipoksik odaları dakika-ölçekli dinamik hipoksi ile bağdaşmayan ~ 10-30 dakika içinde dengeleme süreleri, tek oksijen konsantrasyonu sağlamak. İki yeni çalışmalar glikoz uyarılan insülin yanıtı 7,8 çelişkili sonuçlar, bütün fareler üzerinde aralıklı hipoksi poz için küçük özel odaları kullanılmaktadır. Bütün hayvan düzeyinde, solunuma oksijen doğrudan tran olmadığını Unutmayınnedeniyle solunum sistemi denetimleri, pO2 kılcal adacık planlanıyor. Dahası, bu çalışmalar, standart oksijen seviyeleri yoktur, ne de adacıklar doku düzeyinde gerçek-zamanlı önlemleri sağlıyoruz.
Öte yandan, oksijen Mikroakiskan gaz kanalı ağlar aracılığıyla oksijenin bu sınırlamaları aşmak olabilir. Ayrıca, Mikroakiskan, oksijen modülasyonu esnasında standart hipoksik odaları ile feat şu anda mümkün değil canlı görüntüleme ile uyumludur. Bu yeni Mikroakiskan bir dizi hedef hücrelerin 9-14 üzerinden medya akışı mikrokanallardaki içine oksijen konsantrasyonlarını çözmek için polidimetilsiloksanın gaz geçirgenliğini kullanmak yaklaşır. Bu cihazlar aynı zamanda birden fazla ayrık oksijen konsantrasyonlarını, floresan bazlı oksijen sensörleri, ve on-chip bile kimyasal oksijen nesil entegre etmiş.
Sıvı solvasyon tabanlı Mikroakiskan i gibi bir sabit zaman kararlı, sürekli geçişlerini bakımı vart koşulları akış duyarlıdır konvektif karıştırma bağlıdır. Buna karşılık, biz burada kullanmak teknik oksijen teslim difüzyon yolu azalan odaklanır. Gaz solvasyon makaslama akış doğrudan hücreler veya adacığı dokularla tohumlanmış bir zarından oksijen yayarak netleştirilmiştir. Bu solvasyonu kontrol etmek için gerekli ekstra mikroflüidik kaldırır ve kendisi insülin salınımını tetikleyebilir adacıklar, gereksiz kayma stresi önler. Bu platform reaktif oksijen türleri (ROS) göstermek için kullanılır olmuştur up-regülasyonu hücre kültürü 1,15 olarak hiperoksik ve hipoksik hem aşırı (2-97% O 2) de. Çünkü oksijen ve kesme akışının çıkarılması doğrudan teslimat, bizim difüzyon tabanlı platform adacık hipoksi çalışmaları için uygun mikroakışkan bir çözüm sağlar.
Multimodal stimülasyon ve izleme
Adacık MI çalışmak için adapte edilmiş zaman difüzyon merkezli ve arayüz da ek avantajlar getirircrophysiology. Bir difüzyon bariyeri olarak bir membran kullanılarak, sıvı hipoksik stimülasyondan bağımsız bir şekilde, sulu glukoz uyarılarının kontrol sağlayan, oksijen modülasyon izole edilebilir. Bu adacıklar mekansal pin puan teslimat sandviç gibi eşzamanlı stimülasyon oluşturur. Gaz geçici olarak bilgisayar mikropüskürtücü ile modüle edilir Dahası, biz 60 sn'den daha azdır, geçici bir süre ile dijital olarak 21-0 'den% oksijen konsantrasyonunu modüle edebilir. Mikroskop de oksijen ve glükoz mikro dinamik kontrol standart hipoksik odası kullanılarak mümkün ya da olağanüstü hantal değil, gerçek zamanlı bir protokolü multimodal izin verir. Bu cihazı kullanırken, kalsiyum sinyal (Fura-AM), mitokondriyal potansiyeller (Rhodamine 123) ve insülin kinetik (ELISA) hipoksi altında dinamik glikoz-insülin yanıtı tam bir resmini elde etmek için takip edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fare Islets hazırlanması
- C57BL / 6 fareleri inceleyin ve kollajenaz sindirimi ve Ficoll yoğunluk gradyan ayırma ile izole adacıklar. (2,3 başvurulan JOVE makalelere bakın).
- % 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve Petri tabaklarında 20 mM HEPES ihtiva eden RPMI-1640 ortam maddesi içinde inkübe adacıklar (37 ° C,% 5 CO2). Post-izolasyon, kültür deneylerinde kullanılmadan önce 24 saat boyunca adacıklarının. Tutarlı sonuçlar için 1-2 gün içinde adacıklar kullanın.
2. Mikroakışkan Platform Yapımı
- Her cihaz katman için şeffaflık PHOTOMASKS üzerinde mikro geometrileri oluşturmak: 1) giriş ve çıkış, perifüzyon odasına 2) Glikoz mikroakışkan katman (8 mm çap x 3 mm, 150 ul), mikro oyuk 3) 200 mikron membran (500 mikron çaplı, 100 derin um), ve 4) gaz mikroakışkan katmanları.
- Giriş ve çıkış katmanı imal etmek için, gazı alınmış, önceden karıştırılmış PDMS dökmek2 saat boyunca 80 ° C'de boş bir Petri çanağı ve tedavi de 1.5 mm'lik bir yüksekliğe sahiptir. 2 mm çaplı giriş / çıkış portları Punch.
- Glikoz mikroakışkan katmanı imal etmek, silikon gofret bir 4'ten bir tek 700 mikron tabaka oluşturmak için SU8-2150, iki 350 mikron katmanları dönerler.
- 700 mikron boyunda ana üretim, geliştirme sonra SU8 üzerine Mikrokanallı deseni aktarmak için uygun photomask boyunca UV ışığı Açığa.
- 3 mm bir yüksekliğe kadar bu ana üzerine gazı giderilmiş, önceden karıştırılmış PDMS dökün ve 2 saat boyunca 80 ° C'de tedavi. Bu kesim, bir tıraş bıçağı ile şekil PDMS.
- 2 mm çapında bir giriş / çıkış bağlantı noktaları ve 8 mm çapında bir bölmeyi yumruk.
- Mikro oyuk ile 200 mikron membran imal etmek, 100 um SU8-2100 dönerler. Bu 100 mikron boyunda master üzerine mikro kalıplarını aktarmak için aynı UV-litografi uygulayın.
- Spin 30 saniye boyunca 900 rpm hızda, bu ana üzerine, önceden karıştırılmış PDMS gazı alındı ve 10 dakika boyunca 80 ° C'de tedavi. Spimikro desen içeren bir 200 mikron PDMS membran ile sonuçlanan aynı koşullar kullanılarak, ilk üstüne na ikinci tabaka.
- Bu zardan 2 mm çapında giriş / çıkış bağlantı noktaları Punch
- Gaz mikroakışkan katmanı imal etmek, 100 um SU8-2100 dönerler. Bu 100 mikron boyunda master üzerine gaz mikrosıvı kalıplarını aktarmak için aynı UV-litografi uygulayın.
- 1.5 mm'lik bir yüksekliğe bu ana üzerine gazı giderilmiş, önceden karıştırılmış PDMS dökün ve 2 saat boyunca 80 ° C'de tedavi. Bir jilet ile şekillendirmek için PDMS kesin.
- Bu katman sayesinde 2 mm çapında giriş / çıkış bağlantı noktaları Punch
- , Çoklu katmanlar bağ, kapaklar ile temizleme korona yay maruz bırakılmasını ve daha sonra, aşağıdaki sırayla elle hizalama onları hazırlamak için.
- Mikrodelikler yukarı bakacak şekilde alt gaz tabakasına zar bağ.
- Mikro membran üzerine glikoz mikroakışkan Bond.
- Giriş ve çıkış katman o bağn bütün aksamını encapsulating çok üst.
- Üst 1 kg ağırlık ekleme ve 3 saat boyunca 100 ° C'de pişirme ile bağ güçlendirilmesi.
- Su altında tüm aygıtı daldırılması, sonra sulu tabaka içine su yükleyerek tamamlanmış aygıtı Kaçak-test edin. Daha sonra, boş bir şırınga ile gaz tabakası içinden hava akar.
- Cihaz kullanılana kadar 4 ° C'de muhafaza edildiği PBS tamponu ile yıkayın ve sulu tabaka boyunca% 70 etanol ile sızıntısız cihazları sterilize edin.
3. Microdispenser Kur
- Oksijen karıştırma ve teslimat kurulum oluşturmak için 2 microdispensers, 5 V ve 20 V DC güç kaynakları ve dijital I / O kartını alın.
- Dahil sürücü birimlerine microdispensers 'kumanda kablolarını bağlayın.
- Labview kontrollere karşılık gelen limanlarında dijital I / O kartı için sürücüleri bağlayın.
- Sürücü uni kişileri karşılık gelen 5 V ve 20 V güç kaynağı bağlayınts.
- Gaz kontrolü (Ek) için Labview kodları çalıştırmak için bir dizüstü bilgisayar için dijital I / O bağlayın.
- Ise başka bir basınçlı hava için, her ikisi de 5 ile% CO2 nitrojene bir microdispenser bağlayın. 2 psi hem gazlar ayarlayın. Önce mikroakışkan cihazına giren bir T-kavşak dağıtıcılar "çıkışları bağla.
- Bir sızıntı test cihazı kullanılarak, (ekipman listesi ve temsili sonuçları görmek) bir fiber optik oksijen sensörü ile suda çözünmüş oksijen ölçüm yaparken, 5-21% oksijen arasındaki microdispensers bisiklet oksijen modülasyon geçici yanıt karakterize.
4. Mikroskopi at Kurma
- Ters mikroskop ısıtılmış sahneye cihazı monte.
- Cihaza% 0 ve% 21 O 2 gazları bağlayın ve oksijen sensörü ile kalibre.
- Bir fraksiyon toplayıcı için glikoz Mikroakiskan çıkış portunu.
- Krebs Ringer bikarbonat hazırlayıntamponu (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 4.7 mM KCI, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1 mM CaCl2 · 2H 2 O, 1.2 mM MgSO 4 · 7H 2 O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40 , 2 mM bazal glükoz, ve% 5 FBS.
- Konik tüp, 37 ° C su banyosu içinde, 50 ml banyo sırasıyla 2 mM ve 14 mM glükoz ihtiva eden iki tampon çözeltiler hazırlayın.
- Boru halinde 250 ul / dk 'da tampon çekmek için bir peristaltik pompa bağlayın. Mikroakışkan cihaz girmeden önce bir 37 ° C ocak üzerinde boru akış.
- Adacıklar leke için, sırasıyla, son boya 5 uM yoğunluklarda ve 2,5 uM ulaşmak için KRB, 2 ml% 100 etanol içinde DMSO ve Rh123 olarak Fura-02:00 ekleyin.
- 10 ul bir pipet ile adacıklar almak ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe boyalar
- Glikoz mikrokanal giriş yoluyla cihaz içine yaklaşık 20 adacıklar yerleştirin. Geri t içine çıkışından tampon priming ile odasına adacıklar Doğrudandiye girişine.
- Fazla boya aşındırmak için 10 dakika tampon içinde adacıklar serpmek.
5. Eşzamanlı Oksijen ve Glikoz Uyarım Koşu
- 14 mM uyarım ardından 15 dakika KRB2 tarafından kurulan taban arasında 5 dakika ile bir şeker uyarım darbe teslim ardından KRB2 15 dakika boyunca yıkanır.
- Rh123 için Fura-2 ve 534 emisyon Record 340/380 nm eksitasyon dalga boyu.
- Her deneyde önce normal bir darbe (14 mM Normoksik) ölçümlerini yapmak.
- Oksijen modülasyonu (hipoksi / aralıklı hipoksi) için, sadece konvektif rahatsızlıkları en aza indirmek için, uyarılma ve yıkama adımları ve diğer adımların hiçbir akış sırasında tampon akışı uygulanır.
- ELISA insülin tayini için 1 dakika aralıklarla glukoz prizden atıklarının toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu adacık hipoksi tekniğe Central dakika ölçekli geçici ile aynı mikroakışkan odası içinde, sulu ve gaz fazı stimülasyon modüle etme yeteneğidir. Şekil 1 a) temsil eden bir sonucu olan doku adacığı bölmesi içinde ölçülen çift uyarılması ve b) hızlı bir modülasyon. Odacık içine fluoresein getirilmesi ile gösterilen sulu modülasyonu, karıştırma 3-4 dakika içinde bir denge elde edilir. Ayrıca, oksijen 2 dakika gibi kısa sürelerle ile oksijen bisiklet sağlayan, hızlı, geçici ile 5-21% istifa edilebilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi farklı kalınlıkları bisiklet ve sıklıkları da elde edilebilir.
Bu bisiklet adacıkları Aralıklı hipoksi oluşturmak uygulandığında düzenli, Normoksik nabız, Şekil 3a ile karşılaştırıldığında, bir, hipoksi karşı adacıklar önkoşullanma yararları gözlemleyebilirsiniz. Hücre içi kalsiyum akı için sinyal mechanisinsülin salgılanması m-olan gerçek zamanlı olarak izlenir, hipoksi ve IH etkisi geçici kalsiyum, Şekil 3b hedef üstüne atma ve titreşim sönümleme de gözlemlenebilir. Bu K ATP kanalları önkoşullama sürecini kontrol etmek için önerilen ile ilgili önemli parametrelerdir. Ayrıca, metabolizma ve hipoksi mitokondrinin bağlantı Rh123 kullanılarak mitokondriyal potansiyelleri izleme tarafından görüntülenmiştir olabilir. Son olarak, mikroakışkan atık toplama toplam insülin miktarının ELISA testi verir. Kalsiyum, mitokondriyal potansiyel ve insülin hipoksik geçici, Şekil 3c altında glikoz-insülin yanıtı bir multimodal görünümünü inşa etmeye başlayacak üç parametre vardır.
Şekil 1. Aynı anda oksijen ve glükoz uyaranlar. (a) Statik kontrolleri. Üst: 250 ul FITC molekülün odası giriş / dk karıştırma süresi 3 dakika içinde dengeler. Bottom: Gaz kontrolü stabil 5 teslimatı, 10, ve membran% 21 oksijen sağlar (b) Geçici kontrolü.. (Çözünmüş) gaz teslimat (dağınık) at ve yüzey mikro oyuk iki ölçülen 5-21% arasında oksijen binme 1 dakikalık bir süre ile mümkündür.
Şekil 2. Mikroakışkan aygıt başka oksijen profilleri üretebilir. Farklı IH profilleri gaz bilgisayar mikropüskürtücü ikinci karıştırma ile derinliği (% 5-10-15) değişen hem de bisiklet dönemler (3-6-1 dakika) ile elde edilebilir .
3 "fo: İçerik-width =" 5.5 inç "fo: src =" / files/ftp_upload/50616/50616fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50616/50616fig3.jpg "/>
Şekil 3,. IH adacık hipoksiye yanıtları iyileştirilmiştir ön şartlandırılmış. IH kullanılarak önkoşullama (a) Örnek özeti, normoksik sinyali (bir önceki deneyde aynı adacık batch) ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş hipoksik tepkisini gösteren,% 5 ile 30 dakika maruz eşittir. Daha sonra hipoksi 10 dakika daha devam önkoşullanma korur. Ortalama normoksik, hipoksik ve hipoksik ön şartlandırılmış cevapların (b) Kaplanmış karşılaştırması. Ankastre salınım davranışları geri kazanımı ile temsil izleri farklı oksijen ve kimyasal koşullar için (c) Multimodal Fura-2, insülin, ve Rh123 tepkileri:.% 21 oksijen,% 5 oksijen, ön hazırlık (P +% 5), diazoksit (D + % 5), ve 5HD (5HD + P +% 5). 5HD açılması ve blocki tarafından önkoşullama yararları olumsuzlar ise Diazoksidin önkoşullama ile tutarlıdırsırasıyla ng KATP kanal. , * P <0.05, ** p <0.01, *** P 5HD genel genel 5 ve% 21,% 5,% 5,% 5 D% P +% 5: t-testi iki kuyruklu p <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu adacık hipoksi tekniğin entegre çoklu yöntemler mevcut birkaç puan sorun giderme için burayı kaydetti. İlk izole adacıklar aşağılamak nedeniyle asiner hücrelerden sindirim enzimleri kültür çözülmeye devam ediyor. Doku adacığı izolasyonu sonra 1-2 gün için deneyler standartlaştırılması tutarlı sonuçlar elde etmek, böylece önemlidir. İkincisi, sulu akış laminer akışı ve difüzyon arasındaki sınırda konvektif boşluğunu önlemek için hipoksi ve aralıklı hipoksi sırasında durduruldu. Bu adacık önkoşullanmanın süresini sınırlamak gibi görünüyor. Hala membran hızlı gaz modülasyonu verirken sulu kanalda bir gaz değişimi gelecekteki entegrasyonu bu küçük boşluk ortadan kaldırabilir. Adacıklar yüklerken Üçüncüsü, sulu boru hava kabarcıklarını yakalama önlemek için (çıkış sonra girişine) ters dikkatle tekrar verilmelidir. Son olarak, gelecek cihaz dağılımının yardımcı olmak için, bir körükledi-out mikroakışkan dağıtıcı ile artar olabiliravcı cepleri bir dizi ile desenli edilebilir altındaki, tüm odası üzerinde adacık küme te. Cep dizisine ek olarak bu mikroakışkan dağılımı yüksek verimlilik deneyler için adacık bir pozisyonel dizi oluşturmanıza yardımcı olacaktır.
Bundan önce mikroakışkan adacık hipoksi tekniği, en hızlı aralıklı hipoksi modülasyon yüksek basınçlı gaz akımı ile küçük özel hipoksik odaları kullanılarak 1-3 dakika döngüleri elde edilmiştir. Ancak, bu yalnızca tek adacık düzeyinde bütün hayvanlar olup kullanılabilir. (Solunum denge sonra) bütün hayvanların pankreas elde gerçek hipoksi seviyesinin belirsizlik yanı sıra gerçek zamanlı, iyi kontrol mikroçevrelerde glikoz insülin tepkisini incelemek için yetersizlik de vardır. Buna karşılık, hem sıvı hem de gaz uyarımlar eden Mikroakiskan in dakikalık zaman ölçekler için kontrol edilir. Bu modülasyon da fo mikroskop doğrudan monte edilirr multiparametrik izleme. Önce bizim tekniği, tekrarlanabilir ve iyi karakterize adacık önkoşul ulaşılabilir olmamıştır. Örneğin adacıkları gibi oksijene duyarlı ex vivo doku optimal olarak daha küçük hücre kültürü platform ve daha büyük bir oda aygıtı arasında sıkışıp onların microscaled boyutları (yani, 100 um çapında) olarak mikroakışkan platforma uygundur. Adacıklar ötesinde, bir dizi ex vivo doku-dahil olmak üzere kalp dokusu, beyin dilimleri ve embriyolar-Bu tekniği kullanılarak incelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Hibeler R01 DK091526 (JO), NSF 0.852.416 (DTE) Ulusal Enstitüleri, ve Chicago Diyabet Projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in | |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
