Summary
Det medfödda immunförsvaret skyddar organismer mot patogen infektion. En kritisk del av det medfödda immunförsvaret, fagocyten respiratory burst genererar reaktiva syreföreningar som dödar invaderande mikroorganismer. Vi beskriver en respiratory burst analys som kvantifierar reaktiva syreradikaler som produceras när det medfödda immunsvaret är kemiskt inducerad.
Abstract
Den fagocyt respiratory burst är en del av det medfödda immunsvaret mot patogeninfektion och innebär produktion av reaktiva syreradikaler (ROS). ROS är giftiga och fungera för att döda fagocytiserade mikroorganismer. In vivo kvantifiering av fagocyt-derived ROS ger information om en organism förmåga att montera ett robust medfödda immunsvaret. Här beskriver vi ett protokoll för att kvantifiera och jämföra ROS i hela zebrafisk embryon vid kemisk induktion av fagocytsystemet respiratory burst. Metoden använder sig av en icke-fluorescerande förening som blir fluorescerande vid oxidation av ROS. Enskilda zebrafiskembryon pipetteras i brunnar i en mikroplatta och inkuberades i detta fluorogent substrat med eller utan en kemisk inducerare av respiratory burst. Fluorescens i varje brunn kvantifieras vid önskade tidpunkter med hjälp av en mikroplattläsare. Fluorescens avläsningar justeras för att eliminera bakgrunds fluorescens och compared hjälp av ett oparat t-test. Denna metod gör det möjligt att jämföra den respiratory burst potential zebrafisk embryon i olika utvecklingsstadier och som svar på experimentella manipulationer såsom protein knockdown, överuttryck eller behandling med farmakologiska medel. Denna metod kan också användas för att övervaka andningsskursvar i hela dissekerades njurarna eller cellpreparat från njurar hos vuxna zebrafisk och några andra fiskarter. Vi tror att den relativa enkelheten och anpassningsförmåga av detta protokoll kommer att komplettera befintliga protokoll och kommer att vara av intresse för forskare som vill bättre förstå det medfödda immunsvaret.
Introduction
Immunförsvaret består av två grenar: medfödd och adaptiv immunitet. Medfödd immunitet är evolutionärt mer gammal än adaptiv immunitet. Ryggradslösa djur är för närvarande tros ha endast medfödd immunitet, medan ryggradsdjur besitter både det medfödda och adaptiva grenar. Även adaptiv immunitet ger specifik och långvarig immunitet mot vissa patogener, är medfödd immunitet ett omedelbart svar på invaderande bakterier, virus och svampar. En viktig aspekt av det medfödda immunsvar involverar frisättning av cytokiner och kemokiner, som resulterar i inflammation och rekrytering av fagocyter (t ex makrofager, neutrofiler) att uppsluka och förstöra främmande inkräktare.
Framgångsrika medfödda immunsvar involverar: (1) erkännande av invaderande mikroorganismer, (2) induktion av lämpliga signaleringskaskader (t.ex. utsläpp av cytokiner och kemokiner), (3) ordentlig utveckling / tillräckligt många fagocytceller, (4) Migrering av fagocyter till webbplatser på infektion, (5) omvälvning av patogener, och (6) förstörelse av uppslukade mikroorganismer. Brist på någon av dessa åtgärder skulle kunna leda till värd bli överväldigade av, och ge efter för, infektionen. En robust medfödda immunsvar är avgörande för hälsan hos organismer eftersom det är den första försvarslinjen mot patogener i alla växter och djur. I ryggradsdjur, potentierar den även det adaptiva immunsvaret ett. Därför är det viktigt att vi har möjlighet att utvärdera alla aspekter av det medfödda immunsvaret för att bättre förstå den och att optimera dess funktion.
Många modellorganismer som används för att studera medfödd immunitet, från Arabadopsis till C. elegans till Drosophila till möss till odlade humana celler. En fördel med att använda zebrafisk (Danio rerio) modellsystem för att studera medfödd immunitet är att zebrafisk är ett ryggradsdjur, med både medfödda och adaptiva imskapen, men utvecklingen av medfödd och adaptiv immunitet är tidsmässigt segregerade. Zebrafisk enbart förlita sig på medfödd immunitet för skydd mot infektion tills adaptiv immunitet blir fullt fungerande, vilket sker cirka 4-6 veckor efter befruktning 2. Förutom verktyg för genetisk manipulation, optisk klarhet och snabb, extern utveckling, medfödd immunitet som principen sättet försvar i zebrafisk embryon ger en förenklad modell där för att studera komplexiteten i det medfödda immunsvaret in vivo.
Flera protokoll har utvecklats för att utvärdera olika aspekter av det medfödda immunsvaret i zebrafisk embryon. Microarrays och RNAseq har validerat att cytokinprofiler som framkallas av den zebrafisk medfödda immunsvar är liknande till det av människor och har också föreslagit medverkan av oväntade gener i medfödd immunitet 3,4. Insynen i zebrafisk embryot och fluorescerande, transgenic stammar av patogener och zebrafisk möjliggör visualisering av dynamiska värd-patogen interaktioner in vivo i realtid. Transgena zebrafisk embryon som uttrycker GFP under kontroll av neutrofila specifika myeloperoxidas promotor 5,6 eller makrofag-specifika MPEG1 promotorn 7 har gjort det möjligt att visualisera och kvantifiera phagocyte migration till platser av lokala infektioner 8 samt att visualisera fagocytos och förstörelse av märkt med fluorescens patogener 8,9. Zebrafisk embryon är också mottagliga för generering av hög kapacitet för analyser och kemiska skärmar. Följaktligen har hög kapacitet metoder transkriptomanalys vid infektion 10 och phagocyte migration till platser av kemiskt inducerad skada 11 nyligen utvecklats.
Av de metoder som anges ovan, inget kvantitativt bedöma den sista etappen av patogen förstörelse av fagocyter. Det sista stegetinnebär en respiratory burst (dvs. produktion av ROS och andra giftiga föreningar), som dödar de uppslukade patogener. Enzymet NADPH-oxidas är en viktig källa för ROS i fagocyterande celler. Montering av subenheterna av NADPH-oxidasenzymresulterar i överföringen av elektroner till syre, generera superoxidanjoner. Genom efterföljande enzymatiska reaktioner, kan superoxid sedan omvandlas till väteperoxid och underklorsyrlighet (Figur 1A). Det är den respiratoriska utbrott av fagocyter som dödar patogener och sålunda är en indikation på total medfödda immun hälsa kvantifieringen av respiratory burst potential zebrafiskembryon. Vi utvecklade en fluorescensbaserad analys för att kvantifiera den respiratoriska utbrott i grupper av enskilda zebrafiskembryon 12. Denna analys utnyttjar den icke-fluorescerande, reducerad form av en kommersiellt tillgänglig, cellgenomsläppliga färgämnet. Detta färgämne, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA), omvandlas till de lysrörcent förening, 2 ', 7'-diklorfluorescein (DCF), vid oxidation. De olika ROS genereras av fagocytsystemet respiratory burst kan oxidera H2DCFDA och generera fluorescens 24. Uppträdandet av fluorescens kan användas för att kvantifiera och jämföra respiratory burst svar mellan grupper av zebrafisk. Proteinkinas C-agonist forbolmyristatacetat (PMA) användes för att kemiskt förmå NADPH-oxidas för framställning av ROS och därmed öka fluorescensavläsningar (Figur 1B). Häri ger vi ett detaljerat protokoll av en modifierad och optimerad version av denna zebrafisk embryo respiratory burst-analys. Denna analys kan användas för att jämföra den respiratory burst mellan grupper av enskilda zebrafiskembryon över tid och / eller till följd av experimentella manipulationer (t.ex. morfolino-förmedlad protein knockdown). Användningen av denna metod, tillsammans med andra zebrafisk medfödd immunitet analyser, kommer att ge en mer fullständig bild av den komplexa och kritiskamedfödda immunsvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zebrafish Skötsel och underhåll
- Uppfödnings: Mass spawn vuxna zebrafisk, såsom tidigare beskrivits 13. Samla spawned embryon som tidigare beskrivits 14.
- Mikroinjektion (om så önskas): mikroinjicera 1-4 cell skede zebrafisk embryon med morpholino oligonukleotider att knockdown genprodukter eller mRNA för att överuttrycker genprodukter som tidigare beskrivits 15.
- Upprätthålla en tillräcklig pool av mock injicerade kontroller (minst 48 levande, håna injicerade kontroll fisk och 48 levande, behövs experimentellt manipulerade fisk för att fylla en 96 väl mikroplatta).
- Behåll embryon: Grow embryon i djupa petriskålar vid 28 ° C i ägg vatten (60 mikrogram / ml Omedelbar Ocean Sea Salt i destillerat vatten-autoklaveras) tills önskad utvecklingsstadiet (en andnings burst svar inte kan spåras med hjälp av detta protokoll i zebrafisk embryon yngre än 2 dagar efter befruktning 12). OBS: Det har varit observed att förhindra pigmentering i zebrafisk embryon antingen genom användning av 1-fenyl-2-tiourea (PTU) eller golden/slc24a5 mutant zebrafisk inte signifikant ändrar induktionen av fluorescens från PMA (opublicerade data, embryon testade vid 48, 72 och 96 HPF).
- Ta bort döda embryon dagligen med en plast överföringspipett.
- Häll försiktigt gamla ägg vatten och fylla på med nya ägg vatten dagligen.
- Dechorionate embryon: På dagen för experimentet, dechorionate embryon (om embryon är fortfarande i sina chorions) som tidigare beskrivits med hjälp av två fin pincett 14 (denna respiratory burst-analys kan också utföras på dissekerade njure från vuxna zebrafisk 12 och detaljerade protokoll för njure dissektion från vuxna zebrafisk har tidigare beskrivits 16,17).
2. Lösning Beredning
- Bered en stamlösning av H2DCFDA: Väg upp 1 mg H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg H2DCFDA i 1 ml dimetylsulfoxid (DMSO) för att göra en 1 mg / ml stamlösning.
- Gör 22 l alikvoter av denna stamlösning i 1,7 ml mikrorör.
- Slå in portioner av H2DCFDA stamlösning i aluminiumfolie och förvara i mörker när det är möjligt eftersom H2DCFDA är ljuskänsligt.
- Affär H2DCFDA alikvoter vid -20 ° C i upp till 3 månader.
- VARNING - Bered en stamlösning av forbolmyristatacetat (PMA): Väg upp 1 mg PMA använda lämplig personlig skyddsutrustning (t.ex. handskar, skyddsglasögon och mask).
- Lös PMA i 1 ml DMSO för att göra en 1 mg / ml stamlösning.
- Gör 11 l alikvoter i 1,7 ml mikrorör.
- Förvara alikvoter av PMA stamlösning vid -80 ° C i upp till 3 månader.
- Bered en arbetslösning av H2DCFDA: På dagen för experimentet, gör en H2DCFDA arbetslösning genom att tillsätta en del H2DCFDA stamlösning till endel DMSO (500 ^ g / ml H2DCFDA slutlig koncentration). Till exempel lägga till 20 l av H2DCFDA stamlösning och 20 pl DMSO till en folie inslaget 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Bered en arbetslösning av PMA: På dagen för experimentet, gör en PMA arbetslösning genom att tillsätta en del PMA stamlösning till 49 delar nukleas fritt vatten (20 | ig / ml PMA slutlig koncentration). Exempelvis kan utspädda 10 il PMA stamlösning i 490 pl nukleasfritt vatten i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Bered en doseringslösning av H2DCFDA: På dagen för experimentet, gör en H2DCFDA doseringslösning med en slutkoncentration av 1 | ig / ml H2DCFDA i ägg vatten. De framställda volymer av doseringslösningarna kan modifieras såsom önskas, utan att säkerställa att de slutliga koncentrationerna av reagensen bibehålls. För njurarna, i stället för ägg vatten, använda samma volym av Dulbeccos modifierade Eagles medium/F-12 (50% DMEM, 50% F-12, utan fenolrött). För att göra 5 ml H2DCFDAdoseringslösning, använd en 5 ml serologisk pipett för att överföra 5 ml ägg vatten (eller DMEM/F-12) i en 15 ml koniskt centrifugrör insvept i folie och märkta "H".
- Ta bort 10 l av ägg vatten (eller DMEM/F-12) från 15 ml koniska rör märkta "H" och kasta.
- Tillsätt 10 pl av H2DCFDA arbetslösning in i 15 ml koniska rör märkt "H" och virvel för att blanda (denna volym är tillräckligt för 48 embryo-eller njurprover (halv av en full 96 brunnars mikroplatta) och dessa brunnar kommer att tillhandahålla mätningar av nivån av bakgrundsfluorescens).
- Bered en doseringslösning av H2DCFDA + PMA: På dagen för experimentet, göra en H2DCFDA + PMA doseringslösning med slutliga koncentrationer av: H2DCFDA - 1 mikrogram / ml och PMA - 400 ng / ml. För att 5 ml H2DCFDA + PMA doseringslösning, använd en 5 ml serologisk pipett för att överföra 5 ml av ägg vatten (eller DMEM/F-12) i en ny 15 ml koniska rör märkt "H + P".
- Avlägsna 110 _6, l ägg vatten (eller DMEM/F-12) från 15 ml koniska rör märkta "H + P" och kasta.
- Tillsätt 10 pl av H2DCFDA arbetslösning, tillsätt sedan 100 | il av PMA arbetslösning in i 15 ml koniska rör märkt "H + P 'och vortex för att blanda (denna volym är tillräckligt för 48 prover eller den andra hälften av en full 96 brunnars mikroplatta ).
- Förvara doseringslösningar på is.
3. Mikroplattläsare Programmering
- Förbered instrument: Sätt på mikroplattläsare.
- Värm upp ljuskällan.
- Inrätta ett program för att läsa fluorescens: t.ex. Excitering: 485 nm, emission: 528 nm, Optik Position: topp 510 nm, Känslighet: 65, med en 5 sek skaka steget före läsning.
4. 96 brunnars mikro Set Up (se figur 2)
- Samla förnödenheter: Skaffa rätter med dechorionated embryon, svart 96 väl mikroplatta, p200 pipett ochtips, ishink med H2DCFDA och H2DCFDA + PMA doseringslösningar, flerkana P200 pipett, två sterila behållare, aluminiumfolie och saxar.
- Överlåta en av embryo i varje brunn i en 96 väl mikroplatta: Använd en sax för att klippa en pipettspetsen så att embryon eller njurarna in genom öppningen.
- Ställ in en p200 pipett till 100 | il och överföra ett embryo tillsammans med ägg vatten (eller DMEM/F-12) i så många av de brunnar i en svart 96 brunnars mikroplatta som önskas (det är inte nödvändigt att byta pipettspets för varje annorlunda embryo prov inom ett experimentellt tillstånd, men det kan vara nödvändigt att byta spetsar mellan experimentella förhållanden). Var noga med att undvika att överföra rest chorions, eftersom dessa tenderar att förvränga data som samlas in. För överföring av njurarna, kan en större volym pipett (satt till 100 l) användas och pipettspetsar kan kapas för att få en större borrning storlek, om det behövs. Det kan vara nödvändigt att inkorporera brunnar utan embryo eller njurprover, men meddoserings lösningar för att styra om en del experimentella manipulationer.
- Lägg doseringslösningar: Häll H2DCFDA doseringslösning i en steril 25 ml reservoar.
- Använd en flerkanalig p200 pipett och åtta tips för att samtidigt pipett 100 pl av H2DCFDA doseringslösning i en kolonn på 96 brunnars mikroplatta (500 ng / ml slutlig koncentration av H2DCFDA).
- Upprepa detta (att byta tips är inte nödvändigt) för att så många kolumner som önskas (vanligtvis sex kolumner eller 48 brunnar om att fylla hela 96 väl mikroplatta). Lägg denna lösning till hälften av kontrollembryoprov och hälften av de experimentellt manipulerade embryoprov (ett exempel 96 väl mikro inrättat visas i figur 2, dessa brunnar (orange färg) kommer att ge bakgrundsfluorescensdata i proverna inte inducerade med PMA) .
- Häll H2DCFDA + PMA doseringslösning i en ny, steril 25 ml reservoar.
- Använd en flerkanalig P200 pipett och åtta tips för att simultaneously Pipettera 100 ul av H2DCFDA + PMA doseringslösning till de återstående kolumnerna (rödfärgat i figur 2) hos 96 brunnars mikroplatta (byte tips är inte nödvändigt, slutkoncentrationer av H2DCFDA-500 ng / ml och PMA-200 ng / ml) .
- Täck mikroplattan med aluminiumfolie.
- Skaka mikroplattan under ca 20 s vid 150 rpm för att homogenisera de tekniska lösningarna i varje brunn.
- Inkubera mikroplattan vid 28 ° C när den inte läses.
5. Fluorescens Kvantifiering
- Läs mikroplattan vid tid = 0 h efter tillsatsen av PMA med användning av de parametrar som beskrivs i steg 3.1.2.
- Fortsätt att ta mätningar med några minuter för önskat tidsintervall eller inkubera folien inslagna mikro vid 28 ° C tills en senare tidpunkt, och sedan ta en slutpunkt mätning på en viss tid (t.ex. 4 timmar efter tillsats av PMA).
- Använd en plast tverför pipett för att hämta embryon från brunnarna.
- Euthanize embryon enligt din djuromsorg och användningsprotokoll, t.ex. nedsänkning i tricaine MS222.
- Släng mikroplattan och andra engångsmaterial i avfallsbehållaren biologiskt farliga.
6. Dataanalys
- Bestäm den tidpunkt vid vilken man vill jämföra fluorescensvärdena (t.ex. 4 h efter tillsatsen av PMA, Tabell 1).
- Subtrahera den genomsnittliga un-inducerad kontrollgruppens fluorescens värde från individen PMA-inducerad styrgruppens fluorescensvärden.
- Upprepa detta för den experimentella gruppen med och utan PMA.
- Förvara dessa normaliserade fluorescens värden i två kolumner, kontroll + PMA gruppen respektive försöks + PMA-gruppen (Tabell 2).
- Beräkna medelvärden och standardavvikelser för de normaliserade fluorescens värden för kontroll + PMA Group och den experimentella + PMA grupp.
- Jämför de normaliserade fluorescensvärdena med användning av ett oparat t-test för att bestämma statistisk signifikans (tabell 2).
- Diagram medlen för kontroll + PMA gruppen respektive försöks + PMA-gruppen med felstaplar som återspeglar de standardavvikelser.
- Notera den signifikansnivå på kurvan och i figuren legend (Figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här ger vi data som jämför den respiratory burst svar i zebrafiskembryon (vildtyp, AB bakgrund) vid 48 och 72 timmar efter befruktning (HPF). De 48 HPF embryon agerade som vår kontrollgrupp och 72 HPF embryon som vår försöksgrupp. Urvalsstorleken som användes var 24 un-inducerade embryon och 24 PMA-inducerade embryon per utvecklingsstadiet. Råa Fluorescensavläsningar (i relativa fluorescensenheter (RFU)) erhölls genom avläsning av mikroplattan 4 timmar efter tillsats av PMA. Råa fluorescensvärden ges i tabell 1. Råa fluorescensvärden var genomgående högre i de 48 HPF un-inducerade embryon än 72 HPF un-inducerade embryon, med undantag av en 72 HPF embryo (medel: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU). Variationen inom dessa två prover var ungefär lika (standardavvikelser: 48 HPF = ± 549 RFU, 72 HPF = ± 513 RFU), men den 72 HPF gruppen varierade mer i förhållande till medelvärdet (standard deviation som en procentandel av medelvärdet: 48 HPF = 72%, 72 HPF = 223%). På PMA-inducerade grupper, råa fluorescensvärden var mestadels högre i 72 HPF befolkningen (medel: 48 HPF PMA = 3798 RFU, 72 HPF PMA = 5825 RFU). Det var mer variation i 72 HPF PMA-inducerad grupp än 48 HPF PMA-inducerad gruppen (standardavvikelse: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1365 RFU), men variationen i förhållande till medelvärdet var ungefär lika (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
För att ta hänsyn till variationer i bakgrundsnivåerna av fluorescens, var normaliserade fluorescens-värden beräknas (PMA-inducerad minus medelvärdet för de un-inducerade värden på lämpliga utvecklingsstadiet). Dessa normaliserade fluorescens värden finns i tabell 2, tillsammans med de medel, standardavvikelser, och p-värde för de 48 och 72 HPF grupper. Ett diagram över dessa data ges i figur 2. De normaliserade fluorescens värdena är genomgående hid högre i 72 HPF grupp än 48 HPF gruppen (betyder: 48 HPF = 3040 RFU, 72 HPF = 5596 RFU) och variabiliteten är liknande med avseende på medelvärdet (48 HPF = 27%, 72 HPF = 24%). Denna respiratory burst analys visade att 72 HPF zebrafisk embryon kan producera mer ROS och därmed montera en mer robust andnings burst respons än 48 HPF embryon efter induktion med PMA. Detta resultat kan bero på ett ökat antal celler, däribland ett ökat antal granulocyter 18, i 72 HPF embryon jämfört med 48 HPF embryon. Ett oparat t-test för att statistiskt jämföra data bekräftade att den respiratoriska utbrott svaret skiljer sig signifikant i 72 HPF embryon än 48 HPF embryon (* p = 2 X 10 -9).
I en mer allmän bemärkelse, vid tidpunkten t = 0 h efter tillsatsen av PMA, de råa fluorescensvärdena bör inte vara statistiskt olika mellan PMA-inducerade och un-inducerad grupper. De råa fluorescensvärdena kommer i ökandee över tiden i både FN-inducerade och inducerade prover, med en mycket större ökningen sker i PMA-inducerade embryon 12. Ökningen av de råa fluorescensvärdena i PMA-inducerad gruppen, jämfört med den icke-inducerade grupp, kommer att bli statistiskt signifikant vid ca 1-2 timmar efter tillsatsen av PMA (beroende på utvecklingsstadiet av de zebrafiskembryon, med äldre embryon montera en snabbare respiratory burst respons än yngre embryon). Normaliserade fluorescensvärden (inducerad minus un-inducerad) bör öka med den ökande utvecklingsstadiet av zebrafisk embryon, med den största skillnaden inträffar mellan 48 och 72 timmar efter befruktning och en mindre skillnad inträffar mellan 72 och 96 timmar efter befruktning. Raw fluorescens nummer bör vara 5 till 60 gånger högre i PMA-inducerad Gruppen jämfört med un-inducerad grupp, beroende på utvecklingsstadiet av zebrafisk embryon (mellan 48 och 96 timmar efter befruktning). Variationkommer att ske mellan enskilda zebrafisk embryo prover, alltså, rekommenderas det att cirka 24 embryo prov per behandling användas.
Figur 1. Diagram av kemisk induktion av andnings brast inom en fagocytsystemet. (A) I denna respiratory burst assay är PMA används för att inducera produktion av superoxidanjoner av NADPH-oxidas. Superoxid omvandlas till syre och väteperoxid av superoxiddismutas. Väteperoxid och kloridanjoner omvandlas till klorsyrlighet genom myeloperoxidas. Den icke-fluorescerande färgämne, H2DCFDA, omvandlas till den fluorescerande föreningen, DCF, då den oxideras av många olika ROS. (B) Diagram av hur kvantifiering av fluorescens är en skriv ur respiratory burst svar.
lt = "Bild 2" fo: innehåll-width = "4.5in" src = "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
Figur 2. Schematisk bild av den experimentella utformningen för respiratory burst assay. Individuell dechorionated zebrafisk embryon överförs till brunnarna i en 96 brunnars mikroplatta. Brunnarna som beskrivs i vitt innehålla kontroll embryon och brunnarna som skisseras i svart innehåller embryon från experimentgruppen. H2DCFDA eller H2DCFDA + PMA doseringslösningar läggs till lämpliga brunnar (färgade orange eller röd, respektive). Fluorescens kvantifierades med användning av en mikroplattläsare. Respiratory burst assay data analyseras därefter, jämföras och presenteras. Tabellen i denna figur är en delmängd av de normaliserade fluorescensvärden som visas i Tabell 2. I diagrammet i denna figur inbegriper anordningar, standardavvikelser och p-värdet för hela datauppsättningen som presenteras i detta manuskript, som också visas i Tabell 2. * P = 2 X 10 - 9.
Tabell 1. Raw fluorescensvärden från un-inducerad (orange bakgrund) och inducerade (röd bakgrund) 48 eller 72 h efter befruktning (HPF) zebrafiskembryon (vita eller svarta siffror, respektive) vid 4 h efter tillsats av PMA. Medelvärdet beräknas för de un-inducerade prover.
| 48 HPF embryon | 72 HPF embryon | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Medelvärde | 758 | 230 | |||
| 48 HPF embroys + PMA | 72 HPF embryon + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tabell 2. Normalisering och statistisk jämförelse av data. För att erhålla normaliserade fluorescensvärden, beräkna skillnaden mellan varje PMA-inducerad fluorescens värde och lämpliga FN-inducerad medelvärde. Statist jämföra dessa två uppsättningar av data med hjälp av ett oparat t-test. Beräkna de medelvärden och standardavvikelser. Visa de medel, standardavvikelser, och p-värde (er) i grafisk form (som i figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den primära uppgiften för fagocyter är att upptäcka, uppsluka, och förstöra patogener. Förmågan hos fagocyter att producera en tillräcklig respiratory burst är kritisk för denna funktion. Således är kvantifiering av respiratory burst svar en metod för att möjliggöra jämförelser av allmänna medfödda immun hälsa och funktion mellan grupper av individer och / eller som svar på experimentella manipulationer. Här beskriver vi ett protokoll för att framkalla, kvantifiera och jämföra den respiratory burst svar mellan grupper av enskilda zebrafisk embryon. Kort sagt, resulterar PMA i produktionen av ROS av enzymet NADPH-oxidas. Dessa ROS verka på ett icke-fluorescerande färgämne och oxidera den för att bilda en fluorescerande förening. En mikroplattläsare användes för att detektera den relativa fluorescensen i varje brunn. Fluorescens genereras vid PMA-induktion är indikativ för den respiratory burst potential och allmän medfödda immun hälsan hos zebrafiskembryon. Jämförelse av den normaliserade nivån av fluorescens mellan PMA inducerade grupper med ett oparat t-test kan användas för att avgöra om det finns en signifikant skillnad i andnings burst potential mellan grupper av zebrafisk. Experimentella manipulationer som resulterar i betydande skillnader i andnings burst svar kommer att ge insikter i mekanismerna för medfödd immunitet, t.ex. genprodukter som krävs för att fagocytsystemet respiratory burst, droger som förstärker eller motverkar andnings burst svar.
Protokoll för att analysera olika aspekter av det medfödda immunsvaret i zebrafisk-modellen har utvecklats (se Inledning). Relativt få av dessa tekniker mäter produktionen av ROS. Tekniken beskrivs i denna artikel kvantifierar produktion av ROS i zebrafisk embryon vid stimulering av en medfödd immunsvar med PMA. Denna teknik liknar respiratory burst-analyser utförda på isolerade helblod, där PMA är också används för att induCE A respiratory burst svar och sedan ROS genereras mäts med användning av ett fluorogent substrat (t.ex. Phagoburst, Orpegen Pharma). Den metod som beskrivs här kan användas med hela zebrafiskembryon, samt dissekerade njure från vuxna zebrafisk 13, som zebrafisk främre njuren är analog med human benmärg, som är platsen för en vuxen hematopoies 19. Den metod som beskrivs här är också mångsidig nog att användas med andra fiskarter och cellsystem, till exempel cellpreparat från amerkansk elritza njurar 20.
En alternativ metod för att upptäcka ROS i hela zebrafisk embryon använder sig av en in vivo väteperoxid givare. Messenger-RNA för en redox-känsliga fluorescerande protein injiceras i zebrafisk embryon och fluorescensförhållandet övervakas över tiden efter stjärtfenan såra 21. Denna genetiskt kodade redox-sensor tillåter visualisering av den tidsmässiga ochrumslig dynamik väteperoxidproduktion in vivo. Tillämpning av denna metod visade det överraskande resultatet att väteperoxiden som produceras initialt föregås ankomsten av de första medfödda immunceller, vilket antyder att väteperoxid frigörs av skadade epitelceller fungerar som en signal för att rekrytera fagocyter 21. Denna teknik, medan kraftfulla och informativa, innebär tidskrävande och tekniskt svåra embryologiska och mikroskopi förfaranden. Denna redox-sensor är också specifikt för väteperoxid, som är bara en av de många ROS fungerar under det medfödda immunförsvaret.
I jämförelse med den metod som diskuteras ovan, vår metod mäter också in vivo ROS, och ändå är tekniskt mindre krävande och använder en kemikalie för att inducera ett inneboende immunsvar snarare än en fysisk sår. I motsats till ovanstående metod, som specifikt mäter väteperoxidproduktionen, mäter vårt förfarande dentotala nivån av ROS. En fördel med att upptäcka en enda ROS är att roller för att föreningen ensam i medfödd immunitet kan belysas. I likhet med den ovan diskuterade metoden, vårt tillvägagångssätt delar också de inneboende fördelar och nackdelar med att utföras i hela djuret. Samspelet mellan fagocyter och deras omgivning, som elimineras vid andnings burst analyser utförs på isolerade blodprover, finns bevarade i dessa hela djuranalyser. Men användningen av hela djuret resulterar sannolikt i upptäckt av ROS från icke-phagocyte källor (mitokondriellt-härledda ROS, nonphagocyte NADPH-oxidas). I ett försök att ta itu med specificitet vår metod för att detektera phagocyte-derived ROS hänvisade vi till en studie där denna respiratory burst Analysen utfördes i zebrafisk embryon som saknar phagocyte specifika NADPH-oxidas 9. Phagocyte specifika NADPH-oxidas hämmades via morfolino-medierad knock down av p47phox eller p91pHOX-proteinet. I zebrafisk embryon, på utvecklingsstadiet analyseras, är ett uttryck för dessa NADPH-oxidas subenheter begränsas till en delmängd av blodkroppar, makrofager sannolikt 22,23. Den respiratory burst potential embryon saknar phagocyte specifika NADPH-oxidas var ungefär en tredjedel av kontrollerna 9 (personlig kommunikation, Dr Robert Wheeler). Detta resultat antyder att medan vår respiratory burst assay inte identifiera ROS från andra källor än fagocyter källor, kan den största delen av fluorescensen detekteras tillskrivas den respiratory burst via phagocyte NADPH-oxidas. Ytterligare särdrag hos denna analys visades med användning av bis-indolylmaleimide I (Bisi), en farmakologisk inhibitor av proteinkinas C, för att förhindra inverkan från PMA, en proteinkinas C-agonist på NADPH-oxidas. Förbehandling av PMA-inducerade zebrafisk njurarna eller embryon med Bisi ledde fluorescens nivåer liknande un-inducerade kontroller 12. En idealisk andningsbrast analys skulle vara en in vivo hög genomströmning analys där phagocyte specifika ROS kan både kvantifieras och visualiseras över tiden. Tills detta är möjligt, ger den snabba natur och tekniskt lätt att den här beskrivna metoden ett användbart alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för tidigare och nuvarande medlemmar av Kim laboratoriet, Mark Nilan för zebrafisk vård och underhåll, Dr Robert Wheeler för bra diskussioner och datadelning, och NIH bidrag 3RO1GM087308-02S1 och 1P20RR024475-01A2 och Maine Jordbruks-och skogs Experiment Station (publikationsnummer 3303) för finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.
