Summary
Nörolojik hastalıklar Transgenik ve nakavt fare modelleri, normal ve anormal Nörofizyolojideki genlerin rolü üzerinde çalışılması için yararlıdır. Bu makalede, Uzun süreli potansiyasyon, transgenik olarak, öğrenme ve hafıza altında yatan ve nöropatoloji fare modelleri davranıyor serbestçe nakavt olabilir hücresel mekanizma üzerinde çalışmak için de kullanılabilir yöntemleri açıklanmaktadır.
Abstract
Sinaptik etkinliğinin uzun süreli potansiyasyon çalışmaları, potansiyel bir temel hücresel mekanizma, öğrenme ve bilgi depolama gibi cazip hale özelliklere sahip olan bir aktivite bağımlı sinaptik fenomen, uzun hipokampus, amigdala çeşitli nöronal devrelerin fizyolojisini aydınlatmak için kullanılmıştır ve diğer limbik ve kortikal yapıları. Bu düşünceyle, nörolojik hastalıkların transgenik fare modelleri öğrenme, duygu ve bilgi alan nöron ağları normal ve anormal sinaptik iletişim genlerin rolü daha büyük bir anlayış geliştirmek için uzun vadeli kuvvetlenme (LTP) çalışmaları yürütmek için faydalı platformlarda temsil işleme. Bu makalede, güvenilir serbestçe davranmaya fare LTP uyarılması için yöntemleri anlatır. Bu metodolojiler transjenik çalışmalarında kullanılabilir ve serbestçe nörodejeneratif hastalıkların nakavt fare modelleri davranıyor.
Introduction
Genleri manipüle etmek teknolojisinin gelişmesi hemen hemen her nörodejeneratif ve nörolojik hastalıkların transgenik ve nakavt fare modellerini üretti. Bu, daha önce fare hayvan modelinde daha büyük kemirgen türlerinde kullanılan elektrofizyolojik araştırma tekniklerinin çevirisini gerektirmiştir. Böyle bir teknik, çeşitli araştırma nörofizyolojik nöropatolojik bozukluklar dahil sinir ağları içinde sinaptik bağlantıların etkinliğini test etmek için kullanımı, uzun süreli potansiyasyon (LTP) 'dir. Bu protokol özgürce fareler davranmak LTP güvenilir elektrofizyolojik inceleme teknikleri anlatılmaktadır. Diğerleri üzerinde bu protokolün avantajı, basit ve uygulanması kolay olduğunu, bunun pahalı bilgisayar kontrollü microdrive sistemleri ne de alan etkili transistör headstages kullanımını ne gerektirmez aynı zamanda çok daha az maliyetlidir ve bilgimize göre, kronik elektrofizyolojik kayıtlar t ilk video protokolo özgürce fareler davranıyor LTP çalışma. Bu amaçla, biz bu makalede özgürce davranmak farelerde uzun süreli potensiyalizasyon eğitim için basit yöntemler açıklanmaktadır. Bu metodolojileri kolayca nöropatolojik bozuklukların transgenik ve nakavt fare modelleri ile tercüme edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, 3 ve 18 yaş ve 30-50 g yaklaşık olarak vücut ağırlığının her ay) fareler için uygundur. Fareler The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 'den temin edilebilir. Tüm cerrahi ve deneysel protokolleri Trinity College Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım NIH Kılavuzu'na uygun idi.
1.. Hayvan Hazırlama ve Cerrahi Prosedürleri
- Ketamin (25 mg / ml), ksilazin (2.5 mg / ml) ve 'e asepromazin (0.5 mg / ml) içeren bir kokteylin anestezi hazırlayın. Daha sonra, geri çekme refleksi pedal kullanan olarak kararlı bir anestezi derinliği sağlamak için 0.2 ml / kg enjeksiyonlar her 45 dakikada ilave karnın sağ alt kadranda 1 ml / kg vücut ağırlığı enjekte edilir.
- Bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak kafatası üzerinde kürk traş edilerek ameliyat için anestezi fare hazırlayın. Tıraş alan kulak ortasına gözlerin orta içermelidir. Whiske tıraş için değil emin olunBu fare namlu duyu sisteminin bir parçası olarak rs.
- Kafasına traş bölgeye Betadine ardından izopropil alkol uygulamak için pamuklu çubuk kullanmayın. Daha sonra, aynı zamanda pamuklu kullanarak kurumasını gözler önlemek için göze bir mineral yağ, az miktarda uygulanır.
- Stereotaksik çerçeve cihazın üzerine hayvanın başını bağlamaya bebek sıçan kulak manşetleri yerine normal kulak çubuklarını kullanın. Bunu yapmak için, önce sol kulak Manşeti sol kulağını monte edin. Sonra hafifçe aşağı tek elle hayvanın kafasını destekleyen ve diğer elinizle kulak manşet ilerleyen sağ manşet üzerine sağ kulağını kolaylığı. Sonraki, hayvanın vücudunun altında bir ısıtma pedi yerleştirin ve vücut ısısını korumak için 86 ° F olarak ayarlayın.
- Ardından, yan baş tarafına taşımak deneyerek ikili sertliği kontrol edin. Baş katı ve yan yana taşınamaz ama kolayca aşağı yukarı mil etrafında ve zaman hayvan düzgün stereotaksik çerçeve üzerine monte edilir.
- Yavaşça dinlenmeburun / diş çubuğunda fare burun montaj ön dişler burun / diş bar diş açıklığı içinde yavaşça ama güvenli bir dinlenme emin yapma.
- Steril bir neşter kullanılarak, kulak ortasına gözlerin ortasından başlayarak bir orta hat kesi yapmak. Neşter 45 ° açıyla ve aşırı kanamaya neden olacak gibi kafatası ile altta yatan fasya üzerinden değil, kesmek için yeterli basınç uygulayın edilebilir olduğundan emin olun.
- Fasya ayırmak ve kafatası açığa çıkarmak için pamuklu çubuk kullanmayın. Kafatası bregma görülecek ve lambda (Şekil 1A) açıkça görünür olmalıdır. Hayvan Bregma ve lambda yerler aynı dorsoventral (DV) pozisyonu (+ 0.1 mm) olduğu gibi burun / diş çubuğunu ayarlayarak kafatası düz konumda olduğundan emin olun.
- Açıktaki alanına steril tuzlu su içinde bir miktar uygulanır ve nazikçe kafatası temizlemek için pamuklu kullanın. Sonra tamamen kuru hava kafatası için 2-3 dakika bekleyinDevam etmeden önce.
- Bregma ve lambda DV pozisyonunu ölçmek için sol steryotaksik koluna bir iğne monte edin. Bu iki yerlerinden DV konumlandırma birbirinden 0.1 mm arasında olmalıdır. Eğer değilse, stereotaksik çerçeve burun bar kadar ayarlanabilir ve bu aşağı elde etmek.
- Anterior-posterior (AP), yan (LAT) ve dorsoventral (DV) ölçümleri kaydetmek için bregmaya üzerinde iğne yerleştirin. İğne sadece kafatası dokunur ve nüfuz etmediğinden emin olun.
- Lambda göre hipokampus açısal paket ve kıvrımlarının (DG) medial delici yolu (MPP): Bu tür hedef yapılar için koordinatlarını belirlemek için, 1 "sterotaksik in Fare Beyin Koordinatlar" gibi bir fare beyin atlası, kullanın bregma ve sırasıyla (ayrıca bakınız Tablo 1). Sonra, kafatası üzerinde bu noktaları işaretlemek için ince uçlu bir kalem veya kurşun kalem kullanın.
- Ayrıca, kafatasının karşı tarafta iki noktalarını işaretleyin. Bu noktalar which şasi (GND) ve referans (Ref) olarak hizmet edecek olan orta hatta yaklaşık 3 mm olmalı ve (Şekil 1A, aynı zamanda Tablo 1) birbirlerine göre uzunlamasına yerleştirilmiş.
- Sol stereotaksik kolundan iğne işareti kaldırmak ve bir stereotaksik montaj ile donatılmış bir elektrik diş matkap ile değiştirin. Her işaretli nokta üzerinde matkap yerleştirin ve çapı yaklaşık 0.5 mm küçük çapak delik açmak. Sondaj, tekrarlayan yukarı ve aşağı hareket kullanmak ve matkap beyin yüzeyini açığa kafatası nüfuz olup olmadığını sık sık kontrol ettiğinizde.
- Yavaşça ama sıkıca onlar sadece penetre olmadan kortikal yüzeye temas edecek (Şekil 1A (# 0-80 paslanmaz çelik makine vida 1/8, baş Mercimek oluklu) kontralateral delikler (GND ve REF) her bir vida elektrot sürücü .) Bu iki vida elektrotlar zemin ve referans olarak hizmet vermektedir.
- Elektro Mount elektrotlarıde sol ve sağ steryotaksik kollarda sahipleri, sırasıyla.
- Daha sonra bir elektrofizyolojik diferansiyel amplifikatör (= 1.000 kazancı, bant geçiren filtre = 1 Hz-3 kHz) ile uyarılmış yanıtların görsel incelenmesi için bir sayısal osiloskop akım izolasyon ve kayıt elektrot terminali ile bir elektrofizyolojik stimülatörü uyarıcı elektrot terminali bağlayın. Ayrıca, diferansiyel amplifikatöre GND ve REF elektrot terminali bağlayın.
- Ve yavaşça görsel 600-800 uA bir uyarıcı şok uyarılmış yanıt izleme sırasında 0.5 mm artışlarla elektrotları hem düşük. Onlar kendi hedef DV konuma ulaşmak ve basmakalıp bir sinyal osiloskop (Şekil 1B) üzerinde gözlenen kadar her elektrot düşürmeye devam ediyor.
- Daha sonra, yerinde elektrot terminali tutmak için bir kap yapmak için diş akrilik çimento kullanmak, cilde temas herhangi bir diş çimento silinmelidirhemen. Diş çimento tamamen temiz bir kemirgen kafesine stereotaksik çerçeve hayvan aktarmak tedavi edildikten sonra. Çekirdek sıcaklığını korumak için bir ısıtma lambası veya ped kullanın.
- Bu bilinç kavuşur kadar hayvana her saat izleyin. Fluniksin bir enjeksiyon, bir analjezik olarak da uygulanabilir.
2. LTP İndüksiyon
- Hayvan 5-7 gün cerrahi kurtarmak için izin verin. Ses yalıtım malzemesi ile donatılmış bir Faraday kafesi (122 cm x 43 cm x 43 cm) ve elektrot uyarıcı / kayıt kurulum neden bağlanan bir 5 kanallı döner komütatör kapsayan kayıt ortamında hayvan yerleştirin.
- Hayvan (1,17 adıma bakın) uyarıcı ve kayıt araçlarına elektrotları bağlamadan önce kayıt ortamında 1-2 saat boyunca gelmesini bekleyin.
- Çıkış 400 iA stimülatörü kontrolleri ayarlayın ve emin inci hale uyarılmış 10 bir ortalama genliği kayıtuyaranlar arasında en az 10 saniye geçtikten at. Uyarılmış yanıtı ölçmek için Şekil 1C 'de gösterilen yöntem. 600, 800, 1000, 1200, ve 1400 uA için bu işlemi tekrarlayın.
- Uyaran yoğunluk karşı uyarılmış yanıtın ortalaması genlik çizilerek bir giriş / çıkış eğrisi oluşturun. Bu grafiğinden ölçülen azami amplitüd% 50'sine karşılık gelir uyaran yoğunluğunu belirler. Deneyin geri kalan kısmı için% 50 yoğunluk kullanın.
- Daha sonra,% 50 uyaran yoğunluk kullanılması, 5 ortalama genliği yanıtları 15 dakika boyunca her dakika uyarılmış kaydederek bir taban çizgisi elde edilir. Yine emin uyaranlar arasında en az 10 sn sona erdiği zaman emin olun.
- Daha sonra, medial delici yol 5 Hz'lik bir çekim hızı ile 400 Hz teslim 10 pals 10 patlamaları oluşan tetanik uyarımı sağlar. Islak köpek sallar gibi nöbet belirtileri için yakından hayvan izleyin. Hayvan nöbet experim varsaent sona erdirilecek ve bu hayvanın tüm veriler çalışma sonuçlarının dışında tutulmalıdır.
- Daha sonra, 5 ortalama genliği yanıtları 30 dakika boyunca her dakika posttetanization uyarılmış kayıt devam etmektedir. Bundan sonra, taban hattından yüzde değişim (Şekil 2) hesaplanmasıyla aşama 2.5 'de elde edilen genlik taban değerindedir, bu genlik karşılaştırın.
- Deneylerin sonucunda takiben, hayvan Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötenazi üzerine Yönergeleri ile tutarlıdır izofluran bir yöntem inhalasyon yoluyla ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Tablo 1. Bu protokolde kullanılan DG ve MPP için koordinatları Şekil 1A kafatası hedef yapıların işaretleri gösterir göstermektedir. Ayrıca zemin ve referans elektrotların konumu vardır gösterildiği Şekil 1B temsilcisi tepki izleri hem ön-uyarılmış göstermektedir ve aynı hayvanda posttetanization. Posttetanization yanıtı. Şekil 1C genlik yanıtı ölçmek için kullanılan bir yöntemi göstermektedir LTP indüksiyonu 2 göstergesidir pretetanization karşılık daha büyük olan uyarılmış unutmayın. Gerçekten de, Şekil 2, her ikisi de ön ve posttetanization zaman aralıkları kapsayan bir zaman boyunca tepki genliğinde yüzde değişikliği göstermektedir. Bu tepe LTP değerleri% 100 aştığı not edilmelidir. Artmış bir tepki genlik aşağıdaki tetanization Bu sonuçlar, bu protokol, LTP çalışmak için başarılı ve bu yüzden güvenilir olduğunu göstermektedirserbestçe davranmaya fare modelinde.
Medial delici yol (MPP) ve GND olan Lambda göre ise Tablo 1. Koordinatlar hedef yapılar için. Anterior-posterior (AP) kıvrımlarının (DG) ve REF koordinatları bregma göre verilir. Tüm DV koordinatlar dura altında kortikal yüzeye göredir.
Şekil 1.. Elektrot konumu ve uyarılmış yanıt temsilcisi izleri. Fare SKU'ya elektrotların göreli konumu A) şema halindeki resmidirll. B) uyarılmış tepkisinin tipik izleri öncesi ve posttetanization. C) algoritması uyarılmış yanıtının genliğini ölçmek için kullanılır.
Medial delici yol-dentat girus sinaps 2.. LTP Şekil. Serbestçe davranmak fare MPP-DG sinaps LTP indüksiyon Temsilcisi sonucu. LTP endüksiyonunun göstergesidir uyarılmış yanıt genliğinde posttetanic uyarılması geliştirme edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, biz özgürce davranıyor farelerde DG LTP eğitim için güvenilir ve basit bir yöntem ortaya koymuştur. Uyanık farelerde LTP çok sayıda çalışma yapılmıştır 3,4 edilmiş olsa da, çok az öncelikle farelerde sınırlı kafatası gayrimenkul ve ortalama ağırlığı göre elektrot headstages ağırlığı ile ortaya teknik karmaşıklık uyanık farelerde yürütülmüştür Fareler 5. Özgürce microdrive elektrot sistemleri veya jonksiyon alan etkili transistör mutlaka hayvanın 6-10 elektrot yükü yükü ekler headstage entegre (JFET) preamplisi ya kullanılan fareler davranıyor DG LTP göstermiştir birkaç çalışma. Mevcut protokolün önemi o microdrive elektrot sistemlerinin kullanımı ya da bir headstage JFET en önler gibi özgürce fareler davranıyor DG LTP başlatılması için mevcut yöntemlere göre bir iyileşmeyi temsil olmasıdır.
Bu önemli bir sorunBu protokolün kritik adımları vurgulamak için tant. Bunlar şunları kapsar: ikili katı olduğu şekilde stereotaksik çerçeveye fare başının 1) monte edilmesini (bu uygulama ve teknik ile benzerlik gerektirir, bu adım en zor olabilir), 2) elektrotlar uygun konumlandırma tepki büyüklüğünü en üst düzeye çıkarmak için can bregma ve lambda genellikle bregma ve lambda dorsoventral konumlandırma arasındaki fark büyük olmayan mm 'den 0.1 olduğu şekilde stereotaksik çerçeve diş çubuğunu ayarlayarak elde edilebilir, aynı düzlem içindedir sigortalanması ile geliştirilebilir, 3) kayıt aşamasında Deney, bu hayvanların kayıt ortamının yenilik toplanan uyarılmış yanıt verilerdeki dalgalanmaları ima çünkü zaman kayıt ortamına alışmakta izin tavsiye edilir; elektrotlar 4) uygun bir seçim sinyal kalitesini ve sadakat artıracak: bipolar elektrotlar ( 0.2 mm paslanmaz çelik, paslanmaz çelik deri altı boru0.5 mm 'lik bir itme ayırma) ile kablo uç kutuplu elektrotlar (epoxylite yalıtımlı tek iplikli tungsten tel) sinir dokusunda kayıt için kullanılır ise uyarıcı için özellikle tercih edilir, ve 5) fareler ketamin karışımı bir intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi edilebilir (25 mg / ml), ksilazin (2.5 mg / ml) ve asepromazin (0.5 mg / ml). Bu karışım daha sonra anestezi olarak kararlı bir anestezi derinliği sağlamak için 0.2 ml / kg dozunda 45 dakika ile takviye yaklaşık 20 dakika içinde genellikle etkilidir 1ml/kg bir dozajda olmalıdır.
Söz ayı bu protokolün birkaç sınırlamalar vardır. Bu protokol iyon kanal mekanizmalar veya LTP işine yaramak olabilir reseptör protein sentezi üzerinde herhangi bir fikir vermez. Bu nedenle yetersiz bilgi kaydedilen nüfusun nöronların gerçek sayıları ile ilgili mevcuttur. Diğer bir sınırlama, uyarılmış karşılıklar uyanık hayvanlarda toplanır edilmektedir çünkü ascert zor olmasıdırain ve stres, işleme, ya da sahte sensörimotor aktivitesi ile kaydedilen sinyal kirlilik gibi faktörlerin etkisini incelemek. Bu sınırlamalar bu tepkiler aksi sessiz uyanıkken teyakkuz devlet olarak bilinen, hayvan inaktif ama uyarı devlet yalnızca kaydedilir uyarılmış sağlanması ile aşılabilir.
Bununla birlikte, bu protokolü açıklanan teknikler beyin elektriksel aktivitesi yatan davranışı araştırmak için en önemli fizyolojik bir platform sağlar. Bu protokolde belirtilen adımların ardından, herhangi bir beyin yapısı fare beyninin 1 bir atlas tarafından verilen gibi uygun koordinatları kullanarak hedeflenebilir. Bu yetişkin sıçan stereotaksik çerçeve uygun bir bebek sıçan kulak manşetleri yerine normal kulak çubukları kullanılır koşuluyla farelerde kullanılabileceğini dikkat etmek önemlidir. Kulak manşet fare kulakları zarar vermeden kafasını hareketsiz olacaktır. Son olarak, burada sunulan metodolojiler readil olabiliry nörolojik bozuklukların bir konağın transgenik ve nakavt fare modellerinde elektrofizyolojik incelemelerin çevrilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Dr Joseph Bronzino, Dr Hamis Ebu-Hassaballah, Sayın RJ Austin-LaFrance ve Bayan Jessica Koranda: Yazarlar aşağıdaki kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
