Summary
La risposta immunitaria innata protegge contro l'infezione da organismi patogeni. Una componente fondamentale della risposta immunitaria innata, il burst respiratorio dei fagociti, genera specie reattive dell'ossigeno che uccidono i microrganismi invasori. Descriviamo un saggio burst respiratorio che quantifica specie reattive dell'ossigeno prodotte quando la risposta immunitaria innata è indotta chimicamente.
Abstract
Il burst respiratorio dei fagociti è parte della risposta immunitaria innata all'infezione patogeno e comporta la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). ROS sono tossici e la funzione di uccidere i microrganismi fagocitati. In vivo quantificazione dei fagociti di derivazione ROS fornisce informazioni per quanto riguarda la capacità di un organismo di montare una risposta immunitaria innata robusto. Qui si descrive un protocollo per quantificare e confrontare i ROS in interi embrioni di zebrafish dopo induzione chimica del burst respiratorio dei fagociti. Questo metodo fa uso di un composto non fluorescente che diventa fluorescente durante l'ossidazione da ROS. I singoli embrioni di zebrafish sono aggiunti nei pozzetti di una micropiastra e incubate in questo substrato fluorogenico con o senza un induttore chimico del burst respiratorio. Fluorescenza in ogni pozzetto è quantificato in momenti desiderati utilizzando un lettore di micropiastre. Letture di fluorescenza sono rettificati per eliminare fluorescenza di fondo e poi compared utilizzando un t-test per dati non appaiati. Questo metodo permette la comparazione del potenziale burst respiratorio di zebrafish embrioni a diversi stadi di sviluppo e in risposta a manipolazioni sperimentali come proteina smontabile, sovraespressione, o trattamento con agenti farmacologici. Questo metodo può anche essere usato per monitorare la risposta burst respiratorio in interi reni sezionato o preparazioni di cellule di rene di zebrafish adulti e alcune altre specie ittiche. Crediamo che la relativa semplicità e adattabilità di questo protocollo si integrano protocolli esistenti e sarà di interesse per i ricercatori che cercano di comprendere meglio la risposta immunitaria innata.
Introduction
Il sistema immunitario è costituito da due rami: immunità innata e adattativa. L'immunità innata è evolutivamente più antica di immunità adattativa. Gli invertebrati sono attualmente pensa di avere solo l'immunità innata, mentre i vertebrati possiedono entrambi i rami innata e adattativa. Mentre l'immunità adattativa conferisce l'immunità specifica e di lunga durata a certi agenti patogeni, immunità innata è una risposta immediata ai batteri invasori, virus e funghi. Un aspetto cruciale della risposta immunitaria innata comporta il rilascio di citochine e chemochine, che si traduce in infiammazione e il reclutamento dei fagociti (es. macrofagi, neutrofili) per inghiottire e distruggere gli invasori stranieri.
Risposte immunitarie innate di successo riguardano: (1) il riconoscimento di microrganismi invasori, (2) induzione di cascate di segnalazione adeguati (ad esempio rilascio di citochine e chemochine), (3) lo sviluppo corretto / numero adeguato di fagociti; (4) La migrazione dei fagociti a siti di infezione; (5) fagocitazione di agenti patogeni, e (6) la distruzione dei microrganismi inghiottito. Una carenza in uno qualsiasi di questi passi potrebbe portare per l'host di essere sopraffatti da, e soccombere, l'infezione. Una risposta immunitaria innata robusta è vitale per la salute degli organismi perché è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in tutte le piante e animali. Nei vertebrati, potenzia anche la risposta immunitaria adattativa 1. Pertanto, è fondamentale che siamo in grado di valutare tutti gli aspetti della risposta immunitaria innata per comprendere meglio e per ottimizzare la sua funzione.
Molti organismi modello sono utilizzati per studiare l'immunità innata, che vanno da Arabadopsis a C. elegans di Drosophila a topi di cellule umane in coltura. Un vantaggio di utilizzare il pesce zebra (Danio rerio) sistema modello per studiare l'immunità innata è che il zebrafish è un vertebrato, con im sia innata e adattativaComunità, ma lo sviluppo dell'immunità innata e adattativa sono temporalmente separati. Zebrafish fare affidamento esclusivamente sulle immunità innata per la protezione contro l'infezione fino a quando l'immunità adattativa diventa pienamente funzionale, che si verifica circa 4-6 settimane dopo la fecondazione 2. Oltre agli strumenti per la manipolazione genetica, chiarezza ottica e rapido, sviluppo esterno, l'immunità innata come modalità principio di difesa in embrioni di zebrafish fornisce un modello semplificato in cui studiare la complessità della risposta immunitaria innata in vivo.
Sono stati sviluppati protocolli multipli per valutare diversi aspetti della risposta immunitaria innata in embrioni di zebrafish. Microarrays e RNAseq hanno confermato che i profili delle citochine indotte dalla risposta immunitaria innata zebrafish sono simili a quello umano e hanno anche suggerito il coinvolgimento di geni inattese immunità innata 3,4. La trasparenza del zebrafish e fluorescenti, transgenderic ceppi di patogeni e zebrafish permettono la visualizzazione delle interazioni ospite-patogeno dinamici in vivo in tempo reale. Embrioni di zebrafish transgenici esprimenti GFP sotto il controllo del specifico neutrofili mieloperossidasi promotore 5,6 o la specifica-macrofago MPEG1 promotore 7 hanno permesso di visualizzare e quantificare la migrazione dei fagociti a siti di infezioni localizzate 8 nonché di visualizzare fagocitosi e distruzione di fluorescente patogeni 8,9. Embrioni di zebrafish sono anche suscettibili alla generazione di saggi high-throughput e schermi chimici. Di conseguenza, sono stati recentemente sviluppati metodi high-throughput di analisi del trascrittoma al momento dell'infezione 10 e la migrazione dei fagociti a siti di lesione indotta chimicamente 11.
Delle tecniche sopra elencate, nessuna valutare quantitativamente la fase finale di distruzione patogeno dai fagociti. Questa fase finalecomporta un burst respiratorio (ossia la produzione di ROS e di altri composti tossici), che uccidono gli agenti patogeni inghiottito. L'enzima NADPH ossidasi è una delle principali fonti di ROS in fagociti. Assemblaggio delle subunità dei NADPH ossidasi risultati degli enzimi nel trasferimento di elettroni all'ossigeno, generando anioni superossido. Attraverso successive reazioni enzimatiche, superossido può quindi essere convertito in perossido di idrogeno e acido ipocloroso (Figura 1A). È il burst respiratorio dei fagociti che uccide i patogeni e quindi, la quantificazione del potenziale burst respiratorio di embrioni di zebrafish è indicativo della salute immunitaria innata generale. Abbiamo sviluppato un saggio basato sulla fluorescenza per quantificare il burst respiratorio in gruppi di singoli embrioni di zebrafish 12. Questa analisi utilizza la non fluorescente, forma ridotta di un colorante cellula-permeabile disponibile in commercio. Questo colorante, 2 ', 7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCFDA), viene convertito nelle fluorescenticomposto cent, 2 ', 7'-diclorofluoresceina (DCF), in seguito all'ossidazione. Le diverse ROS generati dal burst respiratorio dei fagociti possono ossidare H2DCFDA e generare la fluorescenza 24. La comparsa di fluorescenza può essere utilizzato per quantificare e confrontare la risposta burst respiratorio tra gruppi di zebrafish. La proteina chinasi C acetato agonista forbolo miristato (PMA) viene usato per indurre chimicamente NADPH ossidasi per produrre ROS e quindi aumentare letture della fluorescenza (Figura 1B). Qui, forniamo un protocollo dettagliato di una versione modificata ed ottimizzata di questo zebrafish embrione respiratorio saggio burst. Questo test può essere utilizzato per confrontare il burst respiratorio tra gruppi di singoli embrioni di zebrafish nel tempo e / o in risposta a manipolazioni sperimentali (ad esempio morfolino-mediata knockdown proteine). L'utilizzo di questo metodo, in collaborazione con altri zebrafish saggi dell'immunità innata, fornirà un quadro più completo del complesso e criticorisposta immunitaria innata.
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Protocol
1. Cura e manutenzione Zebrafish
- Zootecnica: escursione Mass adulto zebrafish come descritto in precedenza 13. Raccogliere gli embrioni generati come descritto in precedenza 14.
- Microiniezione (se desiderato): microinject 1-4 della fase delle cellule di embrioni di zebrafish con oligonucleotidi morpholino al knockdown prodotti genici o mRNA per sovraesprimere prodotti genici come descritto in precedenza 15.
- Mantenere una piscina adeguata di finto controlli iniettato (almeno 48 che vivono, finto iniettato pesci di controllo e 48 di vita, pesci sperimentalmente manipolato sono necessari per riempire un pozzo micropiastra 96).
- Mantenere gli embrioni: crescere gli embrioni in capsule di Petri profonde a 28 ° C in acqua uovo (60 mg / ml Instant Ocean Sea Salt in acqua distillata-autoclavato acqua) fino alla fase di sviluppo desiderato (una risposta burst respiratorio non è rilevabile utilizzando questo protocollo in embrioni di zebrafish età inferiore ai 2 giorni dopo la fecondazione 12). Nota: E 'stato observed che la prevenzione pigmentazione in embrioni di zebrafish sia attraverso l'utilizzo di 1-fenil 2-tiourea (PTU) o golden/slc24a5 zebrafish mutanti non altera in maniera significativa l'induzione di fluorescenza da PMA (dati non pubblicati, gli embrioni testati a 48, 72, e 96 hpf).
- Rimuovere gli embrioni morti al giorno con una pipetta di trasferimento di plastica.
- Decantare attentamente acqua uovo vecchio e riempire con acqua nuova giornaliera di uova.
- Embrioni Dechorionate: Il giorno dell'esperimento, gli embrioni dechorionate (se gli embrioni sono ancora nelle loro chorions) come descritto in precedenza con due belle pinze 14 (questo test burst respiratorio possono essere eseguite anche sui reni sezionati da zebrafish adulto 12 e protocolli dettagliati per i reni dissezione di zebrafish adulto sono stati precedentemente descritto 16,17).
2. Soluzione Preparazione
- Preparare una soluzione stock di H2DCFDA: Pesare 1 mg di H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg di H2DCFDA in 1 ml di dimetilsolfossido (DMSO) per fare un / ml di soluzione 1 mg.
- Fai 22 microlitri aliquote di questa soluzione in 1,7 ml provette da microcentrifuga.
- Avvolgere le aliquote di soluzione di riserva H2DCFDA in un foglio di alluminio e conservare al buio, quando possibile, perché H2DCFDA è sensibile alla luce.
- Conservare H2DCFDA aliquote a -20 ° C per un massimo di 3 mesi.
- ATTENZIONE - Preparare una soluzione madre di acetato phorbol myristate (PMA): Pesare 1 mg di PMA con un equipaggiamento di protezione individuale (es. guanti, occhiali e maschera).
- Sciogliere PMA in 1 ml di DMSO a fare un / ml di soluzione 1 mg.
- Fai 11 microlitri aliquote in 1,7 ml provette da microcentrifuga.
- Il negozio di aliquote di soluzione madre PMA a -80 ° C per un massimo di 3 mesi.
- Preparare una soluzione di lavoro di H2DCFDA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione di lavoro H2DCFDA aggiungendo H2DCFDA soluzione stock 1 a 1 parteDMSO parte (500 mg / ml H2DCFDA concentrazione finale). Ad esempio, aggiungere 20 ml di soluzione stock H2DCFDA e 20 microlitri DMSO ad una lamina avvolto 1,7 ml provetta.
- Preparare una soluzione di lavoro di PMA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione di lavoro PMA aggiungendo PMA soluzione stock 1 parte a 49 parti di acqua priva di nucleasi (20 mcg / ml PMA concentrazione finale). Ad esempio, diluire 10 ml di soluzione stock PMA in 490 microlitri acqua priva di nucleasi in una provetta 1,7 ml microcentrifuga.
- Preparare una soluzione di dosaggio di H2DCFDA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione di dosaggio H2DCFDA con una concentrazione finale di 1 mg / ml in acqua H2DCFDA uovo. I volumi preparate delle soluzioni di dosaggio possono essere modificate a piacimento, ma garantiscono che le concentrazioni finali dei reagenti vengono mantenute. Per reni, al posto dell'acqua uovo, utilizzare lo stesso volume di Dulbecco modificato medium/F-12 Eagle (DMEM 50%, 50% F-12, senza rosso fenolo). Per fare 5 ml di H2DCFDAdosaggio soluzione, utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 5 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) in una provetta da 15 ml conica avvolto in carta stagnola ed etichettato 'H'.
- Rimuovere 10 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) dalle tubo da 15 ml etichettato 'H' e scartare.
- Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro H2DCFDA nel tubo da 15 ml denominato 'H' e vortex per miscelare (questo volume è sufficiente per 48 embrioni oi campioni del rene (la metà di un full 96 ben micropiastra) e questi pozzi fornirà misurazioni del livello di fluorescenza di fondo).
- Preparare una soluzione di dosaggio di H2DCFDA + PMA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione H2DCFDA + PMA dosaggio con concentrazioni finali di: H2DCFDA - 1 ug / ml e PMA - 400 ng / ml. Per fare 5 ml di soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA, utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 5 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) in un nuovo tubo da 15 ml etichettato 'H + P'.
- Rimuovere 110 _6; l di acqua uovo (o DMEM/F-12) dalle tubo da 15 ml etichettato 'H + P' e scartare.
- Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro H2DCFDA, poi aggiungere 100 ml di soluzione di lavoro PMA nel tubo da 15 ml etichettato 'H + P' e agitare per miscelare (questo volume è sufficiente per 48 campioni o l'altra metà di un pieno 96 ben micropiastra ).
- Conservare le soluzioni di dosaggio su ghiaccio.
3. Microplate Reader Programmazione
- Preparare strumento: Accendere il lettore di micropiastre.
- Riscaldare la sorgente di luce.
- Impostare un programma per leggere la fluorescenza: per es eccitazione: 485 nm, emissione: 528 nm; Ottica Ruolo: top 510 nm; Sensibilità: 65, con 5 sec agitazione passo prima della lettura.
4. 96 Beh Microplate Set Up (vedi figura 2)
- Raccogliere le forniture: Ottenere i piatti con gli embrioni dechorionated, nero 96 ben micropiastra, p200 pipetta esuggerimenti, secchiello per il ghiaccio con H2DCFDA e soluzioni di dosaggio H2DCFDA + PMA, multicanale p200 pipetta, due serbatoi sterili, fogli di alluminio, e forbici.
- Trasferimento di un embrione in ciascun pozzetto di una micropiastra da 96 pozzetti: Usare le forbici per tagliare un puntale tale che gli embrioni oi reni in forma attraverso l'apertura.
- Impostare una pipetta P200 a 100 microlitri e trasferire un embrione con acqua uovo (o DMEM/F-12) in quanto molti dei pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero come desiderato (non è necessario cambiare la punta della pipetta per ogni diverso campione embrione all'interno di una condizione sperimentale, ma può essere necessario cambiare gli aghi tra condizioni sperimentali). Essere sicuri di evitare di trasferire chorions residue, in quanto questi tendono a distorcere i dati raccolti. Per il trasferimento dei reni, una pipetta volume maggiore (impostato a 100 microlitri) può essere utilizzato e punte di pipetta può essere tagliato per ottenere un diametro maggiore, se necessario. Potrebbe essere necessario incorporare pozzetti senza campioni embrione o renali, ma conle soluzioni di dosaggio per il controllo di alcune manipolazioni sperimentali.
- Aggiungere le soluzioni di dosaggio: Versare la soluzione di dosaggio H2DCFDA in una sterile 25 ml serbatoio.
- Utilizzare un p200 pipetta multicanale e otto suggerimenti per pipetta contemporaneamente 100 ml di soluzione di dosaggio H2DCFDA in una colonna sul pozzo micropiastra 96 (500 ng concentrazione finale ml / di H2DCFDA).
- Ripetere questo (cambiando punte non è necessario) per il numero di colonne desiderato (di solito sei colonne o 48 pozzetti se riempire un'intera micropiastra a 96 pozzetti). Aggiungere questa soluzione alla metà dei campioni embrioni controllo e la metà dei campioni embrioni manipolati sperimentalmente (esempio 96 ben micropiastre impostato è mostrato in Figura 2, questi pozzi (colore arancione) fornirà dati di fluorescenza di fondo in campioni non indotte con PMA) .
- Versare la soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA in un nuovo, sterile serbatoio 25 ml.
- Utilizzare un p200 pipetta multicanale e otto suggerimenti per simultaneously pipetta 100 microlitri della soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA nelle restanti colonne (di colore rosso in figura 2) del pozzo micropiastra 96 (cambiando punte non è necessario, concentrazioni finali di H2DCFDA-500 ng / ml e PMA-200 ng / ml) .
- Coprire la micropiastra con il foglio di alluminio.
- Agitare la micropiastra per circa 20 sec a 150 rpm per omogeneizzare le soluzioni in ciascun pozzetto.
- Incubare la micropiastra a 28 ° C quando non viene letto.
5. Fluorescenza Quantificazione
- Leggere la micropiastra al tempo = 0 ore dopo l'aggiunta di PMA utilizzando i parametri descritti al punto 3.1.2.
- Continuare le misurazioni ogni pochi minuti per l'intervallo di tempo desiderato o incubare la pellicola avvolta micropiastra a 28 ° C fino a un punto secondo tempo e prendere una misura endpoint all'ora desiderata (ad esempio 4 ore dopo l'aggiunta di PMA).
- Utilizzare una plastica transfer pipetta per recuperare gli embrioni dai pozzetti.
- Euthanize gli embrioni in base alla vostra cura degli animali e il protocollo di utilizzo, ad esempio, l'immersione in tricaine MS222.
- Smaltire la microplacca e altri materiali usa e getta nel contenitore rifiuti a rischio biologico.
6. Analisi dei dati
- Decidere il punto ora in cui si desidera confrontare valori di fluorescenza (es. 4 ore dopo l'aggiunta di PMA, tabella 1).
- Sottrarre il valore di fluorescenza del gruppo media di controllo non-indotta dai valori di fluorescenza del singolo gruppo di controllo PMA-indotta.
- Ripetere questa operazione per il gruppo sperimentale con e senza PMA.
- Memorizzare questi valori di fluorescenza normalizzate in due colonne, il controllo + gruppo PMA e il gruppo sperimentale + PMA (Tabella 2).
- Calcolare le medie e le deviazioni standard per i valori di fluorescenza normalizzati del controllo + PMA Group e il gruppo + PMA sperimentale.
- Confrontare i valori di fluorescenza normalizzati utilizzando un t-test per dati non appaiati per determinare la significatività statistica (Tabella 2).
- Grafico i mezzi di controllo + gruppo PMA e il gruppo sperimentale + PMA con barre di errore riflettono le opportune deviazioni standard.
- Registrare il livello di significatività sul grafico e nella figura legenda (Figura 2).
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Representative Results
Qui, forniamo i dati confrontando la risposta burst respiratorio in embrioni di zebrafish (wild-type, AB sfondo) a 48 e 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Le 48 embrioni HPF agito come il nostro gruppo di controllo e 72 HPF embrioni come il nostro gruppo sperimentale. La dimensione del campione utilizzato è stato di 24 embrioni non-indotta e 24 embrioni PMA-indotta per ogni fase di sviluppo. Letture della fluorescenza prime (in unità di fluorescenza relativa (RFU)) sono stati ottenuti leggendo la micropiastra 4 ore dopo l'aggiunta di PMA. Valori di fluorescenza prime sono riportati nella Tabella 1. Valori di fluorescenza prime erano molto più elevati nei 48 HPF embrioni non-indotta rispetto ai 72 HPF embrioni non-indotta, con l'eccezione di un embrione 72 HPF (mezzi: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU). La variabilità all'interno di questi due campioni è stata approssimativamente uguale (deviazioni standard: 48 HPF = ± 549 RFU, 72 HPF = ± 513 RFU), ma il gruppo 72 hpf varia in più rispetto alla media (deviatio di serien come percentuale della media: 48 HPF = 72%, 72 HPF = 223%). Nei gruppi PMA-indotta, valori di fluorescenza prime erano per lo più alta nella popolazione hpf 72 (mezzi: 48 hpf PMA = 3798 RFU, 72 hpf PMA = 5825 RFU). C'era una maggiore variabilità nel 72 HPF gruppo PMA-indotta rispetto al 48 HPF gruppo PMA-indotta (deviazioni standard: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1365 RFU), ma la variabilità rispetto alla media è stata approssimativamente (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
Per tenere conto della variabilità dei livelli di fluorescenza di fondo, i valori di fluorescenza normalizzati sono stati calcolati (valore PMA-indotta meno la media dei valori di un-indotte dallo stadio di sviluppo appropriato). Questi valori di fluorescenza normalizzato sono riportati nella Tabella 2, nonché i mezzi, deviazioni standard e p-value per i 48 e 72 HPF gruppi. Un grafico di questi dati è fornita in Figura 2. I valori di fluorescenza normalizzati sono costantemente higher nel gruppo 72 HPF rispetto al gruppo HPF 48 (significa: 48 HPF = 3040 RFU, 72 HPF = 5596 RFU) e la variabilità è simile rispetto alla media (48 HPF = 27%, 72 HPF = 24%). Questo saggio burst respiratorio ha rivelato che gli embrioni 72 HPF zebrafish sono in grado di produrre più di ROS e quindi montare una risposta burst respiratorio più robusta di 48 HPF embrioni dopo induzione con PMA. Questo risultato può essere dovuto ad un aumento del numero di cellule, tra cui un aumento del numero di granulociti 18, in 72 HPF embrioni rispetto al 48 embrioni HPF. Un t-test per dati non appaiati per confrontare i dati statisticamente confermato che la risposta burst respiratorio è significativamente differente in 72 HPF embrioni di 48 HPF embrioni (* p = 2 X 10 -9).
In senso più generale, al periodo del punto t = 0 h dopo l'aggiunta di PMA, i valori di fluorescenza greggio non dovrebbero essere statisticamente differente tra il PMA-indotta e gruppi non-indotta. I valori di fluorescenza prime saranno increase nel tempo in entrambi i campioni non-indotte e indotte, con un aumento molto più grande che si verificano negli embrioni PMA-indotti 12. L'incremento dei valori di fluorescenza prime nel gruppo PMA-indotta, rispetto al gruppo non-indotto, diventerà statisticamente significativa in circa 1-2 ore dopo l'aggiunta di PMA (a seconda dello stadio di sviluppo degli embrioni di zebrafish, con età superiore embrioni montare una risposta raffica più veloce respiratorio di embrioni più giovani). Valori di fluorescenza normalizzati (meno indotto un-indotta) dovrebbero aumentare con lo stadio di sviluppo crescente di embrioni di zebrafish, con la grande differenza che si verificano tra 48 e 72 ore dopo la fecondazione e una differenza minore si verificano tra 72 e 96 ore dopo la fecondazione. Numeri di fluorescenza prime dovrebbero essere 5-60 volte più alta nel gruppo relativo PMA-indotta al gruppo non-indotto, a seconda della fase di sviluppo degli embrioni di zebrafish (tra 48 e 96 ore dopo la fecondazione). Variazioneavverrà tra i singoli campioni embrione di zebrafish, quindi, si consiglia di utilizzare circa 24 campioni di embrioni per ogni trattamento.
Figura 1. Diagramma di induzione chimica del burst respiratorio entro un fagocita. (A) In questo saggio burst respiratorio, PMA è utilizzata per indurre la produzione di anioni superossido da NADPH ossidasi. Superossido viene convertito in ossigeno e idrogeno perossido dal superossido dismutasi. Perossido di idrogeno e di cloruro di anioni vengono convertiti in acido ipocloroso da mieloperossidasi. Il colorante non fluorescente, H2DCFDA, viene convertito nel composto fluorescente, DCF, quando ossidato da molti ROS differenti. (B) Diagramma di come quantificazione della fluorescenza è una lettura fuori della risposta burst respiratorio.
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Figura 2. Schema del disegno sperimentale per l'analisi burst respiratorio. Persona dechorionated embrioni di zebrafish sono trasferiti nei pozzetti di una micropiastra ben 96. I pozzi delineate in bianco contengono gli embrioni di controllo e pozzi delineate in nero contengono embrioni del gruppo sperimentale. Le soluzioni di dosaggio H2DCFDA o H2DCFDA + PMA sono aggiunti ai pozzetti appropriati (di colore arancione o rosso, rispettivamente). La fluorescenza è quantificato utilizzando un lettore di micropiastre. Burst respiratorio dati dosaggio viene quindi analizzato, confrontato, e presentato. La tabella in questa figura è un sottoinsieme dei valori di fluorescenza normalizzati sono mostrati in Tabella 2. Il grafico in questa figura comprende mezzi, deviazioni standard e p-value per l'intero set di dati presentati in questo manoscritto, che è anche indicato in Tabella 2. * P = 2 X 10 - 9.
Tabella 1. Valori di fluorescenza prime provenienti non-indotta (sfondo arancione) e indotto (sfondo rosso), 48 o 72 ore dopo la fecondazione (HPF) embrioni di zebrafish (numeri bianchi o neri, rispettivamente) a 4 ore dopo l'aggiunta di PMA. La media è calcolata per i campioni non-indotti.
| 48 embrioni HPF | 72 embrioni HPF | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Dire | 758 | 230 | |||
| 48 embroys HPF + PMA | 72 embrioni HPF + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tabella 2. Normalizzazione e confronto statistico dei dati. Per ottenere valori di fluorescenza normalizzato, calcolare la differenza tra ogni valore di fluorescenza indotta da PMA e il valore medio di un-indotta appropriato. Statisticamente confrontare queste due serie di dati utilizzando un t-test spaiato. Calcolare le medie e le deviazioni standard. Visualizzare le medie, deviazioni standard, e p-value (s) in forma grafica (come in Figura 2).
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Discussion
La funzione primaria di fagociti è quello di rilevare, inghiottire e distruggere gli agenti patogeni. La capacità dei fagociti di produrre un burst respiratorio adeguato è fondamentale per questa funzione. Pertanto, la quantificazione della risposta burst respiratorio è un metodo per permettere il confronto di salute generale e la funzione immunitaria innata tra gruppi di individui e / o in risposta a manipolazioni sperimentali. Qui, descriviamo un protocollo per indurre, quantificare e confrontare la risposta burst respiratorio tra i gruppi di singoli embrioni di zebrafish. In breve, PMA risultato è la produzione di ROS dal ossidasi NADPH. Questi ROS agiscono su un colorante non fluorescente e ossidano per formare un composto fluorescente. Un lettore di micropiastra viene usato per rilevare la fluorescenza relativa a ciascun pozzetto. Fluorescenza generata dopo induzione PMA è indicativo del potenziale burst respiratorio e generale salute del sistema immunitario innato di embrioni di zebrafish. Confronto del livello normalizzato di fluorescenza tra PMA gruppi indotti utilizzando un t-test per dati non appaiati può essere utilizzato per determinare se vi è una differenza significativa nel potenziale burst respiratorio tra gruppi di zebrafish. Manipolazioni sperimentali conseguente differenze significative nella risposta burst respiratorio forniranno informazioni sui meccanismi dell'immunità innata, ad esempio, prodotti genici necessari per il burst respiratorio dei fagociti, i farmaci che potenziano o antagonizzano la risposta burst respiratorio.
Sono stati sviluppati protocolli per Assay diversi aspetti della risposta immunitaria innata nel modello zebrafish (vedi introduzione). Relativamente pochi di queste tecniche misurare la produzione di ROS. La tecnica descritta in questo articolo quantifica la produzione di ROS in embrioni di zebrafish dopo stimolazione di una risposta immunitaria innata con PMA. Questa tecnica è simile al test burst respiratorio eseguite su campioni di sangue intero isolato, in cui PMA viene utilizzato anche per induce una risposta burst respiratorio, e poi il ROS generato è valutato con un substrato fluorogenico (ad esempio Phagoburst, Orpegen Pharma). Il metodo qui descritto può essere utilizzato con interi embrioni di zebrafish, nonché reni sezionati da zebrafish adulti 13, come il rene anteriore zebrafish è analogo al midollo osseo umano, che è il sito di ematopoiesi adulti 19. Il metodo qui descritto è anche abbastanza versatile per essere utilizzato con altre specie di pesci e sistemi cellulari, come preparazioni di cellule provenienti da reni Cavedano americano 20.
Un metodo alternativo per rilevare ROS in interi embrioni di zebrafish fa uso di un sensore vivo perossido di idrogeno in. RNA messaggero per una proteina fluorescente redox sensibili viene iniettato in embrioni di zebrafish e il rapporto di fluorescenza viene monitorata nel tempo a seguito pinna caudale ferendo 21. Questo sensore redox geneticamente codificato consente di visualizzare la temporale edinamica spaziale di produzione di perossido di idrogeno in vivo. L'applicazione di questo metodo ha rivelato il risultato sorprendente che il perossido di idrogeno prodotto di arrivo inizialmente preceduto delle prime cellule immunitarie innate, suggerendo che il perossido di idrogeno rilasciato dalle cellule epiteliali feriti funge da segnale di reclutare fagociti 21. Questa tecnica, mentre il potente e informativo, comporta in termini di tempo e tecnicamente difficili procedure embriologici e microscopia. Questo sensore redox è specifico per il perossido di idrogeno, che è solo una delle tante ROS funzionamento durante la risposta immunitaria innata.
Rispetto al metodo discusso in precedenza, il nostro metodo di misura anche in vivo ROS, eppure è tecnicamente meno impegnativo e utilizza una sostanza chimica per indurre una risposta immunitaria innata piuttosto che una ferita fisica. In contrasto con il metodo di cui sopra, che misuri specificamente produzione di perossido di idrogeno, misura la nostra proceduralivello complessivo del ROS. Un vantaggio di rilevare un singolo ROS è che i ruoli per quel composto, solo innata possono essere chiarite. Simile al metodo discusso sopra, il nostro approccio condivide i vantaggi e svantaggi di essere eseguita in tutta animale. Le interazioni tra fagociti e il loro ambiente, che vengono eliminati quando saggi burst respiratorio vengono eseguiti su campioni di sangue isolate, sono conservati in questi saggi animali interi. Tuttavia, l'uso di tutta l'animale che si traduce nella rilevazione di ROS da fonti non fagociti (ad es mitocondrialmente-derivati ROS, nonphagocyte NADPH ossidasi). Nel tentativo di affrontare la specificità del nostro metodo per la rilevazione fagociti derivati da ROS, abbiamo fatto riferimento ad uno studio in cui questo saggio burst respiratorio è stato eseguito in embrioni di zebrafish manca specifico fagociti NADPH ossidasi 9. Specifico fagociti NADPH ossidasi è stata inibita mediante bussare morpholino-mediata giù di p47phox o p91pproteine di dialogo. In embrioni di zebrafish, allo stadio di sviluppo dosati, l'espressione di queste subunità NADPH ossidasi è limitato a un sottoinsieme di cellule del sangue, probabilmente macrofagi 22,23. Il potenziale burst respiratorio di embrioni privi di specifica-fagociti NADPH ossidasi è stato di circa un terzo di quello dei controlli 9 (comunicazione personale, il dottor Robert Wheeler). Questo risultato suggerisce che mentre il saggio burst respiratorio fa rilevare ROS da fonti diverse fagociti, la maggioranza della fluorescenza rilevata può essere attribuito al burst respiratorio tramite fagociti NADPH ossidasi. Ulteriore specificità di questo saggio è stata dimostrata utilizzando bis-indolylmaleimide I (Bisi), un inibitore farmacologico della proteina chinasi C, per evitare che l'azione di PMA, un agonista della proteina chinasi C, il NADPH ossidasi. Pre-trattamento del rene zebrafish PMA-indotte o embrioni con Bisi determinato livelli di fluorescenza simili ai controlli non-indotta 12. Un respiratoria idealesaggio scoppio sarebbe un high-throughput test in vivo, dove specifico fagocita ROS potrebbe essere sia quantificato e visualizzati nel corso del tempo. Fino a quando questo è possibile, la natura rapida e facilità tecnica del metodo qui descritto fornisce una utile alternativa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Kim, Mark Nilan per la cura e la manutenzione zebrafish, il Dr. Robert Wheeler per utili discussioni e la condivisione dei dati, e le sovvenzioni NIH 3RO1GM087308-02S1 e 1P20RR024475-01A2 e il Maine Agricole e Forestali Esperimento Stazione (Numero della pubblicazione 3303) per il finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
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