Summary
De aangeboren immuunrespons beschermt organismen tegen pathogene infectie. Een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons, de fagocyt respiratory burst, genereert reactieve zuurstofradicalen die binnendringende micro-organismen te doden. We beschrijven een respiratoire burst test die reactieve zuurstofradicalen geproduceerd wanneer de aangeboren immuunrespons chemisch geïnduceerd kwantificeert.
Abstract
De fagocyt respiratoire burst is onderdeel van de aangeboren immuunrespons op pathogene infectie en omvat de productie van reactieve zuurstof species (ROS). ROS zijn giftig en functie om phagocytized micro-organismen te doden. In vivo kwantificatie van-fagocytensysteem afgeleide ROS biedt informatie met betrekking tot het vermogen van een organisme om een robuuste aangeboren immuunrespons. Hier beschrijven we een protocol te kwantificeren en te vergelijken ROS geheel zebravis embryo's bij chemische inductie van de fagocytensysteem respiratory burst. Deze methode maakt gebruik van een niet-fluorescente verbinding die fluorescerende op oxidatie door ROS wordt. Individuele zebravis embryo's worden gepipetteerd in de putjes van een microtiterplaat en geïncubeerd in deze fluorogene substraat met of zonder chemische inductor van de respiratoire burst. Fluorescentie in elk putje wordt gekwantificeerd op gewenste tijdstippen met behulp van een microplaatlezer. Fluorescentie metingen worden aangepast aan de achtergrond fluorescentie te elimineren en vervolgens compared met een ongepaarde t-test. Deze methode maakt vergelijking van de respiratoire uitbarsting potentieel van zebravis embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia en in reactie op experimentele manipulaties zoals proteïne knockdown, overexpressie, of behandeling met farmacologische agentia. Deze methode kan ook worden gebruikt om de respiratoire burst reactie geheel ontleed nieren of celpreparaten uit nieren van volwassen zebravissen en andere vissoorten volgen. Wij geloven dat de relatieve eenvoud en het aanpassingsvermogen van dit protocol bestaande protocollen zal aanvullen en van belang zijn voor onderzoekers die proberen om beter inzicht in de aangeboren immuunrespons zullen zijn.
Introduction
Het immuunsysteem bestaat uit twee takken: aangeboren en adaptieve immuniteit. Aangeboren immuniteit evolutionair veel ouder dan adaptieve immuniteit. Ongewervelde dieren zijn momenteel gedacht dat alleen aangeboren immuniteit hebben, terwijl gewervelde dieren bezitten zowel het aangeboren en adaptieve takken. Terwijl adaptieve immuniteit verleent specifieke en langdurige immuniteit voor bepaalde ziekteverwekkers, aangeboren immuniteit is een onmiddellijke reactie op binnendringende bacteriën, virussen en schimmels. Een cruciaal aspect van de aangeboren immuunrespons omvat de afgifte van cytokinen en chemokinen, die resulteert in ontsteking en werving van fagocyten (bijvoorbeeld macrofagen, neutrofielen) te overspoelen en vernietigen vreemde indringers.
Succesvolle aangeboren immuunresponsen omvatten: (1) opname van binnendringende micro-organismen, (2) inductie van de geschikte signalering cascades (bv. afgifte van cytokinen en chemokinen), (3) een goede ontwikkeling / voldoende aantallen fagocyten; (4) Migratie van fagocyten aan plaatsen van infectie (5) afblazen van pathogenen, en (6) vernietiging van micro-organismen overspoeld. Een tekort aan een van deze stappen kunnen leiden tot de gastheer overweldigd door en bezwijken aan de infectie. Een robuuste aangeboren immuunrespons is van vitaal belang voor de gezondheid van organismen, omdat het de eerste lijn van verdediging tegen ziekteverwekkers in alle planten en dieren. In gewervelde dieren, het versterkt ook de adaptieve immuunrespons 1. Daarom is het essentieel dat wij in staat om alle aspecten van de aangeboren immuunrespons evalueren om beter begrijpen en zijn functie te optimaliseren.
Veel model organismen worden gebruikt om aangeboren immuniteit bestuderen, variërend van Arabadopsis naar C. elegans Drosophila aan muizen aan gekweekte menselijke cellen. Een voordeel van het gebruik van de zebravis (Danio rerio) modelsysteem om aangeboren immuniteit bestuderen is dat de zebravis is een gewerveld dier, met zowel aangeboren en adaptieve imschap, maar de ontwikkeling van aangeboren en adaptieve immuniteit zijn tijdelijk gescheiden. Zebravis uitsluitend op aangeboren immuniteit voor bescherming tegen infectie tot adaptieve immuniteit wordt volledig functioneel, die ongeveer 4-6 weken na de bevruchting 2 optreedt. Naast de gereedschappen voor genetische manipulatie, optische helderheid en snelle, externe ontwikkeling, aangeboren immuniteit als het principe wijze van verweer in de zebravis embryo's biedt een vereenvoudigd model waarin om de complexiteit van de aangeboren immuunrespons in vivo te bestuderen.
Meerdere protocollen ontwikkeld om verschillende aspecten van de aangeboren immuunrespons in zebravis embryo's te beoordelen. Microarrays en RNAseq hebben gevalideerd dat de cytokine profielen uitgelokt door de zebravis aangeboren immuunrespons zijn vergelijkbaar met die van mensen en hebben ook voorgesteld de betrokkenheid van onverwachte genen bij aangeboren immuniteit 3,4. De transparantie van de zebravis embryo en tl, transgeneic stammen van ziekteverwekkers en zebravis mogelijk maken visualisatie van dynamische gastheer-pathogeen interacties in vivo in real time. Transgene zebravis embryo GFP onder controle van de neutrofiel-specifieke promoter myeloperoxidase 5,6 of macrofaag-specifieke promotor MPEG1 7 hebben het mogelijk te visualiseren en kwantificeren fagocyt migratie naar gebieden van gelokaliseerde infecties 8 alsmede fagocytose en vernietiging van zichtbaar gemaakt fluorescent gelabelde pathogenen 8,9. Zebravis embryo's zijn ook ontvankelijk voor het genereren van hoog-assays en chemische schermen. Dienovereenkomstig, high-throughput methoden transcriptoomanalyse na infectie 10 en fagocytensysteem migratie naar sites van chemisch geïnduceerde schade 11 zijn onlangs ontwikkeld.
Van de hierboven genoemde technieken, geen kwantitatieve beoordeling van de laatste fase van een ziekteverwekker vernietiging door fagocyten. Deze laatste faseomvat een respiratoire burst (productie van ROS en andere giftige stoffen), die overspoeld ziektekiemen te doden. Het enzym NADPH oxidase is een belangrijke bron van ROS in fagocyten. Montage van de subeenheden van het NADPH oxidase enzym leidt tot overdracht van elektronen aan zuurstof, superoxide anionen. Door opeenvolgende enzymatische reacties, superoxide kan vervolgens worden omgezet in waterstofperoxide en hypochloorzuur (Figuur 1A). Het is de respiratoire uitbarsting van fagocyten die ziekteverwekkers doodt en dus de kwantificering van de respiratoire uitbarsting potentieel van zebravis embryo is indicatief voor de algehele gezondheid aangeboren immuunsysteem. We hebben een fluorescentie-gebaseerde test voor de respiratory burst in groepen van afzonderlijke zebravis embryo 12 kwantificeren. Deze test maakt gebruik van de niet-fluorescerende, gereduceerde vorm van een in de handel verkrijgbaar, celpermeable kleurstof. Deze kleurstof, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (H2DCFDA), wordt omgezet in het fluorescent verbinding 2 ', 7'-dichloorfluoresceïne (DCF), na oxidatie. De diverse ROS gegenereerd door de fagocyt respiratory burst kan oxideren H2DCFDA en het genereren van fluorescentie 24. Het uiterlijk van fluorescentie kan worden gebruikt om te kwantificeren en vergelijken respiratory burst reactie tussen groepen zebravis. De proteïne kinase C agonist forbolmyristaatacetaat (PMA) wordt gebruikt om chemisch te induceren NADPH oxidase ROS produceren en verhogen fluorescentie metingen (Figuur 1B). Hierin geven we een gedetailleerd protocol van een aangepaste en geoptimaliseerde versie van deze zebravis embryo ademhalingsuitbarsting assay. Deze test kan worden gebruikt voor het vergelijken van de respiratory burst tussen groepen afzonderlijke zebravis embryo's in de tijd en / of in antwoord op experimentele manipulaties (bijv. morfolino-eiwit gemedieerde knockdown). Het gebruik van deze werkwijze, samen met andere zebravissen aangeboren immuniteit assays, zal een completer beeld van de complexe en kritische biedenaangeboren immuunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zebravis Onderhoud
- Veehouderij: Mass spawn volwassen zebravissen zoals eerder beschreven 13. Verzamel voortgebracht embryo's zoals eerder beschreven 14.
- Micro-injectie (indien gewenst): microinject 1-4 cellig stadium zebravis embryo's met morfolino oligonucleotiden genproducten of mRNA knockdown om genproducten overexpressie zoals eerder beschreven 15.
- Handhaaf een adequate pool van mock geïnjecteerd controles (minstens 48 levende, mock ingespoten controle vis en 48 wonen, experimenteel gemanipuleerde vissen zijn nodig om een 96 putsmicroplaat vullen).
- Handhaaf embryo: Grow embryo in diepe petrischalen bij 28 ° C in ei water (60 pg / ml Instant Ocean Sea Salt in gedestilleerd water geautoclaveerd) tot de gewenste ontwikkelingsstadium (een respiratoire burst reactie is niet detecteerbaar met dit protocol in de zebravis embryo's jonger dan 2 dagen na de bevruchting 12). Opmerking: Het is oBServed dat het voorkomen van pigmentatie in zebravis embryo's door ofwel het gebruik van 1-fenyl-2-thioureum (PTU) of golden/slc24a5 mutant zebravis niet significant de inductie van fluorescentie door PMA (ongepubliceerde data, embryo's getest bij 48, 72 en 96 wijzigen HPF).
- Het verwijderen van dode embryo's dagelijks met een plastic overdracht pipet.
- Decanteren zorgvuldig oud ei water en aan te vullen met nieuwe ei water per dag.
- Dechorionate embryo's: Op de dag van het experiment, dechorionate embryo's (als embryo's zijn nog steeds in hun chorions) zoals eerder beschreven met behulp van twee fijn pincet 14 (dit respiratory burst test kan ook worden uitgevoerd op ontleed nieren van volwassen zebravissen 12 en gedetailleerde protocollen voor nier dissectie van volwassen zebravissen zijn eerder beschreven 16,17).
2. Oplossing Voorbereiding
- Bereid een voorraad oplossing van H2DCFDA: Weeg 1 mg H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg H2DCFDA in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om een 1 mg / ml voorraadoplossing te maken.
- Maak 22 pi fracties van deze voorraad oplossing in 1,7 ml microcentrifugebuizen.
- Wikkel de fracties van H2DCFDA stockoplossing in aluminiumfolie en houden in het donker waar mogelijk omdat H2DCFDA is lichtgevoelig.
- Store H2DCFDA fracties bij -20 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
- LET OP - Bereid een voorraad oplossing van forbolmyristaatacetaat (PMA): Weeg 1 mg PMA gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen, veiligheidsbril en masker).
- Los PMA in 1 ml DMSO een 1 mg / ml voorraadoplossing te maken.
- Maak 11 ul fracties in 1,7 ml microcentrifugebuizen.
- Store fracties van PMA voorraad oplossing bij -80 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
- Bereid een werkende oplossing van H2DCFDA: Op de dag van het experiment, maak een H2DCFDA werkende oplossing door het toevoegen van 1 deel H2DCFDA stockoplossing aan 1deel DMSO (500 ug / ml H2DCFDA uiteindelijke concentratie). Bijvoorbeeld, voeg 20 ul van H2DCFDA voorraad-oplossing en 20 ul DMSO een folie verpakt 1,7 ml microcentrifugebuis.
- Bereid een werkende oplossing van PMA: Op de dag van het experiment, maak een PMA werkende oplossing door het toevoegen van 1 deel PMA stockoplossing aan 49 delen nuclease-vrij water (20 ug / ml PMA uiteindelijke concentratie). Bijvoorbeeld, verdunnen 10 ul PMA stockoplossing in 490 ul nuclease gratis water in een 1,7 ml microcentrifugebuis.
- Bereid een doseringsoplossing van H2DCFDA: Op de dag van het experiment, maken H2DCFDA doseringsoplossing met een eindconcentratie van 1 ug / ml H2DCFDA in ei water. De bereide volumes van de doseringsoplossingen kunnen worden aangepast zoals gewenst, maar toe dat de uiteindelijke concentraties van de reagentia worden gehandhaafd. Voor de nieren, in plaats van ei water, gebruik van dezelfde hoeveelheid van Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium/F-12 (50% DMEM, 50% F-12, zonder fenol rood). Tot 5 ml H2DCFDA makendoseren oplossing, gebruik dan een 5 ml serologische pipet 5 ml ei water (of DMEM/F-12) over in een 15 ml conische centrifugebuis in folie gewikkeld en gelabeld 'H'.
- Verwijder 10 pl ei water (of DMEM/F-12) uit de 15 ml conische buis met het label 'H' en gooi.
- Voeg 10 ul van H2DCFDA werkende oplossing in de 15 ml conische buis met het label 'H' en vortex te mengen (dit volume is genoeg voor 48 embryo of niermonsters (de helft van een volledige 96 putsmicroplaat) en deze putten zullen metingen van het niveau te verstrekken van achtergrond fluorescentie).
- Bereid een doseringsoplossing van H2DCFDA + PMA: Op de dag van het experiment, maken H2DCFDA + PMA doseringsoplossing met eindconcentraties van: H2DCFDA - 1 ug / ml en PMA - 400 ng / ml. Tot 5 ml H2DCFDA + PMA doseren oplossing te maken, gebruik dan een 5 ml serologische pipet 5 ml ei water (of DMEM/F-12) over in een nieuwe 15 ml conische buis met het label 'H + P'.
- Verwijder 110 _6, l ei water (of DMEM/F-12) uit de 15 ml conische buis met het label 'H + P' en gooi.
- Voeg 10 ul van H2DCFDA werkoplossing, voeg 100 ul PMA werkoplossing in de 15 ml conische buis gelabeld H + P 'en vortex mengen (dit volume is voldoende voor 48 monsters of de andere helft van een volledige 96 putjes microplaat ).
- Houd de dosering oplossingen op ijs.
3. Microplaatlezer Programming
- Bereid instrument: Schakel de microplaatlezer.
- Warm de lichtbron.
- Een programma opgezet om de fluorescentie te lezen: bijvoorbeeld excitatie: 485 nm, emissie: 528 nm; Optics Positie: top 510 nm; Gevoeligheid: 65, met een 5 sec schudden stap voorafgaand aan het lezen.
4. 96 Well Microplaat instellen (zie figuur 2)
- Leveringen te verzamelen: Verkrijgen gerechten met dechorionated embryo's, zwarte 96 putsmicroplaat, p200 pipet entips, ijsemmer met H2DCFDA en H2DCFDA + PMA doseeroplossingen, multichannel P200 pipet, twee steriele reservoirs, aluminiumfolie, en schaar.
- Overdracht een embryo in elk putje van een 96 putjes microtiterplaat: Gebruik schaar een pipetpunt gesneden zodat embryo of nieren pasvorm door de opening.
- Stel een p200 pipet 100 ul en dragen een embryo met ei water (of DMEM/F-12) in maar de putjes van een zwarte 96 puts microplaat keuze (het is niet nodig de pipetpunt voor elke verschillende wijzigen embryo monster in een experimentele conditie, maar het kan nodig om tips tussen experimentele omstandigheden veranderen). Zorg ervoor om te vermijden resterende chorions, omdat deze de neiging om de verzamelde gegevens scheef. Voor de overdracht van nieren, kan een groter volume pipet (ingesteld op 100 ul) worden gebruikt en pipetpunten kunnen worden teruggebracht tot een groter type te verkrijgen, indien nodig. Het kan noodzakelijk zijn om putjes te nemen zonder embryo of niermonsters, maar metde doseringsoplossingen te controleren voor enige experimentele manipulaties.
- Voeg doseeroplossingen: Giet H2DCFDA doseren oplossing in een steriele 25 ml reservoir.
- Gebruik een multichannel P200 pipet en acht tips om gelijktijdig pipet 100 ul H2DCFDA doseren oplossing in een kolom aan de 96 putsmicroplaat (500 ng / ml uiteindelijke concentratie van H2DCFDA).
- Herhaal deze (veranderende tips is niet nodig) voor zoveel kolommen als gewenst (meestal zes kolommen of 48 putten als vullen van een hele 96 putsmicroplaat). Voeg deze oplossing aan de helft van de controle-embryo monsters en de helft van de experimenteel gemanipuleerde embryo monsters (voorbeeld 96 microplaat ingesteld is weergegeven in figuur 2, zal deze putten (oranje gekleurde) achtergrond fluorescentie gegevens in monsters niet geïnduceerd met PMA) .
- Giet de H2DCFDA + PMA doseren oplossing in een nieuwe, steriele 25 ml reservoir.
- Gebruik een multichannel P200 pipet en acht tips om simultaneously Pipetteer 100 ul H2DCFDA + PMA doseringsoplossing in de overige kolommen (rood gekleurd in figuur 2) van de 96 putjes microplaat (veranderende tips is niet noodzakelijk eindconcentraties van H2DCFDA-500 ng / ml en PMA-200 ng / ml) .
- Bedek de microplaat met aluminiumfolie.
- Schud de microplaat gedurende ongeveer 20 seconden bij 150 rpm om de oplossingen in elke meng goed.
- Incubeer de microplaat bij 28 ° C wanneer deze niet wordt gelezen.
5. Fluorescentie Kwantificering
- Lees de microplaat op tijdstip = 0 uur na de toevoeging van PMA volgens de in stap 3.1.2 beschreven parameters.
- Ga door met metingen om de paar minuten voor het gewenste tijdsinterval of broeden de folie verpakt microplaat bij 28 ° C tot een later tijdstip en neem dan een eindpunt meting op een gewenst tijdstip (bijvoorbeeld 4 uur na de toevoeging van PMA).
- Gebruik een plastic transfer pipet om de embryo's uit de putjes te halen.
- Euthanaseren de embryo's op basis van uw dier zorg en gebruik protocol, bijvoorbeeld onderdompeling in tricaïne MS222.
- Gooi de microplaat en andere beschikbare materialen in de biologisch gevaarlijk afval container.
6. Data Analysis
- Beslissen over het tijdstip waarop u wilt fluorescentie waarden (bijvoorbeeld 4 uur na de toevoeging van PMA, tabel 1) te vergelijken.
- Trek fluorescentiewaarde de gemiddelde niet-geïnduceerde controle groep van fluorescentiewaarden de individuele PMA-geïnduceerde controle groep.
- Herhaal dit voor de experimentele groep met en zonder PMA.
- Bewaar de genormaliseerde fluorescentie waarden in twee kolommen, de controle + PMA groep en de experimentele + PMA-groep (tabel 2).
- Bereken de gemiddelden en standaarddeviaties voor de genormaliseerde fluorescentie waarden van de control + PMA group en de experimentele + PMA-groep.
- Vergelijk de genormaliseerde fluorescentie waarden met een ongepaarde t-test statistische significantie te bepalen (Tabel 2).
- Grafiek van de middelen van de control + PMA-groep en de experimentele + PMA groep met foutstaven die de juiste standaarddeviaties.
- Noteer het significantieniveau op de grafiek en in de figuur legenda (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier bieden we de gegevens vergelijken van de respiratoire burst respons in zebravis embryo's (wild-type, AB achtergrond) op 48 en 72 uur na de bevruchting (HPF). De 48 HPF embryo's fungeerden als onze controlegroep en de 72 HPF embryo's als onze experimentele groep. De steekproefgrootte werd gebruikt was 24-un geïnduceerde embryo's en 24 PMA-geïnduceerde embryo's per ontwikkelingsfase. Raw fluorescentie metingen (in relatieve fluorescentie-eenheden (RFU)) werden verkregen door het lezen van de microplaat 4 uur na de toevoeging van PMA. Ruwe fluorescentie waarden worden in Tabel 1. Raw fluorescentiewaarden waren constant hoger in de 48 HPF-un geïnduceerde embryo's dan de 72 HPF-un geïnduceerde embryo's, met uitzondering van een 72 HPF embryo (betekent: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU). De variabiliteit binnen deze twee monsters ongeveer gelijk (standaardafwijking: 48 HPF = ± 549 RFU, 72 HPF = ± 513 RFU), maar de 72 HPF groep varieerde meer ten opzichte van de gemiddelde (standaard deviation als een percentage van de gemiddelde: 48 HPF = 72%, 72 HPF = 223%). In de PMA-geïnduceerde groepen, rauwe fluorescentie waarden waren meestal hoger in de 72 HPF bevolking (betekent: 48 HPF PMA = 3798 RFU, 72 HPF PMA = 5825 RFU). Er was meer variatie in de 72 HPF PMA-geïnduceerde groep dan 48 HPF PMA geïnduceerde groep (standaardafwijking: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1365 RFU), maar de variabiliteit ten opzichte van het gemiddelde ongeveer gelijk (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
Om rekening van variabiliteit in achtergrondniveaus van fluorescentie werden genormaliseerde fluorescentie waarden berekend (PMA geïnduceerde minus het gemiddelde van de niet-geïnduceerde waarden van de geschikte ontwikkelingsstadium). Deze genormaliseerde fluorescentie waarden worden in Tabel 2, evenals de middelen, standaarddeviaties en p-waarde voor de 48 en 72 HPF groepen. Een grafiek van deze data wordt in Figuur 2. De genormaliseerde fluorescentie waarden zijn consistent higher in 72 HPF groep dan de groep 48 HPF (middelen: 48 HPF = 3040 RFU, 72 HPF = 5596 RFU) en de variabiliteit is vergelijkbaar ten opzichte van de gemiddelde (48 HPF = 27%, 72 HPF = 24%). Dit ademhalingsuitbarsting test bleek dat 72 HPF zebravis embryo's zijn in staat om meer ROS produceren en dus monteer een robuustere ademhalingseruptie respons dan 48 HPF embryo na inductie met PMA. Deze bevinding kan te wijten zijn aan een verhoogd aantal cellen, waaronder een verhoogd aantal granulocyten 18, 72 HPF embryo tegenover 48 HPF embryo. Een ongepaarde t-test om de gegevens statistisch vergelijken bevestigd dat de respiratory burst respons aanmerkelijk verschilt 72 HPF embryo's dan 48 HPF embryo (* p = 2 X 10 -9).
In meer algemene zin op het tijdstip t = 0 uur na de toevoeging van PMA, het ruwe fluorescentie waarden niet statistisch verschillend tussen de PMA-geïnduceerde en de niet-geïnduceerde groepen. De rauwe fluorescentie waarden zullen in toenemendee tijd in zowel de niet-geïnduceerde en geïnduceerde monsters, met een veel grotere toename voorkomen in het PMA-geïnduceerde embryo's 12. De toename in het ruwe fluorescentie waarden in het PMA-geïnduceerde groep, vergeleken met de niet-geïnduceerde groep zal statistisch significant bij ongeveer 1-2 uur na de toevoeging van PMA (afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van het zebravis embryo, met ouder worden embryo's monteren van een snellere ademhalingseruptie respons dan jongere embryo's). Genormaliseerde fluorescentie waarden (geïnduceerde minus niet-geïnduceerde) zou moeten stijgen met de toenemende ontwikkelingsstadium van zebravis embryo's, met het grootste verschil optreedt tussen 48 en 72 uur na de bevruchting en een kleiner verschil optreedt tussen 72 en 96 uur na de bevruchting. Ruwe fluorescentie getallen moet 5 tot 60 keer hoger in de PMA geïnduceerde groep ten opzichte van de niet-geïnduceerde groep, afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de zebravis embryo's (van 48 tot 96 uur na bevruchting). Variatieoptreden tussen afzonderlijke zebravis embryo monsters dus wordt aanbevolen dat ongeveer 24 embryo monsters per behandeling gebruikt.
Figuur 1. Diagram van chemische inductie van de respiratoire burst binnen een fagocytensysteem. (A) In deze respiratory burst test PMA wordt gebruikt om de productie van superoxide anionen induceren door NADPH oxidase. Superoxide wordt omgezet in zuurstof en waterstofperoxide door superoxide dismutase. Waterstofperoxide en chloride-anionen worden omgezet in hypochloorzuur door myeloperoxidase. De niet-fluorescerende kleurstof, H2DCFDA, wordt omgezet in de fluorescerende verbinding DCF, wanneer geoxideerd door verschillende ROS. (B) Diagram van hoe kwantificering van fluorescentie wordt afgelezen van de respiratoire burst respons.
lt = "Figuur 2" fo: content-width = "4.5in" src = "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
Figuur 2. Schematische voorstelling van de experimentele opzet voor de respiratoire burst test. Individuele dechorionated zebravis embryo's worden teruggeplaatst in de putjes van een 96 putsmicroplaat. De in witte putjes bevatten controle embryo's en de in zwart bevatten embryo's uit de experimentele groep putten. H2DCFDA of H2DCFDA + PMA doseringsoplossingen worden toegevoegd aan de geschikte putjes (gekleurd oranje of rood, respectievelijk). Fluorescentie wordt gekwantificeerd met behulp van een microplaat lezer. Respiratory burst test data wordt geanalyseerd, vergeleken en gepresenteerd. De tabel in deze figuur is een deelverzameling van de genormaliseerde fluorescentie waarden in Tabel 2. De grafiek in deze figuur omvat de middelen, standaarddeviaties en p-waarde van de gegevensset die in dit handschrift, die ook is weergegeven in Tabel 2. * P = 2 X 10 - 9.
Tabel 1. Raw fluorescentie waarden van niet-geïnduceerde (oranje achtergrond) en geïnduceerde (rode achtergrond) 48 of 72 uur na de bevruchting (HPF) zebravis embryo's (witte of zwarte cijfers, respectievelijk) bij 4 uur na de toevoeging van PMA. Het gemiddelde wordt berekend voor de niet-geïnduceerde monsters.
| 48 HPF embryo | 72 HPF embryo | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Betekenen | 758 | 230 | |||
| 48 hpf embroys + PMA | 72 HPF embryo + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tabel 2. Normalisatie en statistische vergelijking van de gegevens. Om genormaliseerde fluorescentie waarden te komen, bereken het verschil tussen elke PMA-geïnduceerde fluorescentie waarde en de juiste-un geïnduceerde gemiddelde waarde. Statistisch vergelijken deze twee gegevens met behulp van een ongepaarde t-test. Bereken de gemiddelden en standaarddeviaties. Geef de middelen, standaarddeviaties en p-waarde (n) in grafische vorm (zoals in figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De primaire functie van fagocyten is pathogenen detecteren overspoelen en vernietigen. Het vermogen van fagocyten om een adequate respiratory burst produceren is essentieel voor deze functie. Aldus kwantificering van de respiratoire burst antwoord is een methode om een vergelijking van algemeen aangeboren immuunsysteem gezondheid en de functie tussen groepen individuen en / of in antwoord op experimentele manipulaties mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor het induceren, kwantificeren en vergelijk de respiratory burst reactie tussen groepen afzonderlijke zebravis embryo. Kortom, PMA leidt tot de productie van ROS door het enzym NADPH oxidase. Deze ROS werken op een niet-fluorescerende kleurstof en oxideren aan een fluorescerende verbinding. Een microplaat reader wordt gebruikt om de relatieve fluorescentie te detecteren in elk putje. Fluorescentie gegenereerd na PMA inductie is indicatief voor de respiratory burst potentieel en algemene gezondheid aangeboren immuunsysteem van zebravis embryo. Vergelijking van het genormaliseerde niveau van TLcentie tussen PMA geïnduceerde groepen met een ongepaarde t-test kan worden gebruikt om te bepalen of er een significant verschil in de respiratory burst potentiaal tussen groepen zebravis. Experimentele manipulaties resulteert in aanzienlijke verschillen in de respiratory burst reactie zal inzichten in de mechanismen van aangeboren immuniteit, zoals genproducten voor de fagocyt respiratory burst, geneesmiddelen die versterken of tegenwerken de respiratory burst respons.
Protocollen om verschillende facetten van de aangeboren immuunrespons in de zebravis model assay zijn ontwikkeld (zie Inleiding). Relatief weinig van deze technieken meten van de productie van ROS. De techniek die in dit artikel kwantificeert productie van ROS in de zebravis embryo's na stimulatie van een aangeboren immuunrespons met PMA. Deze techniek is vergelijkbaar met respiratoire burst testen uitgevoerd op geïsoleerde volbloedmonsters, waarin PMA wordt ook gebruikt om induce een respiratoire burst reactie, en vervolgens de ROS gegenereerd worden gemeten met behulp van een fluorogeen substraat (bijv. Phagoburst, Orpegen Pharma). De hier beschreven methode kan worden gebruikt met hele zebravis embryo's, alsmede ontleed nieren van volwassen zebravissen 13, zoals de zebravis anterior nieren komt overeen met humaan beenmerg, die de plaats van volwassen hematopoiese 19. De hier beschreven methode is veelzijdig genoeg om te worden gebruikt met andere vissoorten en celsystemen zoals celpreparaten van dikkopjes nieren 20.
Een alternatieve methode om ROS detecteren geheel zebravis embryo maakt gebruik van een in vivo waterstofperoxide sensor. Messenger RNA voor een redox-gevoelige fluorescente eiwit wordt geïnjecteerd in zebravis embryo's en de fluorescentieverhouding wordt tijd gevolgd volgende staartvin verwondde 21. Dit genetisch gecodeerd redox sensor maakt visualisatie van de temporele enruimtelijke dynamiek van waterstofperoxide in vivo. De toepassing van deze werkwijze bleek het verrassende resultaat dat het waterstofperoxide geproduceerd aanvankelijk vooraf komst van de eerste aangeboren immuuncellen, wat suggereert dat waterstofperoxide vrijkomt door gewonde epitheelcellen fungeert als signaal naar fagocyten 21 werven. Deze techniek, terwijl krachtig en informatief, gaat tijdrovend en technisch moeilijk embryologische en microscopie procedures. Dit redox sensor is specifiek voor waterstofperoxide, die slechts een van de vele ROS werking tijdens de aangeboren immuunrespons.
In vergelijking met de aanpak hierboven besproken, onze methode meet ook in vivo ROS, en toch is technisch minder veeleisend en gebruikt een chemische stof een aangeboren immuunrespons plaats van een fysieke wond veroorzaken. In tegenstelling tot de bovenstaande werkwijze, waarbij waterstofperoxide specifiek meet Onze werkwijze meet detotale niveau van ROS. Een voordeel van het opsporen van een enkele ROS is dat rollen voor die verbinding alleen in aangeboren immuniteit kan worden opgehelderd. Net als bij de hierboven besproken methode, onze benadering deelt de inherente voordelen en nadelen worden uitgevoerd in het gehele dier. De interacties tussen fagocyten en hun omgeving, die geëlimineerd wanneer ademhalingsuitbarsting testen worden uitgevoerd op geïsoleerde bloedmonsters, worden bewaard in deze hele dier assays. Echter, gebruik van het gehele dier dat resulteert in detectie van ROS uit niet-fagocyt bronnen (bijv. mitochondriën afkomstig ROS, nonphagocyte NADPH oxidase). In een poging om de specificiteit van onze werkwijze platform voor het detecteren van fagocyt-afgeleide ROS noemden we een onderzoek waarin deze respiratory burst test werd uitgevoerd in zebravis embryo's ontbreekt fagocyt-specifieke NADPH oxidase 9. Fagocytensysteem-specifieke NADPH oxidase werd geremd via-morpholino gemedieerde uitschakeling van p47phox of p91pHox-eiwit. In zebravis embryo's in de ontwikkelingsfase getest, de expressie van deze NADPH oxidase subeenheden beperkt tot een subset van bloedcellen, waarschijnlijk macrofagen 22,23. De ademhalingsuitbarsting potentieel van embryo's ontbreekt fagocytensysteem-specifieke NADPH oxidase was ongeveer een derde van die van de controles 9 (persoonlijke communicatie, dr. Robert Wheeler). Dit resultaat suggereert dat terwijl onze respiratory burst test doet detecteren ROS uit andere bronnen dan fagocyten, de meerderheid van de gedetecteerde fluorescentie kan worden toegeschreven aan de respiratory burst via fagocyt NADPH oxidase. Verdere specificiteit van deze test werd aangetoond met bis-indolylmaleïmide I (BISI), een farmacologische remmer van proteïne kinase C, het optreden van PMA, een proteïne kinase C agonist, op NADPH oxidase voorkomen. Voorbehandeling van PMA-geïnduceerde zebravis nieren of embryo's met BISI resulteerde in fluorescentie niveaus vergelijkbaar met niet-geïnduceerde controles 12. Een ideale respiratoireburst test zou een in vivo high-throughput assay waar fagocytensysteem-specifieke ROS beide konden worden gekwantificeerd en gevisualiseerd in de tijd. Totdat dit mogelijk is, de snelle aard en technisch gemakkelijk de hier beschreven werkwijze een nuttig alternatief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag naar het verleden en de huidige leden van de Kim laboratorium, Mark Nilan voor zebravis verzorging en onderhoud, dr. Robert Wheeler voor nuttige discussies en uitwisseling van gegevens te erkennen, en NIH subsidies 3RO1GM087308-02S1 en 1P20RR024475-01A2 en de Maine Landbouw en Bosbeheer Experiment Station (publicatienummer 3303) voor financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.
