Summary

Einrichtung einer<em> In-vitro-</em> System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em> Candida glabrata</em> Menschen THP-1-Makrophagen

Published: December 10, 2013
doi:

Summary

Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren.

Abstract

Eine Zellkultur-Modellsystem, wenn ein enger Mimik von Host-Umweltbedingungen können als preiswerte, reproduzierbare und leicht manipulierbare Alternative zu Tiermodellsysteme für die Untersuchung von einem bestimmten Schritt der mikrobielle Erreger der Infektion dienen. Eine menschliche Monozyten-Zelllinie THP-1, welche bei Phorbolester-Behandlung wird in Makrophagen unterscheiden, wurde bereits früher verwendet, um die Virulenz Strategien vieler intrazelluläre Erreger wie Mycobacterium tuberculosis studieren. Hier ein Protokoll, ein in vitro Zellkulturmodell zu erlassen diskutieren wir System mit THP-1 Makrophagen, um die Wechselwirkung eines opportunistischen Pathogens menschlichen Hefe Candida glabrata mit Host phagozytischen Zellen abzugrenzen. Dieses Modellsystem ist einfach, schnell, offen für Hochdurchsatz-Mutante Bildschirme, und erfordert keine hoch entwickelten Geräten. Eine typische THP-1-Makrophagen-Infektionsversuch dauert ca. 24 Stunden mit einer zusätzlichen Stunde 24-48 wiederhergestellt intrazellulären ermöglichenHefe auf reichen Medium für koloniebildende Einheit-basierte Analyse Rentabilität wachsen. Wie andere in-vitro-Modellsysteme, ist eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes Schwierigkeiten bei Extrapolation der zu einer sehr komplexen Immunzellschaltkreis in den menschlichen Wirt vorhandenen erzielten Ergebnisse. Trotz dieser, ist jedoch die aktuelle Protokoll sehr nützlich, um die Strategien, die eine Pilzerreger verwenden kann, zu umgehen / entgegenzuwirken antimikrobielle Reaktion und zu überleben, anzupassen, und vermehren sich in den nährstoffarmen Umfeld von Wirtsimmunzellen aufzuklären.

Introduction

Candida-Spezies sind die führende Ursache von lebensbedrohlichen invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten ein. Candida glabrata, einer aufstrebenden nosokomiale Erreger, ist die zweite oder dritte am häufigsten isolierten Candida-Spezies aus Intensivstation Patienten, abhängig von der geographischen Lage 3.1. Phylogenetisch, C. glabrata, einem haploiden Hefezellen, enger mit den nicht pathogenen Modell Hefe Saccharomyces cerevisiae als pathogene Candida spp. einschließlich C. 4 albicans. In Übereinstimmung damit, C. glabrata fehlen einige Schlüsselpilz Virulenz inklusive Gegen, sekretierten proteolytischen Aktivität und morphologische Plastizität 4-5.

Obwohl C. glabrata bildet keine Hyphen, es zu überleben und zu replizieren in murinen und humanen Makrophagen 6-8 was darauf hindeutet, dass es einzigartig Pathogenese-Mechanismen entwickelt wurden, können. Nur begrenzte Informationen über die Strategien zur Verfügung, die C. glabrata beschäftigt, um zu überleben nährstoffarmen intrazellulären Makrophagen Umwelt und oxidative und nicht-oxidative entgegenzuwirken Wirtsreaktionen von Immunzellen 5 montiert. Ein entsprechendes Modell Makrophagen-System ist eine Voraussetzung, um die Wechselwirkung von C abgrenzen glabrata mit Wirts Phagozyten über funktionelle Genom-und Proteom-Ansätzen. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) des humanen und murinen Ursprungs sind, sind früher verwendet worden, um die Wechselwirkung von C zu studieren glabrata mit Wirtsimmunzellen 7,9. , Schwierigkeiten bei der Beschaffung von PBMCs und BMDMs, ihre begrenzte Lebensdauer und intrinsische Unterschiede zwischen den verschiedenen Säugetier Spender beschränken jedoch die Verwendung dieser Zellen als vielseitige Modellsysteme.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung eines in vitro-System, das intracellul studierenar Verhalten von C. glabrata Zellen in Makrophagen aus menschlichen Monozyten-Zelllinie THP-1 abgeleitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls war es, eine einfache, kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Zellkultur-Modellsystem, die leicht manipuliert werden kann, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pilz-Pathogen-Interaktion untersuchen zu erlassen.

THP-1-Zellen wurden bereits verwendet, um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze 10-12 entziffern. Monozytären THP-1-Zellen sind leicht zu pflegen und kann unterschieden werden, bei Phorbolester-Behandlung, um Makrophagen, Monozyten-Makrophagen der menschlichen Mimik und Express entsprechenden Makrophagen-Marker 13. Die wichtigsten Vorteile der THP-1-Makrophagen-Modellsystem sind die einfache Bedienbarkeit und das Fehlen von hoch entwickelten Geräten Anforderung.

Die hier vorgestellte Protokoll ist leicht anpassbar, um die Interaktion von anderen menschlichen Pilzerreger mit hos studierenT-Immunzellen. Das derzeitige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Virulenzfaktoren für die Krankheitserreger von Interesse mit hohem Durchsatz nach Mutanten zu identifizieren. Diese Proof-of-concept wurde durch die erfolgreiche Anwendung von THP-1-Kulturmodellsystem, um einen Satz von 56 Genen, die für das Überleben von C. glabrata in humanen Makrophagen 8 erforderlich sind beispielhaft zu identifizieren.

Protocol

Es wird empfohlen, C auszuführen glabrata Infektionsversuche im Labor mit Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2). Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monoschicht. Vorbereitung von C. glabrata Zellsuspension. Infektion von THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata-Zellen. Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über koloniebildende Einheit-Assay. Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning…

Representative Results

Infektion Analysen von PMA-behandelten THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata Wildtyp (wt)-Zellen ergab, dass Gew. Zellen durch Makrophagen mit einer Rate von 55-65% nach 2 h Koinkubation phagozytiert. Weitere, C. glabrata Zellen konnten Tötung von THP-1-Makrophagen wider und unterzog sich einer moderaten 5 – bis 7-fachen Anstieg der KBE nach 24 h Kokultur mit THP-1-Makrophagen 8. Intrazelluläre Replikation von Wildtyp-Zellen, transformiert mit GFP-exprimierenden Plasmid,…

Discussion

Angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von opportunistischen Pilzinfektionen. Makrophagen tragen zur Verteidigung durch die Einnahme und Zerstörung der Pilzerreger Antimykotika. Somit wird Aufklärung von Faktoren, die für das Überleben und / oder Bekämpfung der antimikrobiellen Funktionen erforderlich sind Makrophagen unser Verständnis von Pilz Virulenz Strategien voraus. In diesem Zusammenhang haben wir ein in-vitro-Zellkultur-Modellsystem unter Verwendung von Makrophagen aus…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Innovative Junge Biotechnologist Auszeichnung BT/BI/12/040/2005 und BT/PR13289/BRB/10/745/2009 Zuschuss von Department für Biotechnologie, Regierung von Indien und Kernfonds, des Zentrums für DNA-Fingerprinting and Diagnostics unterstützt werden, Hyderabad. MNR und GB sind die Empfänger von Junior und Senior Research Fellowships des Rates für Wissenschaftliche und Industrielle Forschung auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University. SB ist der Empfänger von Junior und Senior Research Fellowship des Department für Biotechnologie auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University.

Materials

THP-1 American Type Culture Collection TIB 202 Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640 Hyclone SH30096.01 For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P 8139 Caution: Hazardous
YPD  BD-Difco 242710 For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS) Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)  Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium Vector Labs H-1200 For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP JONAKI-BARC LCP-102 For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes Corning 430167 To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate Corning 3527 To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide BD Falcon REF354104 To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer Rohem India For enumeration of cells
Table top microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 18 For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge Remi R-8C For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer Amersham Biosciences Ultraspec 10 To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator Labtech Refrigerated To grow C. glabrata cells
Shaker incubator New Brunswick Innova 43 To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator Thermo Electron Corporation Forma series 2 To culture THP-1 cells
Confocal microscope Carl Ziess Ziess LSM 510 meta  To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope Olympus CKX 41 To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine BioRad  DNA Engine To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven Labnet Problot 12S For hybridization 
PhosphorImager Fujifilm FLA-9000 For scanning hybridized membranes
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit Alphainnontech Alphaimager To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels

References

  1. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
  2. Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
  3. Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
  4. Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
  5. Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
  6. Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
  7. Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
  8. Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
  9. Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
  10. Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
  11. Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
  12. Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
  13. Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
  14. Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
  15. Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).

Play Video

Cite This Article
Rai, M. N., Borah, S., Bairwa, G., Balusu, S., Gorityala, N., Kaur, R. Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages. J. Vis. Exp. (82), e50625, doi:10.3791/50625 (2013).

View Video