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Immunology and Infection

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l'uso di un solvente organico

Published: November 1, 2013 doi: 10.3791/50671
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono
* These authors contributed equally

Summary

Degranulazione dei mastociti, il rilascio di mediatori allergici, è importante per l'allergia, l'asma, e la difesa parassita. Qui mostriamo tecniche 1 per la valutazione degli effetti di farmaci e sostanze tossiche sulla degranulazione, metodologia recentemente utilizzato per esporre il potente effetto inibitorio di agente antibatterico triclosan 2.

Abstract

I mastociti svolgono un ruolo importante nella malattia allergica e la difesa immunitaria contro i parassiti. Una volta attivato (ad esempio da un allergene), essi degranulano, un processo che comporta la esocitosi di mediatori allergici. Modulazione di degranulazione dei mastociti da farmaci e sostanze tossiche può avere effetti positivi o negativi sulla salute umana. Funzione mastociti è stato sezionato in dettaglio con l'uso di ratto basofile mastociti leucemiche (RBL-2H3), un modello largamente accettato di mastociti mucosali umane 3-5. Mast componente cellulare dei granuli e il mediatore allergica β-hexosaminidase, che viene rilasciato linearmente in tandem con istamina dai mastociti 6, possono essere facilmente ed attendibilmente misurati tramite reazione con un substrato fluorogenico, cedendo misurabile intensità di fluorescenza in un saggio di micropiastra che è suscettibile di studi di high-throughput 1. Originariamente pubblicato da Naal et al. 1, abbiamo adattato questo dosaggio degranulazione per lo screening of farmaci e sostanze tossiche e dimostrare il suo uso qui.

Triclosan è un agente ad ampio spettro antibatterico che è presente in molti prodotti di consumo ed è stato trovato per essere un aiuto terapeutico in malattie allergiche della pelle umana 7-11, anche se il meccanismo di questo effetto è sconosciuta. Qui mostriamo un saggio per l'effetto del triclosan sulla degranulazione mastocitaria. Abbiamo recentemente dimostrato che il triclosan influenza fortemente la funzione delle cellule mast 2. Nel tentativo di evitare l'impiego di un solvente organico, triclosan è disciolto direttamente in tampone acquoso con il calore e agitazione, e la concentrazione risultante viene confermata mediante spettrofotometria UV-Vis (usando 280 ε = 4,200 L / M / cm) 12. Questo protocollo ha il potenziale per essere usato con una varietà di prodotti chimici per determinare i loro effetti sulla degranulazione dei mastociti, e più in generale, il loro potenziale allergico.

Introduction

I mastociti sono altamente granulato cellule immunitarie effettrici che fungono da mediatori chiave in asma, allergie, parassiti della difesa e della carcinogenesi 13-16. Essi risiedono in quasi ogni tessuto vascolarizzato 15, dove archiviare in modo sicuro i mediatori infiammatori e allergici in granuli citoplasmatici fino attivato per degranulano. Degranulazione è l'esocitosi di granuli legati alla membrana, che provoca il rilascio di mediatori farmacologicamente attivi come istamina, triptasi e leucotrieni 15. Questo processo determina l'avvio di tipo I reazioni di ipersensibilità che sono fondamentali per la difesa contro i parassiti di montaggio, nonché avviare le risposte allergiche, asma, e cancerogeni 15.

Mastociti e basofili esprimono recettori FcεRI, i recettori ad alta affinità per le immunoglobuline E (IgE) 17. Esposizione ad un allergene o antigene provoca aggregazione di più IgE-bound recettori FcεRI 17, ed è questa so-chiamato "reticolazione" di IgE-bound recettori Fc che avvia il processo di degranulazione: una cascata di eventi tirosin-fosforilazione, l'attivazione della fosfolipasi C, passaggio di calcio dai depositi interni e afflusso di calcio nelle cellule 18. Questo flusso di calcio è necessario per la degranulazione, e, inoltre, segnala granulo fusione con la membrana prima di causare granuli esocitosi 15. Sperimentalmente, un calcio ionoforo può essere usato per il calcio navetta direttamente attraverso la membrana cellulare 19, che bypassa essenzialmente tutto trasduzione del segnale passi prima della fase di afflusso di calcio 20, consentendo l'identificazione di un bersaglio percorso da una sostanza tossica come a monte oa valle dei segnalazione di calcio 20.

Degranulazione può essere misurata rapido ed efficace monitorando il rilascio di β-hexosaminidase nel supernatante cellulare, che viene rilasciata linearmente dai granuli accanto istamina 6, ma is molto più facile da rilevare con una semplice reazione enzima-substrato e di un lettore di micropiastre per saggiare il prodotto fluorescente. Questo saggio micropiastre, come dettagliato nella sezione del protocollo, si basa su un metodo robusto originariamente sviluppato da Naal et al. 1, che quantifica il clivaggio del substrato fluorogenico 4-metilumbelliferil-N-acetil-β-D-glucosaminide da β- hexosaminidase. Abbiamo modificato il dosaggio per gli effetti di test di farmaci e sostanze tossiche, con triclosan evidenziato qui. Questo metodo quantifica affidabile degranulazione, è un'alternativa economica a, per esempio, il flusso di metodi di rilevamento mediante citometria a base 21, e ha il potenziale per prestarsi bene a high-throughput screening di una vasta gamma di farmaci anti-allergia, così come immunotossico o prodotti chimici allergizzanti. Quest'ultimo punto è particolarmente importante alla luce del 2007 National Research relazione del Consiglio "Test di tossicità nel 21 ° secolo: una visione e di una Strattegia "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), che sostiene per lo sviluppo di test tossicologici high-throughput che utilizzano colture cellulari di ridurre l'uso di animali da laboratorio costoso tradizionali come topi. Il protocollo sviluppato da degranulazione Naal et al. 1 e modificato da noi 2, utilizza la linea cellulare RBL-2H3, che è un modello ben accettato omologa ai mastociti mucosali umani o basofili 3-5. (Metodi per la coltura di cellule RBL-2H3 sono dettagliate nel Hutchinson et al. 22). Questo dosaggio può probabilmente essere adattata a qualsiasi tipo mastociti allegata.

Triclosan (TCS) è un antimicrobico ad ampio spettro che è stato usato per più di 30 anni negli ospedali, per la cura personale e beni di consumo 23,24. La modalità di azione antimicrobica per la caratteristica di TCS è l'inibizione della biosintesi di acidi grassi, probabilmente inibendo enoil-acilproteina carrier reduttasi 25,26. Si trova in tutto il mondo in una vasta gamma di prodotti di consumo come gel doccia, lozione per le mani, dentifricio, collutorio, e in saponi a concentrazioni fino allo 0,3% o 10 mm 24. L'impiego diffuso di TCS ha portato a livelli rilevabili nell'uomo 27-29 e nei corsi d'acqua 30. Uno studio fatto da Allmyr et al. Ha dimostrato che 27 TCS e dei suoi metaboliti sono presenti sia nel plasma e latte di madri che allattano. È importante sottolineare che, TCS è facilmente assorbito nella pelle 31-37. Queckenberg et al. Trovato 37 ~ 10% l'assorbimento di un ~ 70 mm TCS crema nella pelle umana entro 12 ore, con conseguente significativa concentrazione nella pelle, dove i mastociti risiedono.

TCS è stato dimostrato clinicamente per la gestione della malattia allergica della pelle umana 7-11, ma il meccanismo con cui TCS allevia le malattie allergiche della pelle è rimasta sconosciuta 38. Usando la fluorescenza per micropiastre saggio detailed in questo video, abbiamo recentemente dimostrato che TCS, a concentrazioni a partire da 2 micron, attenua significativamente la funzione dei mastociti e degranulazione, fornendo una potenziale spiegazione per questi dati clinici 2. Oltre a fornire una spiegazione per questi dati clinici, i nostri risultati in Palmer et al. 2 suggeriscono che TCS rivolge molecole di segnalazione a valle del flusso di calcio. A causa dell'importanza del calcio segnalazione in molti immunologico e altri processi biologici, TCS potrebbe potenzialmente avere effetti negativi su un'ampia varietà di processi biologici necessari. Infatti, Udoji et al. Ha dimostrato che 39 TCS sopprime cellula attività umana natural killer litico, un altro importante funzione immunitaria innata.

Oltre al suo potenziale come un aiuto terapeutico nella malattia allergica della pelle (o, al contrario, come un immunotossico), TCS può anche essere un distruttore endocrino 40-49. Così, una procedura chiara su come preparare questa sostanza chimica in soluzione is di interesse per i tossicologi. Poiché TCS è una piccola molecola idrofobica, veicoli organici vengono spesso utilizzati per renderla più solubile in acqua. Nella maggior parte degli studi di tossicità in cui TCS è stato testato, preparato è coinvolto dissoluzione in acqua con l'ausilio di un solvente organico quale etanolo, acetone, o olio 2,50,51. Tuttavia, spesso questi solventi sono biologicamente attivi stessi, complicando in tal modo l'interpretazione della sostanza chimica di prova dei dati 51. In effetti, secondo Rufli et al. 52 e altri 53, si raccomanda che le soluzioni di prova per esperimenti di tossicità acquatica sono preparati utilizzando metodi fisici sopra metodi chimici, a causa del potenziale di solventi chimici per creare artefatti tossicità. Abbiamo precedentemente dimostrato che gli STC dissolto in 0,24% di etanolo / acqua (vol / vol) e sottoposto a sonicazione per 30 min smorza RBL degranulazione mastocitaria 2. Etanolo a concentrazioni superiori a 0,24% è stato indicato per smorzare degrado mastocitinulation 54,55-esempi degli effetti potenzialmente confondenti di solventi organici in studi di tossicità.

Non solo è importante considerare l'azione di solventi sull'organismo o cellule utilizzate per lo studio, ma anche che è importante monitorare l'effetto di un solvente la parte chimica prova stessa. Ad esempio, Skaare et al. 51 hanno trovato che la dissoluzione TCS in polietilene glicole (che si trovano comunemente nei dentifrici e colluttori) indebolito gli effetti anti-batteriche e anti-placca in donne sane durante dissoluzione in oli causato una perdita completa della funzione. Pertanto, la capacità di diversi solventi per modulare tossico e di droga, tra cui TCS, gli effetti devono essere considerati nella progettazione di test. Uso di oli o additivi aromatici può interferire con gli effetti di STC in vari prodotti 50,51.

Nel tentativo di eliminare la necessità di utilizzare solventi organici, abbiamo migliorato il nostro metodo di dissoluzione TCS 2 eliminando l'uso di un sol organicasfogare. Nel presente protocollo, ci sciogliamo TCS granuli direttamente in tampone acquoso con il calore (≤ 50 ° C), e quindi verificare la concentrazione di questo stock TCS con spettrofotometria UV-Vis. Questi miglioramenti sono possibili perché TCS è solubile in acqua fino a 40 pM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e ha dimostrato di resistere alla degradazione quando viene riscaldata a 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Abbiamo anche il vantaggio di spettrofotometria UV-Vis, come TCS inoltre è conosciuto per assorbire fortemente a 280 nm 58 con un coefficiente di estinzione molare di 4.200 L / mol / cm 12.

Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma efficace per dissolvere TCS granuli in un buffer senza l'ausilio di un solvente organico, tra cui basso costo e rapida verificadi concentrazione, e descrive un potente saggio di micropiastre a fluorescenza per monitorare gli effetti chimici sulla degranulazione dei mastociti.

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Protocol

Notare che tutte le ricette di buffer sono incluse in una tabella alla fine del testo protocollo.

1 ° GIORNO:

1. Preparazione di cellule

  1. Pianificare 96 pozzetti schema di configurazione di piastra, centratura campioni di prova sul layout in modo da evitare effetti di bordo. Allocare tre repliche per ogni concentrazione TCS testata (± degranulazione stimolante di antigene o ionoforo), nonché per triplica rilascio spontaneo (senza stimolante degranulazione), massimo rilascio (0,2% Triton X-100 [TX] detersivo lisi), nonché pozzi riservato per campioni di sfondo (che non contengono cellule). Per ogni giorno di sperimentazione replica, scegliere un nuovo layout randomizzato delle concentrazioni del campione TCS.
  2. Warm RBL multimediale (ricetta fornita in tabella) e tripsina a 37 ° C bagnomaria.
  3. Controllare le cellule RBL in-25 T pallone (2-4 giorni senza passaggio e meno di 3-4 mesi da quando sono stati scongelati) per i segni generali di buona guarigioneth: corretto pH indicato dal colore dei media, e la mancanza di nuvolosità. Porre il pallone con un microscopio ottico per confermare che il pallone è libero di contaminazione e che le cellule appaiono sani, correttamente confluenti, e principalmente allegata. Si noti che le celle devono essere controllati per la contaminazione da micoplasma circa ogni sei settimane 22.
Trattamento Triplicati
Stimolato, 0 mM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Stimolato, 0.001 micron TCS F6, G6, H6
Stimolato, 0.1 mM TCS A4, B4, C4
Stimolato, 1 mM TCS A6, B6, C6
Stimolato, 5 mM TCS F5, G5, H5
Stimolato, 10 mM TCS A3, B3, C3
Stimolato, 15 mM TCS A5, B5, C5
Stimolato, 20 mM TCS F7, G7, H7
Stimolato, più alto [TCS] F3, G3, H3
Spontanea, No TCS (include deride) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, No TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Nessun Cells, sfondo, più alto [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

Figura 1
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  1. Prendere il pallone cellula RBL nella coltura del tessuto sterile (TC) cappuccio. Le cellule sono attaccate al bottom del pallone. Lavora sotto il cofano TC e con tecnica sterile standard Rimuovere qualsiasi supporto dalle pallone con pipetta sterile, le cellule rimangono attaccate al fondo del pallone. Successivamente, sciacquare pallone con 2 ml di tripsina, poi scarta questo lavaggio.
  2. Aggiungere esattamente 2 ml di tripsina per coprire fondo del pallone. Messo in 37 ° C incubatore per 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dal fondo del pallone.
  3. Dopo 5 min, ha colpito il lato del pallone con una palma aperta per allentare cellule. Immediatamente, aggiungere 18 ml supporto RBL per lavare le cellule fuori il pallone e per placare la tripsina. Prendere subito la miscela di cellule-media-tripsina fuori del pallone e il trasferimento ad un nuovo, sterile tubo da 50 ml (il volume totale di questo tubo è ora 20 ml).
  4. Dopo aver mescolato delicatamente, ma accuratamente, togliere 50 microlitri di sospensione cellulare da questo tubo, e trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml sterile, che è un campione da contare. Prendere questo campione, così come il 50 ml0; provetta contenente la miscela di cellule-media-tripsina fuori della cappa TC al banco.
  5. Gira il tubo da 50 ml in centrifuga (con il giusto equilibrio) per 8 minuti a 500 xg; questa forza cellule pellet in modo efficace.
  6. Durante il tempo di rotazione, contare le cellule nel campione che sono stati isolati prima della filatura. Per fare questo, in primo luogo aggiungere 50 ml di colorante blu tripano a 50 ml di cellule in 1,5 ml di tubo, e delicatamente ma accuratamente pipetta su e giù per 5 volte per mescolare. Immediatamente, trasferire 10 ml di questa miscela al hematocytometer vetro, e contare le cellule nella zona griglia seguendo le istruzioni del produttore. Contare almeno 100 cellule per risultati statistici ragionevoli.
  7. Indietro nel cofano TC, rimuovere il surnatante dalle cellule che sono stati centrifugati.
  8. Chiudere la provetta cella, e flick pellet sul fondo della provetta per allentare cellule.
  9. Aggiungere supporti trypsinized cellule per produrre una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml, in base al numero di celle. Mescolate bene, ma delicatamente per mantenere le cellule in sospensione nel corso del processo di rivestimento. Utilizzando una Pipetman, mettere 100 cellule microlitri / pozzetto in una piastra da 96 pozzetti (fondo piatto nero), seguendo il foglio di modello piatto. Randomize come le cellule vengono distribuiti nei pozzetti per evitare errori sistematici, e mescolare dopo ogni serie di tre pozzi viene aggiunto. Essere sicuri di non mettere le cellule nei pozzetti etichettati per i campioni di sfondo.
  10. Una volta che tutte le cellule sono state trasferite, mettere il coperchio piastra sulla piastra, e trasferimento in incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) durante la notte. Pulire seguendo una tecnica sterile standard.

GIORNO 2:

2. Preparazione di Triclosan

  1. Usando un cilindro graduato, misura 250 ml Tyrodes Buffer (ricetta fornita in tabella) in una beuta da 500 ml con l'etichetta "TCS-buffer." Aggiungi mescolare bar. Usare vetreria, mescolare bar, termometro designato per l'uso con TCS solo.
  2. Anche in questo momento, misura 250Tyrodes ml in un pallone da 500 ml a parte Erlenmeyer, con l'etichetta "tampone di controllo." Usare vetreria, mescolare bar, termometro che non sono designati per TCS. Aggiungi mescolare bar.
  3. Pesare 0,0022 g di TCS granuli e trasferimento a pallone "TCS-buffer" (che contiene 250 ml Tyrodes Buffer). Per trasferire in modo efficiente granuli alla beuta, utilizzare 10 ml dalle misurate 250 ml Tyrodes per lavare via pesare imbarcazione, assicurandosi che tutti TCS è stato trasferito.
  4. Boccetta Place "TCS-buffer" su una combinazione di piastra riscaldante / piastra di agitazione magnetica, e la mise a mescolare in un gestibili alta velocità. Una volta ben amalgamato, questo stock TCS sarà nominalmente di 30 micron (concentrazione effettiva sarà calcolato dopo il riscaldamento). (Fate tutto miscelazione sotto cappa chimica.)
    1. Anche in questo momento, posizionare il pallone "controllo del buffer" (non contenente TCS) su una combinazione seconda piastra / piastra di agitazione magnetica, e impostarlo a mescolare ad una velocità simile.
  5. Accendere lampada UV / Vis a riscaldare la lampada per un uso successivo.
  6. Riscaldare la soluzione "TCS-tampone" a 50 ° C mescolando continuamente. Una volta in temperatura, il tempo di 90 min. Durante la 90 min, continuerà a monitorare 50 ° C di temperatura e velocità adeguata mescolando spesso.
    1. Contemporaneamente, riscaldare la soluzione "controllo del buffer" (che è solo 250 ml di tampone Tyrodes plain) a 50 ° C con agitazione continua. Dopo aver raggiunto 50 ° C, il tempo per 90 min, durante i quali la temperatura tempo (mantenendo a 50 ° C) e agitazione sono entrambi controllati.
  7. Alla fine del 90 min, prendere entrambe beute fuori le piastre e il trasferimento al banco.
  8. Utilizzando la funzione di scansione lunghezza d'onda su uno spettrofotometro UV / Vis, vuoto la macchina su 1 ml della soluzione riscaldata "controllo del buffer" prima della scansione 1 ml di soluzione riscaldata "TCS-buffer". Controllare la forma dello spettro, und Valore di assorbanza record a 280 nm. Per determinare la concentrazione, utilizzare l'equazione di Beer-Lambert (A 280 = 280 ε ℓ c) utilizzando un ε 280 di 4200 L / mol / cm 12 e ℓ di 1 cm.
  9. Dopo la determinazione della concentrazione TCS, aggiungere 0,249 g di albumina di siero bovino (BSA) al residuo 249 ml della soluzione di "TCS-buffer", e mescolare bene.
    1. Allo stesso tempo, aggiungere 0,249 g di BSA per il restante 249 ml di soluzione "tampone di controllo", e mescolare bene.

GIORNO 2:

3. Antigene-stimolata Assay Degranulazione utilizzando cellule RBL-2H3

  1. Prima di iniziare, controllare il pH di tutti i buffer in uso, e di garantire che essi siano chiari e non nuvoloso: questo include tampone Tyrodes, tampone di acetato di sodio e glicina tampone carbonato (ricette forniti in tabella).
  2. Caldi i media RBL e della tripsina in 37 ° C bagnomaria.
  3. Fai BT (1 mg / ml0; BSA in Tyrodes tampone): 0,05 g BSA + 50 ml Tyrodes Buffer (X2). Messo in 37 ° C bagnomaria.
  4. Rendere 0,2% Triton X-100: 3.136 ml di BT + 64 ml di 10% Triton X-100 (concentrazione finale di Triton X-100 è 0,2%). Mescolare bene per inversione, ma non fare vortice. Messo in 37 ° C bagnomaria.
  5. Inizio preparazione del TCS e tampone Tyrodes riscaldata (passi "2," di cui sopra). Nota: Non avviare la fase successiva (esposizione IgE) fino a quando il "TCS-buffer" e soluzioni "tampone di controllo" raggiungono 50 ° C e mescolare per il primo 70 min del tempo 90 min calore / agitazione.
  6. Una volta che entrambe le soluzioni sono stati agitati a 50 ° C per 70 min, compongono 0,1 mcg / ml anti-DNP IgE di topo (Sigma) in mezzi RBL per pozzetti del campione ad essere sensibilizzati (100 pl / pozzetto). IgE magazzino non deve essere più vecchio di 30 giorni se conservati a 4 ° C; registrare quanti anni lo stock è. Flick per mescolare, ma non vortice IgE.
  7. Sotto una cappa di TC,aggiungere 0,6 ml di IgE (stock è di 1 mg / ml) a 6 ml supporto RBL in un tubo da 50 ml. In un secondo tubo da 50 ml, aggiungere 6 ml di supporti di sola RBL pianura (che è destinato per i campioni nonsensitized).
  8. Dump tutti i supporti da piastra a 96 pozzetti (che è stato preparato il giorno 1) nel lavandino, e portare il piatto sotto il cofano TC.
  9. Casualmente aggiungere 100 mezzi pl / IgE miscela di pozzi che dovrebbe essere promossa (48 pozzi totale). Questa miscela non è inteso per "spontaneo", "TX" e campioni "Background".
  10. Casualmente Aggiungere 100 ml supporto RBL pianura solo a "TX", "spontaneo" e "pozzi di sfondo".
  11. Mettete il coperchio piastra sulla piastra, e poi passare piastra in 5% di CO 2/37 ° C incubatore per 1 ora.
  12. Durante 1 ora di incubazione, seguire i passaggi da 3,13-3,24.
  13. Sul banco, preparare le diluizioni antigene. Aggiungere 0,53 ml di 1,6 mg / ml di brodo di DNP-BSA + 850 ml & #160; BT per ottenere una concentrazione di antigene di 1 mg / ml. Vortex e invertire questo stock di mescolare.
  14. Una volta "TCS-buffer" e "buffer di controllo" sono stati riscaldati e quindi agitata per 90 min a 50 ° C, proseguire con il resto della preparazione per il protocollo TCS (andare ai punti 2.6 - 2.8.1). Dopo la BSA è disciolto in entrambe le soluzioni, continuare sotto.
  15. Iniziare a preparare i buffer di esposizione, con ± Ag, ± TCS. Prima, dal campione 249 ml di soluzione di "TCS-buffer" (che è già stata riscaldata e agitata per 90 min), 50 ml di trasferimento ad una nuova provetta da 50 ml. Rimuovere 20 pl di questa 50 ml aliquota e sostituirlo con 20 microlitri della 1 ug / ml antigene preparato in precedenza per una concentrazione finale di antigene di 0,0004 mg / ml BSA-DNP. Vortex e capovolgere.
    1. Etichetta di questo "tubo 1, alta TCS / Ag + / + BT." E 'utilizzato per diluizioni e più alta concentrazione di esposizione TCS.
    2. Dal campione 249 ml di soluzione di "buffer di controllo", trasferire 50 ml in una nuova provetta 50 ml. Rimuovere 20 pl di questa nuova aliquota da 50 ml e sostituire con 20 microlitri di 1 mg / ml di antigene preparato in precedenza per una concentrazione finale di antigene di 0,0004 mg / ml BSA-DNP. Vortex e capovolgere.
      1. Etichetta di questo "tubo 2, No TCS / Ag + / + BT". Usato per TCS diluizioni e 0 mM di esposizione concentrazione TCS.
    3. Ora estrarre 50 ml di soluzione di "TCS-buffer" e messo in un'altra provetta da 50 ml. Rimuovere 20 microlitri da questa nuova aliquota da 50 ml e sostituirlo con 20 pl di pianura BT. Vortex e capovolgere. Viene aggiunto alcun antigene.
      1. Etichettare questo "tubo 3, alta TCS / No Ag / + BT." Questo è utilizzato per lo sfondo.
    4. Trasferire 50 ml di soluzione di "controllo del buffer" in un'altra provetta da 50 ml. Estrarre 20 ml da questo ne w-50 ml aliquota e sostituirlo con 20 l di pianura BT. Vortex e capovolgere. (Si aggiunge n Ag.)
      1. Etichettare questo "tubo 4, No TCS / No Ag / + BT." Questo è usato per lo sfondo e campioni spontanei.
    BSA TCS Antigen
    Tubo 1 Segno di spunta Elevata [] Segno di spunta
    Tubo 2 Segno di spunta NO Segno di spunta
    Tubo 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Elevata [] NO
    Tubo 4 Segno di spunta NO NO
    1. Calcolare e registrare volumi per la diluizione dopo la determinazione della concentrazione dello stock "TCS-buffer". Il volume totale di ogni concentrazione di diluizione deve essere di 1 ml e deve essere preparato in una provetta sterile. Utilizzare P2 calibrata e P1000 Pipetman.
    Concentrazione Alta Triclosan + Tyrodes + BSA 0,0004 mg / ml Ag
    (Tubo 1 da sopra)     		Riscaldata BT 0,0004 mg / ml Ag
    (Tubo 2 dall'alto)
    20 micron
    10 micron
    5 pM
    1 pM
    0,1 micron
    0.001 mM
    0 mM (in alto della piastra) ----------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
    0 micron (fondo piatto) ----------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
    1. Dopo 1 ora di incubazione IgE, prendere piastra di incubatore e lanciare tutti i media nel lavandino. (Nota: se le sostanze chimiche di prova sono noti per essere più tossico del prodotto TCS consumatore, smaltimento dei rifiuti pericolosi può essere necessario.)
    2. Utilizzando un Combitip, casualmente lavare le cellule nella piastra a 96 pozzetti con BSA-Tyrodes Buffer (200pl / pozzetto). Rilasciare il tampone di lavaggio sui lati dei pozzetti, anziché direttamente sulle cellule attaccate, per evitare di disturbare le cellule attaccate. Ripetere la procedura una seconda volta.
    3. Per preparare trattamenti per l'applicazione, vortex e invertire diluizioni destra prima aggiunta alla piastra.
    4. Partendo con la sezione superiore della piastra: Casualmente metti triplicato di 200 microlitri ciascuna delle soluzioni di antigene (con corrette concentrazioni di TCS) ai pozzetti corrispondenti. Continuare a fondo piatto. Aggiungere la soluzione di "controllo del buffer" plus Ag (da "Tubo 2" di cui sopra) per tutte le "prende in giro" sul piatto.
    5. Aggiungere 200 ml di soluzioni adeguate ai pozzetti:
      1. Aggiungere 200 microlitri di 0.2% Triton X-100 pozzi a "TX"-designati.
      2. Successivamente, aggiungere 200 ml di tubo 3 per i 3 pozzetti "Background (bkgd)-Massima TCS" sul piatto.
      3. Infine, aggiungere 200 microlitridi tubo da 4 a 6 pozzetti "spontanea".
    6. Incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C / 5% di CO 2.
    7. Durante 1 ora di incubazione: Prendi due secchi di ghiaccio (uno per piatto "vecchio" in incubatrice e una per nuova piastra). Disgelo 4-metilumbelliferil-N-acetil-beta-D-glucosaminide (4-MU) a temperatura ambiente fino a 40 min, mantenendo in stagnola perché è sensibile alla luce.
      1. Dopo 4-MU magazzino è scongelato, costituiscono la soluzione 4-MU di lavoro: 150 magazzino ml + 14,85 ml di soluzione tampone a freddo (ricetta data in tabella); vortice e capovolgere. Tenete a 50 ml tubo da centrifuga, avvolto in carta stagnola, e in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      2. Utilizzando Combitip, aggiungere in modo casuale 100 microlitri soluzione di lavoro 4-MU fredda nella parte inferiore di ciascun pozzetto di una nuova Grenier nero piastra a 96 pozzetti (il secchiello per il ghiaccio # 2). Iniziare prima aggiungendo la soluzione di lavoro in modo casuale all'interno della parte superiore della piastra, in modo casuale all'interno del fondo della piastra, in modo casuale all'interno di Triton X-100 pozzi,e, infine, in modo casuale all'interno di pozzi di sfondo.
      3. Uscire nuova scatola di P200 consigli per passo successivo.
    8. A fine incubazione di 1 ora, mettere piastra di cella da incubatore sul secchiello # 1, pipetta surnatante su e giù 4-5x (dolcemente, non introducendo bolle), aggirando il bene per buona miscelazione ma non toccare le cellule, mentre la miscelazione . Sistematicamente, estrarre un campione di 25 microlitri di ogni bene e di luogo nella nuova piastra con substrato (stesso ordinamento di campioni, come originariamente pianificato). Pipettare su e giù per mescolare campione accuratamente quando in nuovo pozzo, senza introdurre bolle.
    9. Incubare per 30 min a 37 ° C / 5% di CO 2.
    10. Dopo 30 minuti di incubazione, in modo casuale aggiungere 200 ml di tampone glicina-carbonato di freddo per pozzetto (usando Combitips) per riempire i pozzi fino a 325 microlitri totale. (Fare questo oltre ai Triton X-100 campioni scorso, al fine di evitare Triton X-100 spillover). Verificare la presenza di bolle prima piastra di lettura (colpire con clean P10 pipettate punta al pop tutte le bolle).
    11. Eseguire la piastra nel lettore di piastre a fluorescenza (vai alla sezione 4).

    GIORNO 2:

    4. Piastra fluorescente Istruzioni Reader e analisi dei dati

    1. Aprire Gen5 programma, e la sezione esperimento aperto.
    2. Accendere il lettore di piastre e inserto piatto (in alto a sinistra è A1).
    3. Protocollo Freccia Procedura Freccia Leggi per impostare letture personalizzate. Non aggiungere nulla campioni replicati, ecc, al fine di raccogliere dati grezzi fluorescenza da ciascun pozzetto.
    4. Sotto "Leggi" scegliere "fluorescenza", "Punto finale", "Velocità Normale", "Guadagno 40", "eccitazione 360/40", "Emissione 460/40," posizione di Ottica: Top 50%. Top ottica offset: 7mm. Nessuna scossa, nessun ritardo, nessun cinetica, nessun monitor bene, la temperatura: incubatrice off.
    5. Scegli fondo piatto nero, piastra a 96 pozzetti (Grenier 96 pozzetti, fondo piatto).
    6. Accordo con il layout di piastra: Protocollo Freccia layout della piastra. Impostare campioni senza indicare ripetizioni, diluizioni, ecc
    7. Piastra Freccia leggere.
    8. Salva file: Fare clic sul pulsante "Excel", che esporterà file di dati in Excel. Fate questo per il layout di piastra e di matrice. Salvare il file sul computer e su un drive USB.
    9. In Excel, sottrarre il valore di fondo media da ogni campione, tra cui Triton X-100 pozzi.
    10. Calcolare relativa% degranulazione dividendo ciascun valore (già in possesso sfondo sottratto) per il valore medio di Triton X-100, e quindi moltiplicare per 100 per renderlo una percentuale.
    11. Media tutto triplicato, e calcolare la deviazione standard. I dati dei grafici in Excel come valori medi ± deviazione standard. Per il test statistico, spostare ora al software Prism da GraphPad.

    GIORNO 2:

    5. Ionophore Stimolato Assay Degranulazione utilizzando cellule RBL-2H3

    1. Seguire il protocollo per "Preparazione delle cellule" (Sezione 1, 1 ª giornata) e "Preparazione del triclosan" (Sezione 2, Day 2), come indicato sopra. L'esempio di layout di piastra per la stimolazione ionophore è mostrato sotto.
    Trattamento Triplicati
    Stimolato, 0 mM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
    Stimolato, 0.001 micron TCS F6, G6, H6
    Stimolato, 0.01 mM TCS F3, G3, H3
    Stimolato, 0.1 mM TCS A4, B4, C4
    Stimolato, 1 mM TCS A6, B6, C6
    Stimolato, 5 micron [TCS F5, G5, H5
    Stimolato, 10 mM TCS A3, B3, C3
    Stimolato, 15 mM TCS A5, B5, C5
    Stimolato, 20 mM TCS F7, G7, H7
    Spontanea, con DMSO, senza TCS (include deride) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
    TX-100, con DMSO, senza TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
    No cellule sfondo, con DMSO, più alto [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

    Figura 1 Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

    1. Prima di iniziare, controllare il pH di tutti i buffer in uso, e di garantire che essi siano chiari e non nuvoloso. Tyrodes, tampone acetato di sodio e carbonato di tampone glicina (ricette fornite in tabella).
    2. Preparare un tubo da 50 ml conica di BT con l'aggiunta di 0,05 g di BSA per 50 ml di tampone Tyrodes e nel vortex per miscelare bene. Incubare a 37 ° C bagnomaria.
    3. Rendere 0,2% Triton X-100 con 0,0032% DMSO (concentrazione veicolo calcio ionoforo finale) aggiungendo 96 ml di 10% Triton X-100-4,704 ml BT. Mescolare bene. Successivamente, estrarre 0.155 ml di questa soluzione e scartare. Ora aggiungere nuovamente a 0,155 ml di 100% DMSO.
    4. Preparare un 5 millimetri Stock (2,5 mg / ml) di A23187 ionophore da polvere con l'aggiunta di 400 ml di fresco 100% di DMSO nel flaconcino ionophore e vortex per miscelare. Una volta in soluzione,trasferire in una provetta da 1,5 ml, il contenuto del record e la data odierna e scadenza (3 mesi di preparazione se conservati correttamente a -20 ° C).
      1. In alternativa, se si utilizza un magazzino congelato oggi, disgelo sul ghiaccio, e verificare che il 5 mM A23187 ionophore è ben amalgamato e chiaro. Vortex, flick, e invertire questa azione prima di utilizzare. Riportare la data di preparazione e di Lot # di questa A23187.
    5. Una volta "TCS-buffer" e "buffer di controllo" sono stati riscaldati e agitata per 90 min, continuare il resto della preparazione per il protocollo TCS (passare a gradini 2.6-2.8.1). Dopo la BSA è ben miscelato in entrambe le soluzioni, continuare con i restanti gradini del protocollo.
    6. Dal campione 249 ml di soluzione di "TCS-buffer", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Rimuovere 1,8 l di ml aliquota 50 e aggiungere 1,8 ml di 5 mM ionophore magazzino. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x. Concentrazione ionophore finale è 180 nm. Si noti che questa concentrazione di A23187 varierà secondo magazzino potenza, e una A23187 ionoforo risposta dose è raccomandata per identificare una concentrazione di A23187 che provoca una degranulazione livello di circa il 20% di rilascio massimo, che è stato identificato come un noncytotoxic di RBL-2H3 celle di test di citotossicità (vedi punto 2).
      1. Etichetta di questo "tubo 1, alta TCS / ionoforo + / + BT." Utilizzato per diluizioni e più alta concentrazione di esposizione TCS.
    7. Dal campione 249 ml di soluzione di "buffer di controllo", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Estrarre 1,8 l di ml aliquota 50 e aggiungere di nuovo in 1,8 ml di 5 mM ionophore magazzino. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x. Concentrazione ionophore finale è 180 nm.
      1. Etichetta di questo "tubo 2, No TCS / ionoforo + / + BT." Questo è usato per le diluizioni e 0 concentrazioni TCS micron.
    8. Dal campione 249 ml di R 20; soluzione TCS-tampone ", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Estrarre 1,8 microlitri della nuova aliquota 50 ml e aggiungere 1,8 ml di 100% DMSO. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x; non ionophore viene aggiunto.
      1. Etichetta di questo "tubo 3, alta TCS / No ionoforo / BT + / + DMSO", utilizzato per lo sfondo.
    9. Dal campione 249 ml di soluzione di "buffer di controllo", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Estrarre 1,8 microlitri dalla nuova aliquota 50 ml e aggiungere 1,8 ml di 100% DMSO. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x. Viene aggiunto alcun ionofori.
      1. Etichetta di questo "tubo 4, No TCS / No ionoforo / BT + / + DMSO"; utilizzato per i campioni rilascio spontaneo.
    BSA TCS Ionophore Aggiunge il 100% di DMSO
    Tubo 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Elevata [] Segno di spunta NO
    Tubo 2 Segno di spunta NO Segno di spunta NO
    Tubo 3 Segno di spunta Elevata [] NO Segno di spunta
    Tubo 4 Segno di spunta NO NO eck marchio "fo: contenuti-width =" .1 in "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/>
    1. Calcolare e registrare volumi per la diluizione dopo la determinazione della concentrazione dello stock "TCS-buffer". Utilizzare P2 calibrata e P1000 Pipetman. Il volume totale di ogni concentrazione di diluizione deve essere di 1 ml, e dovrebbe essere preparato in una provetta sterile:
    <td>
    Concentrazione Alta Triclosan + Tyrodes + BSA 180 nM A23187 (metropolitana 1 da sopra) Riscaldata BT 180 nM A23187 (Tubo 2 dall'alto)
    20 micron
    15 mM
    10 micron
    5 pM
    1 pM
    0,1 micron
    0.001 micron
    0 mM (in alto della piastra) ---------------------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
    0 micron (fondo piatto) ---------------------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
    1. Prendete le cellule placcato ieri fuori dell'incubatore e vuoti i media nel lavandino. Utilizzando un Combitip, casualmente lavare le cellule nella piastra a 96 pozzetti con BT (200 pl / pozzetto). Ripetere il lavaggio una seconda volta.
    2. Per preparare trattamenti per l'applicazione, vortex e invertire diluizioni destra prima aggiunta alla piastra. Partendo con la sezione superiore della piastra: Casualmente aggiungere triplicato da 200 ml ciascuno della corretta concentrazione del TCS al corresponding bene. Continuare a fondo piatto. Aggiungere la soluzione di "controllo del buffer" più A23187 (da "Tubo 2" di cui sopra) per tutte le "prende in giro" sul piatto.
    3. Aggiungere 200 ml di soluzioni adeguate ai pozzetti:
      1. Aggiungere 200 microlitri di 0.2% Triton X-100 pozzi a "TX"-designati.
      2. Successivamente, aggiungere 200 ml di tubo 3 per i 3 pozzetti "Background (bkgd)-Massima TCS" sul piatto.
      3. Infine, aggiungere 200 ml di tubo da 4 a sei pozzetti "spontanea".
    4. Incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C / 5% di CO 2.
    5. Durante il 1 ora di incubazione: Prendi due secchi di ghiaccio (uno per piatto "vecchio" in incubatrice e una per nuova piastra). Disgelo 4-metilumbelliferil-N-acetil-beta-D-glucosaminide (4-MU) a temperatura ambiente fino a 40 min, mantenendo in stagnola perché è sensibile alla luce.
      1. Dopo 4-MU magazzino è scongelato, make up 4-MU lavoro solutisu: 150 magazzino ml + 14,85 ml di soluzione tampone a freddo (ricetta data in tabella); vortice e capovolgere. Tenete a 50 ml tubo da centrifuga, avvolto in carta stagnola, e in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      2. Utilizzando Combitip, aggiungere 100 microlitri casualmente soluzione di lavoro 4-MU fredda nella parte inferiore di ciascun pozzetto di una NUOVA Grenier nero piastra da 96 pozzetti (on ice bucket # 2): iniziare prima aggiungendo la soluzione di lavoro in modo casuale all'interno della parte superiore del piastra, in modo casuale all'interno del fondo della piastra, in modo casuale all'interno di Triton X-100 pozzi, e infine casualmente entro pozzetti di sfondo.
      3. Uscire nuova scatola di P200 consigli per passo successivo.
    6. A fine incubazione di 1 ora, mettere piastra di cella da incubatore a secchiello # 1, pipetta surnatante su e giù 4-5x (dolcemente, non introducendo bolle), aggirando il bene per buona miscelazione ma non toccare le cellule, mentre la miscelazione . Sistematicamente, estrarre un campione di 25 microlitri di ogni bene e di luogo nella nuova piastra con substrato (stesso ordinamento di SAmples, come originariamente pianificato). Pipettare su e giù per mescolare campione accuratamente quando in nuovo pozzo, senza introdurre bolle.
    7. Incubare per 30 min a 37 ° C / 5% di CO 2.
    8. Dopo 30 minuti di incubazione, in modo casuale aggiungere 200 microlitri tampone glicina-carbonato di freddo per pozzetto (usando Combitips) per riempire i pozzi fino a 325 microlitri totale (fare questa aggiunta ai Triton X-100 campioni ultimi, per evitare di Triton X-100 spillover). Verificare la presenza di bolle prima piastra di lettura (colpire con pulito P10 pipetta punta al pop tutte le bolle).
    9. Eseguire la piastra nel lettore di piastre a fluorescenza (Seguire tutte le operazioni descritte nella sezione 4).

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Representative Results

Quando riscaldato a 50 ° C per 90 min, lo spettro di assorbanza UV-Vis per TCS produce un forte curva regolare tra ~ 260 e 300 nm, con un picco a 280 nm, come mostrato in Figura 1. Spettrofotometria UV-Vis è, quindi, un importante strumento che può essere utilizzata per calcolare la concentrazione, poiché il coefficiente di assorbimento molare pubblicato a 280 nm è 4,200 L / mol / cm 12. Abbiamo scoperto che TCS non cada dalla soluzione durante l'arco di tempo l'intero esperimento degranulazione, seguendo la 50 ° C riscaldamento (dati non mostrati).

Dopo aver utilizzato questo metodo di riscaldamento a dissolversi TCS direttamente in tampone acquoso, abbiamo esaminato l'effetto di TCS sulla degranulazione mastocitaria utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza che è stata ottimizzata da Naal et al. 1 Questo saggio registra il livello di β-hexosaminidase rilasciata da mastociti cellule dopo un'ora di incubazione rilevando un prodotto substrato fluorogenico. Se stimolato a degranulano da DNP-BSUn antigene (Figura 2) o ionoforo del calcio A23187 (figura 3), si può vedere chiaramente che TCS causa una significativa inibizione dose-reattivo del rilascio di β-hexosaminidase (cioè degranulazione).

La figura 2 è rappresentativa dei risultati ottenuti con le cellule RBL-IgE sensibilizzate, che sono state incubate per 1 ora a "TCS-buffer" o "buffer di controllo", ed esposti a una dose di antigene DNP-BSA di 0,0004 mg / ml. Questa concentrazione di DNP-BSA ha suscitato una risposta media degranulazione assoluto del 22,5% ± 0,1 (media ± deviazione standard), in assenza di TCS. Inibitorio statisticamente significativo sulla degranulazione iniziata alle 5 micron, dove i livelli di degranulazione erano 0,79 volte ± 0,05 (media ± SD) delle 0 mM livelli di controllo TCS. Come i TCS concentrazione aumenta, vi è una maggiore effetto frenante del TCS, che mostra una forte relazione dose-risposta. TCS, a 20 micron, almost abroga completamente la risposta degranulazione, a livelli pari a circa degranulazione spontanea (in cui non è presente l'antigene). Complessivamente, questa figura mostra forte inibizione del multivalente antigene-stimolata degranulazione mastocitaria causa della concentrazione verificata TCS, senza l'uso di solventi organici.

In figura 3, il calcio ionoforo A23187 stato usato come un modo per indagare il meccanismo di TCS-indotta smorzamento di degranulazione nei mastociti RBL. A23187 è usato come stimolante alternativa perché bypassa la reticolazione FcεRI e altri eventi di segnalazione a monte del flusso di calcio, ma causa ancora degranulazione. Mastociti RBL sono state incubate per 1 ora a "TCS-buffer" o "buffer di controllo", contenente una dose ionoforo del calcio di 180 nm. In assenza di TCS, questa concentrazione di A23187 suscitato una risposta media degranulazione assoluto del 25,1% ± 4,7 (media ± deviazione standard). Inibizione della degranulazione eratrovato con un minimo di 1 micron TCS (0.63 ± 0.11 [media ± DS]). Come TCS concentrazione aumenta, così fa la gravità della inibizione: a 5 micron, 0,21 ± 0,04 volte i 0 mM livelli di controllo TCS, a 10 micron, 0,09 ± 0,05; a 15 micron, 0.077 ± 0.006, e di 20 micron , 0,09 ± 0,02 (media ± SD). Infatti, dal 5 pM e concentrazioni più elevate di STC, livelli di degranulazione indotta A23187 stati trovati per essere vicino al livello di controllo spontanea (dove nessun A23187 è presente a tutti). Nel complesso, la Figura 3, in combinazione con la figura 2, indica che gli eventi molecolari mirati da TCS sono probabili a valle del flusso di calcio.

Figura 1
Figura 1:. Rappresentante TCS UV-Vis spettro di assorbanza TCS ha un pisello robustok a 280 nm, permettendo una facile determinazione di A 280, nonché offrendo la possibilità di utilizzare il coefficiente di estinzione molare di 4.200 L / mol / cm 12 per determinare la concentrazione effettiva di STC disciolto in tampone Tyrodes. La linea gialla indica il picco a 280 nm. In questo esempio, il valore di assorbanza a 280 nm è 0,11,876 mila, il che indica una concentrazione TCS di 28,28 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2:. Una risposta degranulazione rappresentante dei mastociti RBL IgE-sensibilizzate esposte a 0,0004 mg / ml BSA DNP-antigene e TCS (0-20 micron) Un valore di rilascio spontaneo (senza antigene presente) è raffigurato come riferimento. I valori rappresentano la media7; deviazione standard dei campioni in triplo. Come presentato, i dati sono stati normalizzati per il controllo (0 mM TCS), e le differenze significative sono state determinate in software Prism con una ANOVA a una via seguita da prova di una Tukey post hoc (i confronti effettuati a 0,001 micron TCS medio di risposta). Significato è rappresentato da *** p <0,001. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3
Figura 3:. Una risposta rappresentativo degranulazione dei mastociti RBL stimolate con 180 nM A23187 ionoforo del calcio in presenza di STC (0-20 mM) Un campione rilascio spontaneo (senza ionoforo presente) è raffigurata per riferimento. I valori rappresentano la media ± deviazione standard dei campioni in triplicato. Come Presented, i dati sono normalizzati per il controllo (0 mM TCS), e le differenze significative sono state determinate in software Prism con una ANOVA a una via seguita da prova di una Tukey post hoc (i confronti effettuati a 0,001 micron TCS medio di risposta). Significato è rappresentato da *** p <0,001; ** p <0.01. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

Nel 2004, Naal et al. 1 ha sviluppato un biosensore mastociti per la prova high-throughput di degranulazione. Si tratta di un test affidabile che abbiamo adattato per i nostri studi TCS e dettagliato in questo video. Prima della Naal et al. 1 assay, degranulazione mastocitaria era stata regolarmente valutata mediante β-hexosaminidase 59-61, ma questi primi metodi utilizzati fluorimetri in cui un campione è stata letta a volta. È importante sottolineare che, Naal et al. stabilito concordanza diretta tra loro metodo ad alta produttività più utilizzando un lettore di micropiastre e il metodo precedente in cui i campioni sono stati letti one-at-a-tempo in un fluorimetro. In sintesi, Naal et al. 1 notevolmente migliorata la velocità, potenza, semplicità e affidabilità del saggio adattandolo ad una piattaforma micropiastre ad alta produttività, nonché, integrando diverse modifiche al flusso di lavoro. Qui, abbiamo ulteriormente adattato questa analisi per uno studio di varie sostanze chimiche di prova, in particolare, qui, Il farmaco onnipresente TCS. I dettagli del video i passi di questo utilissimo test. Inoltre, abbiamo anche sviluppato un metodo organico-solventi di applicare TCS in tampone acquoso, e ci mostrano una procedura semplice, a basso costo per la verifica concentrazione TCS. Questi metodi devono essere utili al apparentemente campo crescente di triclosan tossicologia. In questa discussione, abbiamo dettaglio alcune considerazioni per l'utilizzo di questo test degranulazione di testare altre sostanze chimiche pure.

TCS è stato preparato direttamente nel tampone acquoso senza l'ausilio di solventi organici, la concentrazione è stata verificata mediante spettrofotometria UV-Vis (Figura 1), e quindi l'effetto di STC (<30 mM) è stata esaminata in degranulazione mastocitaria (figure 2 e 3) , utilizzando un saggio di fluorescenza per micropiastre per rilevare la presenza di β-hexosaminidase, un marker surrogato per degranulazione. Abbiamo trovato che TCS è in grado di smorzare significativamente il rilascio di β-hexosaminidase dai mastociti RBL quando disciolto in una bassa concentrazione di etanolo (0,24% vol / vol) 2 oppure, come illustrato qui, direttamente in tampone acquoso. Rinunciando solvente organico, che effettivamente vediamo più pronunciato smorzamento in antigene-indotta degranulazione rispetto i nostri studi in cui TCS è stato sciolto in 0,24% di etanolo (vol / vol). Ad esempio, qui abbiamo dimostrato una riduzione> 50% in degranulazione antigene-indotta (0,46 volte ± 0,07), che è molto più grande del 25% di riduzione ~ abbiamo riportato per 10 micron TCS sciolto in 0,24% di etanolo (0.76-fold ± 0.02) 2. Nella stessa ottica, abbiamo determinato per le cellule A23187-stimolate che, da 5 micron, TCS inibisce la degranulazione a livelli di rilascio spontaneo, questo effetto non è stato dimostrato fino a 10 micron TCS nel nostro precedente, etanolo-utilizzando, studio 2. Ci sono due possibili ragioni di questa discrepanza: o un veicolo a etanolo 0.24% 2 attenua la capacità del TCS di inibire mast cel attivol degranulazione, o il TCS che usavamo era meno concentrato del previsto (in quanto le concentrazioni non sono state verificate mediante spettrofotometria UV-Vis nello studio precedente 2). Riguardo il bersaglio molecolare per l'inibizione di STC, degranulazione dei mastociti, è probabilmente avvenuto qualche parte in cascata di trasduzione del segnale a valle del flusso di calcio 2. Abbiamo usato il calcio ionoforo A23187 come stimolante degranulazione di bypassare primi eventi di segnalazione, e l'effetto inibitorio del TCS persistito, il che indica che l'obiettivo per il TCS inibizione del pathway degranulazione non è probabile che a monte del flusso di calcio. Abbiamo precedentemente dimostrato che ruffling membrana di queste cellule è anche soppresso causa di un trattamento TCS, suggerendo la possibilità di un bersaglio percorso comune 2.

Precedenti studi hanno trovato lo spettro di assorbimento di TCS avere un picco massimo a 280 nm ed un coefficiente di assorbimento molare è stato valutato per essere 4200 L / mol / cm a questo wavelength (a valori di pH inferiori al pK a) 12. E 'stato dimostrato che il riscaldamento del TCS non porta alla degradazione termica 57, e un altro studio ha dimostrato il successo nel dissolvere TCS in acqua mentre viene riscaldato a 50 ° C senza ausilio di un solvente organico 56. Con qualsiasi nuova sostanza chimica di prova, la sua solubilità in tampone acquoso, ovviamente, deve essere considerato con attenzione. Abbiamo anche trovato che, quando il riscaldamento del TCS, la forma della lettura spettrale è inalterato se viene riscaldato per 40-90 min (dati non mostrati): ciò suggerisce una mancanza di degradazione del TCS quando riscaldato per un periodo più tempo. Si noti, tuttavia, che TCS dissoluzione è superiore a 90 min a 40 min. Abbiamo inoltre confermato che TCS non cada dalla soluzione per tutta la durata dell'esperimento degranulazione (dati non riportati).

Il DNP-BSA antigene e le concentrazioni di calcio ionoforo utilizzato in questo studio sono stati scelti sulla base di antigene e di saggi di risposta ionophore dosi, und sono stati selezionati per suscitare livelli degranulazione moderati per le figure rappresentative 2 e 3. Un esempio di un saggio dose risposta antigene può essere visto in Figura 1A del nostro precedente lavoro 2. Nel determinare la concentrazione di antigene o ionophore da utilizzare nel vostro esperimento, è importante essere consapevoli che stimolanti esperimenti dose-risposta deve essere effettuata periodicamente, in genere almeno ogni due mesi, da quando le cellule RBL-2H3 a volte funzionano variabile. La concentrazione che produce la percentuale degranulazione desiderato può variare a seconda dell'età delle cellule e sulla preparazione antigene / ionoforo. Inoltre, come abbiamo visto con inorganici arsenito 22, percentuali degranulazione assoluti (i livelli di antigene utilizzati) possono influenzare i livelli di sostanze tossiche effetti sulla degranulazione RBL, quindi tossico dose-risposta dovrebbe essere fatto in diverse concentrazioni di antigene / ionophore diverse. E 'anche importante considerare il conce finalentration di veicolo DMSO quando stimolando degranulazione con ionoforo, poiché degranulazione è influenzato dal DMSO 62. Abbiamo trovato le concentrazioni di DMSO utilizzato nel presente protocollo non pregiudicano degranulazione, letture di fondo, o 0,2% Triton X-100 valori 2.

Oltre al antigene multivalente DNP-BSA e lo ionoforo del calcio A23187, esistono molti altri metodi di stimolazione RBL-2H3. Uno di questi metodi è la stimolazione tramite esposizione al composto 48/80 insieme con quercetina 63. Un altro è la reticolazione dei recettori IgE-bound con un anticorpo anti-IgE IgG, come abbiamo precedentemente testato con TCS esposizione 2. Esistono molti altri metodi di stimolazione, e ciascuno di questi metodi affronta un diverso aspetto meccanicistica della degranulazione dei mastociti. Questo test lettore di piastra può essere adattato per l'uso con molti di questi stimolatori alternativi, espandendo ulteriormente la sua utilità.

Questo protocollo degranulazione ha il potenziale per essere usato con un'ampia varietà di Chemicals. In uno studio di qualsiasi sostanza chimica in esame da questo test, i controlli devono essere eseguiti per i seguenti: (1) effetto della sostanza chimica di prova sul fondo (senza celle) letture; (2) effetto della sostanza chimica sulla degranulazione spontanea (cellule prive di IgE , no antigene, nessun ionoforo), (3) Effetto della chimica su 100 Triton-X-valori delle cellule lisate (nessun antigene, nessun ionoforo). Questi test possono essere facilmente lavorati nel layout piastra. In precedenza, abbiamo trovato il TCS colpisce nessuno di questi tre parametri 2. Inoltre, i test devono essere eseguiti per determinare che la chimica di prova non interferisce con l'enzima / substrato reazione di β-hexosaminidase se stesso in un preparato privo di cellule, come descritto in Figura S1 della appendice A sezione dati di Palmer et al supplementare. 2 Abbiamo trovato che TCS non interferisce con la capacità di β-hexosaminidase per scindere il substrato fluorogenico 4-MU 2. Effetti dei solventi utilizzati devono essere consideratiin tutti questi esperimenti di controllo. Per esempio, abbiamo confermato che DMSO, il solvente per la ionoforo, non ha effetto su Triton-X-100 livelli di fluorescenza dei campioni (dati non mostrati). Notiamo anche che abbiamo selezionato tutte le plastiche utilizzate in questo studio per non contiene il distruttore endocrino bisfenolo A, purtroppo, però, tutte le plastiche attualmente in commercio probabilmente fanno contenere qualche interferenza endocrina attività, che potrebbero confondere i dati 64.

Nel caso in cui è richiesta la risoluzione dei problemi, diversi aspetti potenziali di questo protocollo devono essere riesaminati. Per esempio, può essere che (1) livelli rilascio spontaneo sono troppo alta (maggiore di ~ 7% dei valori di lisi), (2) una dose-risposta con uno stimolante e / o chimiche di prova non viene osservata, o (3) la concentrazione TCS in soluzione è troppo bassa (inferiore a 20 mM). Nel primo caso, un livello elevato spontanea potrebbe essere un'indicazione delle cellule in coltura essendo troppo lungo o esserne contaminati micoplasma; pertanto, Provare questi esperimenti con le cellule RBL-2H3 che sono stati nella cultura tra 2-20 settimane, e testare regolarmente per micoplasma. Se non si osserva una risposta alla dose stimolante, la concentrazione stimolante disciolto può essere troppo bassa, e le scorte deve essere rifatto. Come esempio, calcio ionoforo tipicamente viene fornito come un film sottile, da ricostituire con DMSO, che richiede molta attenzione e molto vortex. Inoltre, un nuovo magazzino ionophore con un numero di lotto diverso potrebbe avere una potenza diversa semplicemente a causa di molti-a-molti variazione, quindi, la risposta alla dose degranulazione è consigliato con ogni stock ionophore appena acquistato. E 'anche interessante notare che l'apparente mancanza di effetti con una data sostanza chimica di prova potrebbe essere un'indicazione che questa sostanza chimica può richiedere un periodo di incubazione più lungo al fine di provocare un effetto. Se non si è ottenere un elevato rendimento TCS in soluzione, verificare che la temperatura è rimasta costante (50 ° C ± 5), mentre i granuli si dissolvono in buffer. Tegli termometro dovrebbe mai toccare il fondo del pallone, una posizione che comporterebbe una sovrastima della temperatura della soluzione. Inoltre, assicurarsi che non vi è costante agitazione vigorosa e che il conto alla rovescia di 90 minuti non viene avviata fino a quando la temperatura ha prima raggiunto i 50 ° C.

Tabella per la risoluzione dei problemi.

Problema

Potenziale Motivo

Soluzione

TCS stock è determinata a essere <20 micron

Riscaldamento non uniforme della soluzione

Assicurarsi che il termometro è posizionato in modo che viene sospeso in soluzione e non tocchi il fondo del pallone.

Mescolando non è abbastanza vivace

Aumentare agitazione magnetica sulla stir-piastra per raggiungere un livello di agitazione che è vigorosa senza causare la soluzione a salta del pallone. Assicurarsi che venga utilizzato un ancoretta magnetica di dimensioni appropriate.

Problemi con spettrofotometro

Consentire un adeguato riscaldamento di lampada UV (in genere 10 minuti), oppure sostituire la lampadina, se necessario.

Livelli degranulazione spontanei sono troppo elevati (> ~ 7%)

Le cellule hanno acquisito mutazioni genetiche anomale dovute a troppo tempo nella cultura

Effettuare esperimenti con un nuovo disgelo cella.

Le cellule stanno morendo a causa del taglio meccanico

Durante l'aggiunta di buffer o di trattamenti di cellule aderenti, fare attenzione a non disturbare le cellule, con l'aggiunta di questi volumi con attenzione ai lati dei pozzetti. Pratica con il Combitip.

IgE / DNP-BSA non provoca il rilascio di beta-hexosaminidase su livelli rilascio spontaneo

IgE è più vecchio di 30 giorni o è stato sottoposto a congelare disgelo

Utilizzare un nuovo, aliquota correttamente conservato di IgE.

DNP-BSA non è stata correttamente miscelata

Assicurarsi di aggiungere con cautela il piccolo volume di DNP-BSA per il tubo conico e to vortice a fondo.

A23187 ionophore non provoca il rilascio di beta-hexosaminidase su livelli rilascio spontaneo

A23187 azione non è stata adeguatamente ricostituito

Prodotto arriva come un "film sottile", e deve essere ricostituito con cura e molto vortex. Trasferimento ricostituito magazzino in una nuova provetta da 1,5 ml per la conservazione.

A23187 magazzino non è stato conservato correttamente

Le scorte sono sensibili alla luce. Una volta ricostituito, Parafilm la parte superiore, e conservare avvolto in un foglio a -20 ° C. Se c'è una domanda circa la conservazione di uno stock, scartare e iniziare i test con un nuovo magazzino.

180 Nm di A23187 ionophore non suscitalo stesso livello di risposta degranulazione relativa, come quello trovato in un saggio precedente

Lotto a lotto variazione A23187 ionophore

Eseguire un esperimento di dose-risposta per ogni nuovo lotto di ionophore. Si raccomanda inoltre che le scorte dello stesso lotto essere testati, a causa di potenziali variabilità nel processo di ricostituzione.

Come in qualsiasi esperimento di tossicologia / farmacologia, la chimica di prova non deve essere assolutamente tossico alle concentrazioni testate. Si consiglia di utilizzare metodi di prova sia per apoptosi e necrosi, singolarmente o combinati (ad esempio con prove clonogeniche), così come test per danni generali alla membrana plasmatica (come lattato deidrogenasi perdite). TCS, a concentrazioni mostrati in questo studio, non è citotossica per le cellule RBL-2H3 2. Una particolare nota di preoccupazione con gli studi ionophore è che ionophore più ionophore veicolo(Probabile DMSO), più la sostanza chimica di prova, più eventuali solventi organici utilizzati, potrebbero essere una birra potenzialmente citotossico, che devono essere attentamente controllato, come fatto in Palmer et al. 2

Nostro protocollo per la preparazione di soluzioni TCS senza l'uso di un solvente organico sarà utile per ulteriori test tossicologici di questa sostanza chimica onnipresente, senza l'interferenza di artefatti solvente, una considerazione particolarmente importante in tossicologia acquatica. Questi metodi consentono anche la verifica della concentrazione di STC in soluzione e quantificazione degli effetti che le sostanze chimiche, come il TCS, hanno sulla degranulazione dei mastociti. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli effetti di una vasta gamma di sostanze chimiche sulla degranulazione dei mastociti, come sospetta endocrini 55, e può potenzialmente essere scalata per screening ad alto rendimento. Inoltre, altri tipi di mastociti possono essere utilizzati in questo saggio in futuro lavoro.

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Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgments

LMW e RHK sono supportati dalla Scuola di Dottorato di Scienze Biomediche e Ingegneria (GSBSE) di UMaine; RHK è stato supportato anche dal Maine Agricultural Experiment Station & Forest. Ulteriori finanziamenti è stato fornito dal National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), il Maine Agricultural Experiment Station & Foresta (Grant Numero ME08004-10, JAG), l'Università del Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF concedere # 1.008.498) , e una ricerca Starter di Grant in Farmacologia / Tossicologia dalla fondazione PhRMA (JAG). Ringraziamo Drs. David Holowka e Barbara Baird per l'antigene e cellule. Siamo grati a Hina Hashmi, Alejandro Velez, e Andrew Abovian aiuto con attrezzature e gli ordini. Questo è il Maine Agricultural Experiment Station & Forest numero di pubblicazione 3311.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RBL-2H3 Cells

 ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

 Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

 Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

 Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

 Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

 Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

 Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

 Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

 J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

 VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

 Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

 J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

 Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

 Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

 EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

 Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

 Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

 Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

 Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

 VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

 Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

 Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

 VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

 VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

 VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

 VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

 VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

 Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

 BioTek

Module S

Hematocytometer

 Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

 VWR

97042-634

Centrifuge

 Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

 VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

 The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

 ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

 VWR

Range: P2-P1000

Balance

 Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

 Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

 Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

 Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Acetate Buffer, pH 4.4

 Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

 Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

 26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

 135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

 Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
Plastic material used:

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

 VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

 VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

 VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

 VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

 N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

 Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

 Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

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References

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Immunologia Numero 81 mastociti basofili degranulazione RBL-2H3 triclosan Irgasan antibatterico β-esosaminidasi allergie asma sostanze tossiche ionoforo antigene fluorescenza micropiastre UV-Vis
Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico
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Weatherly, L. M., Kennedy, R. H.,… More

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

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