De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden bepaald<em> In situ</em> Hybridisatie. Onze verbeterde protocol maakt de detectie van lage overvloedige transcripten met lage niet-specifieke achtergrondsignaal.
Dit artikel richt zich op de hele-mount in situ hybridisatie (WISH) van zebravis embryo's. De WISH-technologie vergemakkelijkt de beoordeling van genexpressie, zowel in termen van weefsel distributie en het ontwikkelingsstadium. Protocollen worden beschreven voor het gebruik van WISH van zebravis embryo's met behulp van antisense-RNA-probes gelabeld met digoxigenine. Probes worden gegenereerd door het opnemen van digoxigenine gekoppelde nucleotiden door in vitro transcriptie van genen sjablonen die gekloond zijn en gelineariseerd. De chorions van geoogst op bepaalde ontwikkelingsstadia embryo's worden vóór incubatie met specifieke probes verwijderd. Na een wassen procedure om de overmaat probe te verwijderen, worden embryo geïncubeerd met anti-digoxigenine antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase. Door toepassing van een chromogeen substraat voor alkalische fosfatase, kan genexpressie worden bepaald. Afhankelijk van het niveau van genexpressie de gehele procedure kan worden voltooid binnen 2-3 dagen.
De zebravis (Danio rerio) heeft zich ontpopt als een krachtige diermodel voor de studie van gewervelde ontwikkeling, ziekte, gedrag, en in-drug screening 1-3. Zebravis embryo's worden verkregen in grote aantallen uit een kruising. Bevruchting en ontwikkeling plaatsvindt ex utero en het optisch heldere embryo's ontwikkelen zich snel. Kritische ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen zich voordoen tijdens de eerste 48 uur na de bevruchting (HPF). Dit omvat het voorkomen van orgaan primordia en de start van cytodifferentiation. Knockdown of over-expressie van eiwitten kan worden bereikt door micro-injectie van embryo's met antisense morfolino (MO) oligonucleotiden of mRNA respectievelijk de cel stadium een of twee (0.75 HPF).
De wens van zebravis embryo's vergemakkelijkt de studie van de spatio-temporele expressie van specifieke genen van belang. Toepassing van de WISH techniek na micro-injectie van embryo's met mRNA of MO tot over-express of knockdown specifiek eiwit niveaus onthult differentiële regulatie van andere genen.
Veranderingen in genexpressie patronen kunnen worden gecorreleerd met fenotypische veranderingen en onthullen de functie van doelwitgenen tijdens vroege organogenese. Aangezien probes kunnen worden bereid en van tevoren, kan de ISH techniek toegepast op genexpressiepatronen onthullen ten minste 20 genen tegelijk met zes putjes en op maat gemaakte manden.
We hebben betere methoden ontwikkeld om RNA te visualiseren met een hoge resolutie. De in situ hybridisatie procedures worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige maat gemaakte manden met poreuze bodems (Figuur 1). Embryo's worden verwerkt met RNase-vrije oplossing in 6-well platen bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden.
Om scheiden embryo manden zijn gemaakt van verschillende gekleurde Eppendorf tubes. Manden met of zonder velg worden gebruikt voor …
The authors have nothing to disclose.
Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
NaOH | Fisher | SS255-1 | |
EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
Methanol | Fisher | A947-4 | |
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
NaCl | Fisher | S640-500 | |
Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
MgCl2 | Fisher | S25403 | |
Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |