Summary
Transgenici e knockout modelli murini di malattie neurologiche sono utili per studiare il ruolo dei geni in neurofisiologia normale e anormale. Questo articolo descrive metodologie che possono essere utilizzati per studiare potenziamento a lungo termine, un meccanismo cellulare che può essere alla base dell'apprendimento e della memoria, in transgenici e knockout banche comportarsi modelli murini di neuropatologia.
Abstract
Studi di potenziamento a lungo termine dell'efficacia sinaptica, un fenomeno sinaptica attività-dipendente avente proprietà che lo rendono interessante come potenziale meccanismo cellulare sottostante apprendimento e di memorizzazione, sono da tempo utilizzati per chiarire la fisiologia dei vari circuiti neuronali nell'ippocampo, amigdala , e altre strutture limbiche e corticali. Con questo in mente, modelli transgenici murini di malattie neurologiche rappresentano piattaforme utili per condurre potenziamento a lungo termine (LTP) studi per sviluppare una maggiore comprensione del ruolo dei geni nella comunicazione sinaptica normale e anormale nelle reti neuronali coinvolti nell'apprendimento, emozioni e informazioni trasformazione. Questo articolo descrive metodologie di affidabilità indurre LTP nel topo liberamente comportarsi. Queste metodologie possono essere utilizzate in studi di transgenici e knockout banche comportarsi modelli murini di malattie neurodegenerative.
Introduction
Lo sviluppo della tecnologia per manipolare i geni ha prodotto transgenici e knockout modelli murini di quasi tutte le malattie neurodegenerative e neurologiche. Ciò ha reso necessaria definizione di tecniche di ricerca elettrofisiologiche precedentemente utilizzati nelle più grandi specie di roditori al modello animale del mouse. Una di queste tecniche di indagine neurofisiologica è l'uso potenziamento a lungo termine (LTP) per testare l'efficacia di connessioni sinaptiche all'interno delle reti neuronali coinvolti in vari disturbi neuropatologici. Questo protocollo descrive le tecniche per affidabile indagine elettrofisiologica della LTP in banche comportarsi topi. Il vantaggio di questo protocollo sugli altri è che è semplice e facile da implementare, ma è anche piuttosto meno costoso in quanto non richiede né l'uso di costosi sistemi microdrive controllati dal computer nè effetto campo headstages transistor e, a nostra conoscenza, è il primo protocollo video di registrazioni elettrofisiologiche croniche to studiare LTP in banche comportarsi topi. A tal fine, descriviamo in questo articolo metodologie semplici per studiare potenziamento a lungo termine in topi banche si comportano. Queste metodologie possono essere facilmente tradotti in modelli murini transgenici e knockout di disturbi neuropatologici.
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Protocol
Questo protocollo è appropriato per i topi di 3 e 18 mesi di età e peso approssimativo corpo di 30-50 g). I topi possono essere ottenute presso il Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Tutti i protocolli chirurgici e sperimentali sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso commissione Trinity College ed erano in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione degli animali e procedure chirurgiche
- Preparare cocktail anestesia contenente ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) e acepromazina (0,5 mg / ml). Iniettare 1 ml / kg di peso corporeo nel quadrante inferiore destro dell'addome completata da iniezioni 0,2 ml / kg ogni 45 min successivamente mantenere una profondità stabile dell'anestesia usando l'ritiro riflesso pedale.
- Preparare topo anestetizzato per la chirurgia con la rasatura del pelo sul suo cranio con un rasoio elettrico. L'area rasata dovrebbe includere mezzo degli occhi per mezzo delle orecchie. Assicurarsi di non radersi la whiskers in quanto fanno parte del sistema sensoriale barile del mouse.
- Usare tamponi di cotone per applicare alcool isopropilico seguita da Betadine alla zona rasata sulla testa. Quindi, anche utilizzando tamponi di cotone, applicare una piccola quantità di olio minerale sugli occhi per evitare i bulbi oculari di asciugatura.
- Utilizzare infantili polsini ratto orecchio invece di barre orecchio regolari per montare la testa dell'animale sull'apparato telaio stereotassico. Per fare questo, prima montare l'orecchio sinistro sul polsino dell'orecchio sinistro. Poi facilitare delicatamente l'orecchio destro sulla cuffia destra appoggiando delicatamente la testa dell'animale con una mano e portare avanti il polsino dell'orecchio con l'altra mano. Quindi, posizionare una piastra elettrica sotto il corpo dell'animale e impostarlo a 86 ° F a mantenere la temperatura corporea.
- Quindi, verificare la presenza di rigidità bilaterale tentando di muovere la testa da un lato. L'animale è correttamente montato sul telaio stereotassico quando la testa è rigido e non può essere spostata lateralmente ma può facilmente ruotare su e giù.
- Riposare delicatamente ilmuso del mouse sulla barra del naso / dente assemblaggio assicurandosi che gli incisivi siano appoggiati delicatamente ma saldamente dentro l'apertura dente della barra naso / dente.
- Usando un bisturi sterile, praticare un'incisione mediana partire dalla metà degli occhi per mezzo delle orecchie. Assicurarsi che il bisturi sia essere tenuto ad un angolo di 45 ° e applicare una pressione sufficiente a tagliare la fascia sottostante, ma non attraverso il cranio come che causare sanguinamento eccessivo.
- Usare tamponi di cotone per separare la fascia ed esporre il cranio. Skull attrazioni bregma e lambda deve essere chiaramente visibile (Figura 1A). Assicurarsi che l'animale è in posizione cranio piatto regolando la barra naso / dente tale che bregma e lambda punti di riferimento sono allo stesso la dorsoventral posizione (DV) (+0,1 mm).
- Applicare una piccola quantità di soluzione fisiologica sterile per l'area esposta e utilizzare tamponi di cotone per pulire delicatamente il cranio. Poi aspettare 2-3 minuti per il cranio completamente aria seccaprima di procedere.
- Montare un ago sul braccio stereotassico sinistra per misurare la posizione di DV bregma e lambda. Il posizionamento DV di questi due punti di riferimento dovrebbe essere di 0,1 mm tra loro. In caso contrario, la barra naso del telaio stereotassico può essere regolata su e giù per raggiungere questo obiettivo.
- Posizionare l'ago sulla bregma per registrare il suo antero-posteriore (AP), laterale (LAT) e dorsoventrale (DV) misurazioni. Assicurarsi che l'ago tocchi appena il cranio e non penetra esso.
- Utilizzare un mouse atlante del cervello, come ad esempio "The Brain Mouse in Stereotassica Coordinate" 1, per determinare le coordinate per le strutture di destinazione: mediale via perforante (MPP) in bundle angolare e giro dentato (DG) dell'ippocampo, relativo alla lambda e bregma, rispettivamente (vedi anche tabella 1). Quindi, utilizzare una penna a punta fine o una matita per segnare questi punti sul cranio.
- Inoltre, segnare altri due punti sul lato controlaterale del cranio. Questi punti which servirà da terra (GND) e di riferimento (REF) dovrebbe essere circa 3 mm dalla linea mediana e posizionato longitudinalmente rispetto all'altro (Figura 1A, anche Tabella 1).
- Rimuovere il marcatore ago dal braccio stereotassico sinistra e sostituirlo con un trapano dentale elettrico dotato di un supporto stereotassico. Posizionare il trapano sopra ogni punto segnato e fare piccoli fori radica di circa 0,5 mm di diametro. Quando foratura, utilizzare un movimento su e giù ripetitivo e controllare frequentemente se il trapano è penetrato il cranio per esporre la superficie del cervello.
- Delicatamente ma con fermezza guidare un elettrodo vite (# 0-80 1/8 in macchina viti in acciaio inox, intaglio cilindrica testa) in ciascuno dei fori controlaterale (GND e REF) in modo tale che esse tocchino appena la superficie corticale senza penetrare (Figura 1A ). Questi due elettrodi a vite fungono da terra e di riferimento.
- Mount stimolanti e registrazione elettrodi in elettrode titolari sulla sinistra e braccio destro stereotassica, rispettivamente.
- Collegare i terminali degli elettrodi stimolanti ad uno stimolatore elettrofisiologico con attuale isolamento e il terminale di elettrodo di registrazione di un amplificatore differenziale elettrofisiologico (guadagno = 1.000, filtro passabanda = 1 Hz-3 kHz) e poi ad un oscilloscopio digitale per l'ispezione visiva di risposte evocate. Inoltre, collegare GND e terminali di elettrodo REF all'amplificatore differenziale.
- Delicatamente e lentamente inferiore stimolante ed elettrodi di registrazione con incrementi di 0,5 millimetri, mentre il monitoraggio visivamente la risposta evocata ad uno shock stimolo di 600-800 uA. Continuare ad abbassare ciascun elettrodo fino alla loro rispettiva posizione DV obiettivo e un segnale stereotipo si osserva l'oscilloscopio (Figura 1B).
- In seguito, utilizzare cemento acrilico dentale per fare un tappo per contenere i terminali degli elettrodi in luogo, qualsiasi cemento dentale che tocca la pelle deve essere cancellatoimmediatamente. Una volta che il cemento dentale è completamente guarito trasferire l'animale dal telaio stereotassico ad una gabbia roditori pulito. Utilizzare una lampada riscaldante o pad per mantenere la temperatura interna.
- Monitorare l'animale ogni ora fino a quando non riprende conoscenza. Un'iniezione di flunixin può essere somministrato come analgesico.
2. LTP induzione
- Permettere all'animale 5-7 giorni per recuperare da un intervento chirurgico. Posto l'animale in ambiente di registrazione costituito da una gabbia di Faraday (122 centimetri x 43 centimetri x 43 cm) dotato di materiale fonoassorbente e un commutatore rotante 5-canale che collega l'elettrodo porta alla configurazione stimolante / registrazione.
- Lasciare che l'animale si adatti per 1-2 ore in ambiente di registrazione prima di collegare gli elettrodi agli strumenti stimolanti e registrazione (fare riferimento al punto 1.17).
- Impostare i controlli stimolatore di uscita 400 uA e registrare l'ampiezza di una media del 10 evocato risposte assicurandosi thad almeno 10 sec trascorrere tra stimoli. Utilizzare il metodo illustrato nella Figura 1C per quantificare la risposta evocata. Ripetere questa procedura per 600, 800, 1.000, 1.200, e 1.400 uA.
- Costruire una curva di ingresso / uscita riportando l'ampiezza media della risposta evocata contro intensità dello stimolo. Da questo grafico determinare l'intensità dello stimolo che corrisponde al 50% dell'ampiezza massima misurata. Utilizzare l'intensità del 50% per il resto dell'esperimento.
- Poi, usando l'intensità dello stimolo 50%, ottenere una linea di base registrando l'ampiezza media di 5 risposte evocate ogni minuto per 15 min. Anche in questo caso assicurarsi che almeno 10 sec trascorrere tra stimoli.
- Successivamente consegnare la stimolazione tetanica composta da 10 raffiche di 10 impulsi erogati a 400 Hz con una velocità di raffica di 5 Hz per la via perforante mediale. Monitorare l'animale attentamente per i segni di sequestro, tra cui frullati di cane bagnato. Se l'animale ha un sequestro della speriment deve essere chiuso e tutti i dati da tale animale deve essere escluso dai risultati dello studio.
- Quindi, continuare a registrare l'ampiezza media di 5 risposte evocate ogni minuto per 30 minuti posttetanization. Dopo di che, confrontare questa ampiezza all'ampiezza basale ottenuto nella fase 2.5 calcolando la variazione percentuale rispetto al basale (Figura 2).
- A seguito della conclusione degli esperimenti, l'animale è eutanasia mediante inalazione di isoflurane, un metodo che è coerente con gli orientamenti in materia di eutanasia della American Veterinary Medical Association.
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Representative Results
La tabella 1 mostra le coordinate per la DG e mpp fini del presente protocollo figura 1A mostra i contrassegni per le strutture di destinazione sul cranio.. Mostrato anche sono la posizione degli elettrodi di terra e di riferimento Figura 1B illustra rappresentante risposta evocata traccia sia pre- e posttetanization nello stesso animale. Si noti che il posttetanization risposta evocata è maggiore della risposta pretetanization che è indicativo di LTP induzione 2. Figura 1C illustra il metodo utilizzato per quantificare l'ampiezza risposta. Infatti, la figura 2 mostra la variazione percentuale in ampiezza risposta su un percorso che attraversa il tempo entrambi i periodi pre-e tempo posttetanization. E 'da notare che i valori di picco LTP superato il 100%. Questi risultati di ampiezza di risposta potenziata seguente tetanization indicano che questo protocollo è successo e quindi affidabile per lo studio LTPnel modello di topo liberamente comportarsi.
Tabella 1. Coordinate per le strutture di destinazione. Antero-posteriore (AP) coordina per il giro dentato (DG) e REF sono dati relativi al bregma mentre quelli per mediale via perforante (MPP) e GND sono relative al Lambda. Tutte le coordinate DV sono relative alla superficie corticale sottostante dura.
Figura 1. Elettrodo posizione e tracce rappresentativi della risposta evocata. A) illustrazione schematica della posizione relativa degli elettrodi sul sku topoll. B) Tipici tracce della risposta evocata sia pre-e posttetanization. C) algoritmo utilizzato per quantificare l'ampiezza della risposta evocata.
Figura 2. LTP nel mediale perforante percorso-giro dentato sinapsi. Risultato Rappresentante di induzione di LTP in MPP-DG sinapsi di un mouse libero di comportarsi. Nota posttetanic valorizzazione stimolazione della risposta evocata ampiezza indicativo di LTP.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo dimostrato un metodo affidabile e semplice per lo studio LTP in DG nei topi banche si comportano. Mentre molti studi di LTP in ratti svegli sono stati effettuati 3,4, pochissimi sono stati condotti in topi svegli dovuto principalmente alla complessità tecnica rappresentata dalla limitata cranica immobiliare in topi e il peso di headstages elettrodi relativi al peso medio di 5 topi. I pochi studi che hanno dimostrato LTP in DG in banche comportarsi topi utilizzati sia sistemi di elettrodi microdrive o transistor a giunzione ad effetto di campo (JFET) preamplificatori integrati nello headstage che aggiunge necessariamente l'onere elettrodo payload per l'animale 6-10. Il significato del presente protocollo è che esso rappresenta un miglioramento rispetto ai metodi esistenti per indurre LTP nella DG liberamente comportarsi topi in quanto evita l'utilizzo di sistemi di elettrodi microdrive o un headstage JFET di.
E 'importante per evidenziare i passaggi critici di questo protocollo. Questi includono: 1) montaggio della testa del topo nel telaio stereotassico tale che è bilateralmente rigido (questo passaggio può essere la più difficile in quanto richiede pratica e familiarità con la tecnica), 2) posizionamento ottimale degli elettrodi per massimizzare la risposta grandezza può essere migliorata assicurando che bregma e lambda sono nello stesso piano che di solito può essere ottenuta regolando il telaio stereotassico dente bar tale che la differenza di posizionamento dorsoventral di bregma e lambda è non superiore a 0,1 mm; 3) durante la fase di registrazione di l'esperimento, si raccomanda che gli animali dispongano di tempo per abituare all'ambiente di registrazione perché la novità dell'ambiente di registrazione può insinuarsi fluttuazioni nei dati di risposta evocata raccolti; 4) selezione appropriata di elettrodi migliorerà la qualità del segnale e la fedeltà: elettrodi bipolari ( in acciaio inox tubo ipodermico in acciaio inox 0,2 millimetriInserto filo con una separazione punta di 0,5 mm) sono preferiti per stimolare mentre elettrodi monopolari (singolo filo filamento di tungsteno epoxylite isolati) sono utilizzati per la registrazione nel tessuto nervoso, e 5) può topi anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) e acepromazina (0,5 mg / ml). Questa miscela anestetica deve quindi essere somministrato ad un dosaggio di 1ml/kg che di solito è efficace in circa 20 min, completata da 0,2 ml / kg ogni 45 min mantenere una profondità stabile dell'anestesia.
Ci sono alcune limitazioni di questo protocollo che recano menzione. Questo protocollo non dà alcuna informazione su meccanismi di canali ionici o recettori sintesi proteica che possono subserve LTP. Pertanto scarse informazioni disponibili riguardanti il numero effettivo di neuroni nella popolazione in fase di registrazione. Un'altra limitazione è che poiché risposte evocate vengono raccolti in animali svegli è difficile ascertain e sezionare l'effetto di fattori quali lo stress, la manipolazione, o la contaminazione del segnale registrato dall'attività sensomotoria spurie. Questi limiti possono essere superati facendo in modo che evocava le risposte vengono registrate solo quando l'animale è stato inattivo ma vigile, altrimenti noto come il tranquillo stato di veglia vigilanza.
Tuttavia, le tecniche descritte in questo protocollo fornire la piattaforma più fisiologicamente rilevanti per lo studio dell'attività elettrica cerebrale comportamento sottostante. Seguendo la procedura descritta in questo protocollo, qualsiasi struttura del cervello può essere mirata in base alle coordinate corrette, come indicato da un atlante del cervello del mouse 1. È importante notare che il telaio stereotassico ratto adulto può essere utilizzato in topi purché polsini adatto ratto neonato auricolari sono utilizzati al posto delle barre orecchio regolare. I polsini orecchio si immobilizzare la testa senza danneggiare le orecchie del mouse. Infine, le metodologie qui presentate possono essere readily tradotto alle indagini elettrofisiologiche in transgenici e modelli di topo knockout di una serie di disturbi neurologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il seguente: Dr. Giuseppe Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, signor RJ Austin-LaFrance, e la signora Jessica Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
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