Den zebrafisk, en liten tropisk fisk, har blivit en populär modell för att studera geners funktion under ryggradsdjur utveckling och sjukdom. Den temporala och spatiala uttrycket av målgener kan bestämmas genom<em> In situ</em> Hybridisering. Vår förbättrade protokoll tillåter detektion av låga rikliga transkript med låg icke-specifik bakgrundssignal.
Denna artikel fokuserar på hel-mount in situ hybridisering (WISH) av zebrafisk embryon. Önskan teknik underlättar bedömningen av genuttryck både vad gäller fördelning till vävnader och utvecklingsstadiet. Protokoll beskrivs för användning av önskan zebrafisk embryon med antisense RNA-prober märkta med digoxigenin. Prober genereras genom införlivande av digoxigenin-kopplade nukleotider genom transkription in vitro av genprodukter mallar som har klonats och linjäriserad. De chorions av embryon skördas vid definierade utvecklingsstadier avlägsnas före inkubering med specifika prober. Genom att följa ett tvättningsförfarande för att avlägsna överskott sond, är embryon inkuberas med anti-digoxigenin-antikropp konjugerad med alkaliskt fosfatas. Genom att använda ett kromogent substrat för alkaliskt fosfatas, kan specifikt genuttryck bedömas. Beroende på graden av genuttryck hela förfarandet kan slutföras inom 2-3 dagar.
Den zebrafisk (Danio rerio) har framträtt som ett kraftfullt djurmodell för studier av ryggradsdjur utveckling, sjukdom, beteende, och i-drug screening 1-3. Zebrafish embryon kan erhållas i stort antal från en enda passage. Befruktning och utveckling sker ex utero och optiskt klara embryona utvecklas snabbt. Kritiska utvecklingsmässiga händelser inträffar under de första 48 timmar efter befruktning (HPF). Detta inkluderar utseende orgel primordia och inledandet av cytodifferentiation. Knockdown eller över-uttryck av proteiner kan åstadkommas genom mikroinjektion av embryon med antisens morfolino (MO) oligonukleotider eller mRNA respektive vid en eller två cell stadium (0,75 hpf).
Önskan zebrafiskembryon underlättar studiet av tid och rum uttryck av specifika gener av intresse. Tillämpning av WISH tekniken efter mikroinjektion av embryon med mRNA eller MO till över-uttrESS eller knockdown specifika nivåer protein avslöjar differentiell reglering av andra gener.
Förändringar i genexpressionsmönster kan korreleras med fenotypiska förändringar och avslöja funktionen av målgener under tidig organogenesen. Eftersom prober kan framställas och lagras i förväg, kan den ISH teknik kunna användas för att avslöja genexpressionsmönster minst 20 gener i taget med sex-brunnar och skräddarsydda korgar.
Vi har utvecklat bättre metoder för att visualisera RNA med hög upplösning. In situ hybridiserings-försök utförs med hjälp av enkla skräddarsydda korgar med porösa bottnar (figur 1). Embryon bearbetas med RNase-fria lösningar i 6-brunnars plattor vid rumstemperatur under sterila betingelser.
Segregera embryon korgar är tillverkade av olika färgade Eppendorf-rör. Korgar med eller utan en kant används för enkel orientering och att identifiera de embryo…
The authors have nothing to disclose.
Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
NaOH | Fisher | SS255-1 | |
EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
Methanol | Fisher | A947-4 | |
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
NaCl | Fisher | S640-500 | |
Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
MgCl2 | Fisher | S25403 | |
Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |