Summary
Transgene og knockout-musemodeller af neurologiske sygdomme er anvendelige til at studere rollen af gener i normale og unormale neurofysiologi. Denne artikel beskriver metoder, der kan anvendes til at studere langsigtet potensering, en cellulær mekanisme, som kan være afgørende for indlæring og hukommelse i transgene og knockout frit opfører musemodeller for neuropatologi.
Abstract
Undersøgelser af langvarig potensering af synaptisk effektivitet, en aktivitet, der er afhængige synaptiske fænomen har egenskaber, der gør det attraktivt som en potentiel cellulære mekanisme underliggende læring og lagring af oplysninger, har længe været brugt til at belyse fysiologi af forskellige neuronale kredsløb i hippocampus, amygdala og andre limbiske og corticale strukturer. Med dette i tankerne, transgene musemodeller for neurologiske sygdomme udgør nyttige platforme for at gennemføre langsigtet (LTP) undersøgelser til at udvikle en større forståelse af den rolle, gener i normal og unormal synaptisk kommunikation i neuronale netværk, der er involveret i læring, følelser og information forarbejdning. Denne artikel beskriver metoder til pålidelig inducere LTP i frit opfører musen. Disse metoder kan anvendes i studier af transgene og knockout frit opfører musemodeller af neurodegenerative sygdomme.
Introduction
Udviklingen af teknologien til at manipulere gener har produceret transgene og knockout musemodeller for næsten alle neurodegenerative og neurologiske sygdomme. Dette har nødvendiggjort oversættelse af elektrofysiologiske forskning teknikker tidligere blev anvendt i større gnavere til mus dyremodel. En sådan neurofysiologiske undersøgelse teknik er brugen langsigtet potensering (LTP) for at teste effektiviteten af synaptiske forbindelser inden neuronale netværk, der er involveret i forskellige neuropatologiske lidelser. Denne protokol beskriver teknikker til pålidelig elektrofysiologisk undersøgelse af LTP i frit opfører mus. Fordelen ved denne protokol over andre, er, at den er enkel og let at implementere, og det er også temmelig billigere, da det ikke kræver hverken anvendelsen af dyre computerstyrede Microdrive systemer eller felteffekttransistor headstages, samt i vores viden, er den første video-protokollen af kroniske elektrofysiologiske optagelser to studere LTP i frit opfører mus. Til dette formål, vi beskriver i denne artikel enkle metoder til at studere langsigtede potensering i frit opfører mus. Disse metoder kan let oversættes til transgene og knockout musemodeller af neuropatologiske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er egnet til mus af 3 og 18 måneders alderen, og omtrentlig legemsvægt på 30-50 g). Mus kan fås fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alle kirurgiske og forsøgsprotokoller blev godkendt af Trinity College Animal Care og brug Udvalg og var i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1.. Animal Forberedelse og kirurgiske procedurer
- Forbered anæstesi cocktail indeholdende ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) og acepromazin (0,5 mg / ml). Injicer 1 ml / kg legemsvægt i den nedre højre kvadrant af maven suppleret med 0,2 ml / kg injektioner hver 45 min derefter at opretholde en stabil dybde af anæstesi ved hjælp af tilbagetrækning pedal refleks.
- Forbered bedøvede mus til kirurgi ved barbering pelsen på sit kranium med en elektrisk barbermaskine. Barberede område bør omfatte midten af øjnene til midten af ørerne. Sørg for ikke at barbere whiskers da de er en del af musen tønde sanseorgan.
- Brug vatpinde til at anvende isopropylalkohol efterfulgt af Betadine til det barberede område på hovedet. Så også bruge vatpinde, anvende en lille mængde af mineralsk olie på øjnene for at forhindre øjet fra tørring.
- Brug spædbarn rotte øre manchetter i stedet for regelmæssige øre barer at montere dyrets hoved på stereotaktisk ramme apparatet. For at gøre dette, skal du først montere venstre øre på venstre øre manchet. Derefter forsigtigt lette højre øre på den højre manchet ved forsigtigt at støtte dyrets hoved med den ene hånd og fremme øret manchetten med den anden hånd. Placér en varmepude under dyrets krop og sæt den til 86 ° F til at opretholde kroppens temperatur.
- Så tjek for bilateral stivhed ved at forsøge at bevæge hovedet fra side til side. Dyret er korrekt monteret på stereotaktisk ramme, når hovedet er stiv og ikke kan bevæges fra side til side, men kan let svinge op og ned.
- Forsigtigt hvilemusens snude på næsen / tand bar montage at sikre, at fortænderne hviler forsigtigt, men sikkert inden for tand blænde af næsen / tand bar.
- Ved hjælp af en steril skalpel en midtlinjeincision fra midten af øjne til midten af ørerne. Sørg for, skalpel blive afholdt på en 45 ° vinkel og anvende nok pres til at skære igennem den underliggende fascie, men ikke gennem kraniet, da der vil forårsage overdreven blødning.
- Brug vatpinde til at adskille fascia og eksponere kraniet. Fire Skull bregma og lambda skal være klart synlig (figur 1A). Sørg for, at dyret er i kraniet flad position ved at justere næse / tand bar sådan at bregma og lambda landemærker er på samme den dorsoventral (DV) position (+ 0,1 mm).
- Påfør en lille mængde sterilt saltvand til det udsatte område og bruge vatpinde til forsigtigt at rense kraniet. Så vent 2-3 min for kraniet til helt lufttørrefør du fortsætter.
- Monter en nål til venstre stereotaktisk armen for at måle DV stilling bregma og lambda. DV positionering af disse to seværdigheder skal være inden for 0,1 mm fra hinanden. Hvis ikke, kan næsen bar af stereotaktisk ramme justeres op og ned for at opnå dette.
- Placer nålen på bregma at indspille sin anterior-posterior (AP), lateral (LAT), og dorsoventral (DV)-målinger. Vær sikker på, at nålen netop rører kraniet og ikke trænger det.
- Bruge en mus hjerne atlas, såsom "The Mouse Brain i stereotaktisk Koordinater" 1, til at bestemme koordinaterne for målstrukturerne: mediale perforante vejen (MPP) i kantede bundt og dentatgyrus (GD) i hippocampus, i forhold til lambda og bregma henholdsvis (se også tabel 1). Brug derefter en fin kuglepen eller blyant til at markere disse punkter på kraniet.
- Også markere to punkter på den kontralaterale side af kraniet. Disse punkter which vil tjene som jord (GND) og reference (REF) bør være omkring 3 mm fra midterlinien og placeret på langs i forhold til hinanden (figur 1A, også tabel 1).
- Fjern nålen markør fra venstre stereotaktisk arm og erstatte det med en elektrisk tandlægebor udstyret med en stereotaktisk mount. Placer boret over hver markerede punkt og lave små burr huller på ca 0,5 mm i diameter. Når boring, bruge et repetitivt up-and-down bevægelse og tjek ofte, om boret er trængt ind i kraniet for at blotlægge hjernen overflade.
- Forsigtigt, men fast køre en skrue elektrode (# 0-80 1/8 i rustfrit stål maskinskruer, slidsede fillister hoved) i hver af de kontralaterale huller (GND og REF), således at de kun lige rører den kortikale overflade uden at trænge det (figur 1A ). Disse to skrue elektroder tjene som jorden og reference.
- Mount stimulerende og optagelse elektroder i elektrode holdere på venstre og højre stereotaxisk arme, hhv.
- Tilslut stimulerende elektrode terminaler til en elektrofysiologiske stimulator med nuværende isolation og registreringselektroden terminal til en elektrofysiologiske differensforstærker (gevinst = 1.000 båndpasfilteret = 1 Hz-3 kHz) og derefter til et digitalt oscilloskop til visuel inspektion af fremkaldte reaktioner. Også forbinde GND og REF elektrode terminaler til differential forstærker.
- Blidt og langsomt lavere både stimulerende og registrering elektroder i trin 0,5 mm, mens visuelt overvåger den fremkaldte reaktion på en stimulus chok 600-800 uA. Fortsæt med at sænke hver elektrode, indtil de når deres respektive mål DV position og der ses en stereotyp signal på oscilloskopet (Figur 1B).
- Bagefter bruge dental akryl cement til at lave en hætte til at holde elektrodeender på plads, og enhver dental cement, der rører huden skal tørresstraks. Når dentalcement er fuldstændig hærdet overføre dyret fra stereotaktisk ramme til en ren gnaver bur. Brug en varmelampe eller pude til at opretholde kernetemperatur.
- Overvåg dyret hver time, indtil det genvinder bevidstheden. En injektion af flunixin kan administreres som en smertestillende.
2. LTP Induktion
- Lad dyret 5-7 dage at komme fra kirurgi. Placer dyret i optagelsen miljø bestående af et Faradays bur (122 cm x 43 cm x 43 cm) udstyret med lyddæmpende materiale og en 5-kanals roterende kommutator forbinder elektroden fører til setup stimulerende / optagelse.
- Lad dyret akklimatisere i 1-2 hr i optagelsen miljø, før tilslutning af elektroderne til stimulerende og måleinstrumenter (se trin 1.17).
- Sæt stimulator kontroller til output 400 uA og registrere amplituden af et gennemsnit på 10 fremkaldte reaktioner og sørg thpå mindst 10 sek gå mellem stimuli. Anvende den metode, der er vist i figur 1C at kvantificere fremkaldt reaktion. Gentag denne procedure for 600, 800, 1.000, 1.200, og 1.400 uA.
- Konstruere en input / output-kurve ved at afbilde den gennemsnitlige amplitude af fremkaldt reaktion versus stimulus intensitet. Fra dette plot bestemme stimulus intensitet, der svarer til 50% af den maksimale amplitude måles. Brug intensiteten på 50% i resten af eksperimentet.
- Derefter bruger 50% stimulus intensitet, få en baseline ved at optage den gennemsnitlige amplitude af 5 fremkaldte reaktioner hvert minut i 15 min. Igen sørg for, at mindst 10 sek gå mellem stimuli.
- Efterfølgende levere tetanisk stimulation bestående af 10 byger af 10 afgivne pulser ved 400 Hz med en burst sats på 5 Hz til den mediale perforante vej. Overvåg dyret nøje for tegn på beslaglæggelse, herunder våd hund ryster. Hvis dyret har en beslaglæggelse af experiment bør afsluttes, og alle data fra dette dyr bør udelukkes fra undersøgelsens resultater.
- Derefter fortsætte med at indspille den gennemsnitlige amplitude af 5 fremkaldte reaktioner hvert minut i 30 min posttetanization. Efter at sammenligne denne amplitude til baseline amplitude opnået i trin 2.5 ved at beregne den procentvise ændring fra baseline (figur 2).
- Efter afslutningen af forsøgene, er dyret aflivet ved hjælp af inhalation af isofluran-en metode, der er i overensstemmelse med retningslinjerne om eutanasi af American Veterinary Medical Association.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 viser koordinaterne til GD og MPP som anvendes i denne protokol Figur 1A viser markeringerne for målet strukturer på kraniet.. Også vist er placering af jorden og reference elektroder 1B illustrerer repræsentant fremkaldt reaktion spor både præ- og posttetanization i det samme dyr. Bemærk, at posttetanization fremkaldt reaktion er større end pretetanization reaktion, som er vejledende for LTP induktion 2. Figur 1C illustrerer den anvendte metode til at kvantificere responsamplituden. Figur 2 viser faktisk procentvis ændring i responsamplituden over et tidsforløb, der spænder over både præ-og posttetanization perioder. Det skal bemærkes, at peak LTP værdier oversteg 100%. Disse resultater af forbedret responsamplituden efter tetanization viser, at denne protokol er vellykket, og derfor pålidelig for at studere LTPi frit opfører musemodel.
Tabel 1.. Koordinater for target strukturer. Anterior-posterior (AP) koordinater for dentatgyrus (DG) og REF er givet i forhold til bregma mens dem, for mediale perforante sti (MPP) og GND er i forhold til Lambda. Alle DV koordinater i forhold til den kortikale overflade under dura.
Figur 1.. Elektrode placering og repræsentative spor af fremkaldt reaktion. A) Skematisk illustration af den relative placering af elektroder på musen skull. B) Typiske spor af fremkaldt reaktion både præ-og posttetanization. C) algoritme bruges til at kvantificere amplituden af den fremkaldte reaktion.
Figur 2.. LTP i mediale perforante sti-dentatgyrus synapser. Repræsentant resultat af LTP induktion i MPP-DG synapse af et frit opfører mus. Bemærk posttetanic stimulering forbedring af fremkaldt reaktion amplitude indikerer LTP-induktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, har vi vist en pålidelig og enkel metode til at studere LTP i GD i frit opfører mus. Mens mange undersøgelser af LTP i vågne rotter er blevet udført 3,4, har meget få er udført i vågne mus primært på grund af den tekniske kompleksitet forbundet med den begrænsede kranie fast ejendom i mus, og vægten af elektrode headstages i forhold til den gennemsnitlige vægt af mus 5.. De få undersøgelser, der har påvist LTP i GD i frit opfører mus udnyttes enten Microdrive elektrode systemer eller vejkryds felteffekttransistor (JFET) forforstærkere integreret i hovedtrin som nødvendigvis føjer til elektroden nyttelast byrde for dyret 6-10. Betydningen af denne protokol er, at det er en forbedring i forhold til eksisterende metoder til at inducere LTP i GD i frit opfører mus, da det undgår brugen af Microdrive elektrodesystemer eller et hovedtrin JFET er.
Det er vigtigttigt at fremhæve de kritiske trin i denne protokol. Disse omfatter: 1) montering af musen hovedet i stereotaktisk ramme, således at den er bilateralt stive (dette trin kan være den mest vanskelige, da det kræver praksis og kendskab til teknikken), 2) en optimal placering af elektroder for at maksimere respons størrelsesorden kan forbedres ved at sikre, at bregma og lambda er i samme plan, som normalt kan opnås ved at justere stereotaktisk ramme tandstang, således at forskellen i dorsoventral positionering af bregma og lambda ikke er større end 0,1 mm, 3) under optagelsen fase eksperimentet, anbefales det, at dyrene have tid til at vænne til optagelsen miljøet, fordi den nyhed af optagelsen miljø, kan insinuere udsving i fremkaldt reaktion indsamlede data, 4) passende valg af elektroder vil forbedre signalkvaliteten og troskab: bipolære elektroder ( rustfrit stål Hypodermisk slange med 0,2 mm rustfrit stålwire insert med en spids adskillelse på 0,5 mm) foretrækkes til stimulering mens monopolære elektroder (epoxylite isoleret enkeltstrenget tungsten wire) anvendes til optagelse i nervevæv og 5) mus kan bedøves ved hjælp af en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) og acepromazin (0,5 mg / ml). Denne Anæstesiblandingen bør derefter administreres i en dosis på 1ml/kg som normalt er effektiv i omkring 20 min suppleret med 0,2 ml / kg hver 45 min for at opretholde en stabil dybde af anæstesi.
Der er et par begrænsninger i denne protokol, der bærer nævne. Denne protokol giver ikke nogen indsigt på ion-kanal mekanismer eller receptor proteinsyntese, der kan subserve LTP. Derfor sparsomme information vedrørende det faktiske antal neuroner i befolkningen, der optages. En anden begrænsning er, at eftersom fremkaldte reaktioner bliver opsamlet i vågne dyr er det vanskeligt at ascertain og dissekere ud effekten af faktorer såsom stress, håndtering eller forurening af det optagede signal ved falsk sensomotoriske aktivitet. Disse begrænsninger kan overvindes ved at sikre, fremkaldte reaktioner registreres kun, når dyret er inaktive, men vågen tilstand, også kendt som den stille vågne årvågenhed tilstand.
Ikke desto mindre, de teknikker, der er beskrevet i denne protokol giver den mest fysiologisk relevant platform for at undersøge hjernens elektriske aktivitet underliggende adfærd. Efter trinene i denne protokol, kan enhver hjernens struktur målrettes ved hjælp af de rigtige koordinater, som gives af et atlas over musehjernen 1.. Det er vigtigt at bemærke, at den voksne rotte stereotaktisk ramme kan anvendes i mus, forudsat at passende spædbarn rotte øre manchetter anvendes i stedet for de regelmæssige øre barer. Øret manchetter vil immobilisere hovedet uden at beskadige musens ører. Endelig kan de metoder, der præsenteres her være readily oversat til elektrofysiologiske undersøgelser i transgene og knockout musemodeller af en række neurologiske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende følgende: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah Mr. RJ Austin-LaFrance, og Ms Jessica Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
