Summary
肥大细胞脱颗粒，释放过敏介质，过敏，哮喘和寄生虫防御是很重要的。在这里，我们展示了对脱颗粒的药物和毒物的影响评估的技术 ，方法，最近利用抗菌剂三氯生2，表现出强大的抑制作用。
Abstract
肥大细胞在过敏性疾病和寄生虫的免疫防御中扮演着重要的角色。一旦被激活（ 例如通过过敏原），他们脱颗粒，一个过程，结果在胞吐过敏介质。调制肥大细胞脱颗粒，药物和毒物，可能对人体健康有正面或负面的影响。肥大细胞功能已被详细解剖大鼠嗜碱性白血病肥大细胞（RBL-2H3），使用一种被广泛接受的模型，人类粘膜肥大细胞3-5。肥大细胞颗粒成分和过敏介质β-氨基己糖苷酶的释放，这是线性地随着组胺从肥大细胞6，可以容易且可靠地进行测量通过荧光底物的反应，得到衡量的荧光强度在酶标仪测定是服从高通量研究1。最初发表的NaAl 等1，我们已经适应了这个脱颗粒检测的筛选f药物和毒物，并在这里展示其使用。
三氯生是一种广谱抗菌剂，是存在于许多消费产品，并已发现在人的皮肤过敏性疾病的7-11是一种治疗援助，尽管这种效果的机理是未知的。在这里，我们展示了一个检测三氯生对肥大细胞脱颗粒的效果。我们最近发现，三氯生的强烈影响肥大细胞功能2。在努力避免使用有机溶剂，三氯生与热和搅拌下直接进入含水缓冲液溶解，所得浓度经使用紫外-可见分光光度法（ε280 = 4200 L / M /厘米）12。此协议有可能被使用的各种化学品，以确定其对肥大细胞脱颗粒，并更广泛地说，他们的过敏性潜力。
Introduction
肥大细胞高度免疫效应细胞作为主要介质哮喘，过敏，寄生虫国防和癌变13-16粒。他们居住在几乎所有的血管组织15，他们在那里安全地存储在细胞质颗粒，直到过敏和炎症介质激活脱颗粒。脱颗粒胞吐作用的膜结合的颗粒，这会导致释放的药理学活性的介质如组胺，类胰蛋白酶和白三烯15。这个过程的结果我的启动类型是至关重要安装防御寄生虫以及发起过敏，哮喘和致癌反应15过敏反应。
肥大细胞和嗜碱性粒细胞表达FcεRI受体，高亲和力受体，免疫球蛋白E（IgE）的17。暴露于变应原或抗原导致聚集多个绑定的IgE的FcεRI受体17，它是这个S邻-被称为“交联”的IgE结合的Fc受体发起的脱颗粒过程：酪氨酸磷酸化事件，激活磷脂酶C，钙外流，从内部存储，进入细胞内的钙流入18级联。此钙离子内流所需的脱颗粒，并进一步与膜之前，使颗粒胞吐15信号颗粒融合。在实验中，钙离子载体可以直接穿过细胞膜19，它本质上绕过所有的信号转导的钙离子内流步骤20步骤之前，用于穿梭钙，允许通路目标识别为上游或下游有毒物钙信号20。
的脱颗粒可以迅速和有效地测量通过监测组胺6一起从线性的颗粒，释放到细胞上清液中β-氨基己糖苷酶的释放，但我更加容易去检测使用一个简单的酶 - 底物反应，酶标仪测定荧光产物。这微孔板检测，详载于协议部分，是基于一个健壮的方法最初开发的NaAl 等。1，量化的荧光底物4 -甲基-N-乙酰-β-D-葡萄糖苷的裂解β-氨基己糖苷酶。我们已经修改了药物和毒物检测，以测试效果，三氯生在这里强调。此方法可靠地量化脱颗粒，是一种廉价的替代，例如，流式细胞仪为基础的检测方法（21），有可能很好地适合各种各样的抗过敏的药物的高通量筛选，以及免疫系统的或过敏的化学物质。根据2007年美国国家研究委员会的报告“在21 世纪的毒性测试，最后这一点是特别重要的：愿景和STRAT埃及“（ http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ）的毒理学试验，利用高通量细胞培养，以减少昂贵的使用传统的实验动物，如小鼠的发展，主张。脱粒协议的NaAl 等制定和修改由我们2，利用RBL-2H3细胞系，这是一个公认的模型对人体黏膜肥大细胞或嗜碱性粒细胞3-5同源。 （RBL-2H3细胞培养的方法在哈钦森等人详述22）。本试剂盒也有可能适应任何附加的肥大细胞类型。
三氯生（TCS）是一种广谱抗菌药物，已经使用了30年以上，在医院，个人护理产品和消费品23,24。行动模式为TCS的抗菌特性是抑制脂肪酸的合成，有可能通过抑制烯酰 - 酰基载体蛋白还原酶25,26。它被发现在全球范围广泛的消费性产品如沐浴露，洗手液，牙膏，漱口水，洗手液，其浓度为0.3％或10 mM的24。 TCS的广泛使用，导致在人类27-29河流和溪流30的检测水平。由Allmyr 等人所做的一项研究27表明，TCS和它的代谢产物是存在于血浆和哺乳期的母亲的牛奶。重要的是，TCS很容易被吸收到皮肤31-37。 Queckenberg 等37〜12小时内进入人体皮肤吸收10％〜70毫米TCS霜，造成重大浓度在皮肤上，肥大细胞的所在。
TCS已经临床管理人力过敏性皮肤病7-11，但一直默默无闻的机制，TCS缓解过敏性皮肤病38。使用荧光酶标仪测定的详细资料D在这段视频中，我们最近表明，在浓度低至2微米，TCS，极大地挫伤了肥大细胞功能和脱颗粒，提供了一个可能的解释这些临床数据2。除了 这些临床数据提供了一个解释，我们的研究结果帕尔默等人。2表明，TCS目标的下游信号分子钙离子内流。由于钙信号在许多免疫学和其他生物过程的重要性，TCS上的各种必要的生物过程可能会产生不利的影响。事实上，Udoji 等39表明TCS抑制人体自然杀伤细胞溶解活性，另一个重要的先天免疫功能。
除了 其潜在的过敏性皮肤病（或反过来说，作为一个immunotoxicant）作为一种辅助治疗帮助，TCS也可能是一种内分泌干扰物40-49。因此，如何准备这种化学物质在溶液中，我明确的程序s的兴趣毒理学。因为TCS是一个小的疏水性分子，通常用于有机载体，使其更溶于水。在已经过测试，其中TCS的毒性研究，制备涉及在水中溶解的有机溶剂，如乙醇，丙酮，或石油2,50,51与援助。然而，很多时候这些溶剂具有生物活性，从 而解释复杂的化学测试数据51。事实上，根据到Rufli 等。52和53，这是建议的测试解决方案，为水生生物毒性实验准备用物理方法，化学方法，由于化学溶剂创建毒性文物的潜在。我们先前已经表明，TCS溶解在0.24％的乙醇/水（体积/体积），超声处理30分钟挫伤RBL肥大细胞脱颗粒2。浓度高于0.24％的乙醇溶液，在已被证明能抑制肥大细胞的退化会使nulation 54,55例有机溶剂毒性研究的潜在混杂因素的影响。
它不仅是重要的考虑溶剂对生物体或细胞用于研究的效果，而且还监测效果的溶剂测试化学品本身是很重要的。例如，Skaare的等51发现：TCS，溶解在聚乙二醇（通常在牙膏和漱口水）减弱健康女性女性的抗细菌和抗牙斑的作用，而在油中的溶解引起的功能完全丧失。因此，不同溶剂的能力来调节毒物和药物，包括TCS，效果应该考虑在试验设计。油或有香味的添加剂的使用，可能会干扰的影响，在各种产品中的TCS 50,51。
在努力以消除需要使用有机溶剂，我们改进我们的方法溶解TCS 2时，通过消除使用的有机溶胶发泄。在本协议中，我们直接TCS颗粒溶解成水缓冲热（≤50℃），然后验证的浓度这TCS股票的紫外 - 可见分光光度法。这些改进是可能的，因为TCS是易溶于水高达40μM（ http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ），并已被证明至抗蚀剂的降解，当加热到50℃（ 呻/ oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ）56,57。我们也有额外的好处，紫外-可见分光光度法，TCS也被称为摩尔消光系数为4200 L / mol /平方厘米的12强烈地吸收280 nm处58。
到一个缓冲区中的有机溶剂不借助溶解TCS颗粒，该协议提供了一个简单而有效的方法，包括低成本和快速验证浓度，并描述了一个强大的荧光微孔板检测监控化学作用于肥大细胞脱颗粒。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
请注意，所有的缓冲液配方，包括在一个表中，在结束的协议文本。
第1天 ：
1。细胞的制备
- 规划出96孔板设置方案，围绕测试样品上的布局，以避免边缘效应。分配三个重复每个TCS浓度测试（±脱粒兴奋剂的抗原或载体），以及一式三份自发释放（没有脱颗粒兴奋剂），最大限度地释放（0.2％的Triton X-100 [TX]洗涤剂溶解），以及井保留背景样品（含有无细胞）。对于每个重复实验的一天，选择一个新的随机布局TCS样品浓度。
- 暖RBL媒体（配方表中提供）和胰蛋白酶在37℃水浴。
- 一般良好愈合的迹象，检查RBL细胞在T-25烧瓶（2-4天，因为最后一段少于3-4个月，因为他们被解冻）TH：适当的pH值由色彩的媒体表示，缺乏云。将烧瓶放置在光学显微镜下确认，该烧瓶中有污染，细胞出现健康的，合适的汇合，大多连接。需要注意的是，应检查细胞支原体污染大约每六个星期22。
| 治疗 | 一式三份 |
| 刺激，0微米TCS | A7，B7，C7，F4，G4，H4 |
| 刺激，0.001微米TCS | F6，G6，H6 |
| 刺激，0.1微米TCS | A4，B4，C4的 |
| 刺激，1微米TCS | A6，B6，C6 |
| 刺激，5微米TCS | F5，G5，H5 |
| 刺激，10微米TCS | A3，B3，C3 |
| 刺激，15微米TCS | A5，B5，C5 |
| 刺激，20微米TCS | F7，G7，H7 |
| 的刺激，再加上最高[TCS] | F3，G3，H3 |
| 自发的，没有TCS（包括嘲笑） | A10，A11，A12，B10，B11，B12的A1，A2，A8，B1，B2，B8，C1，C2，C8，F1，F2，F8，G1，G2，G8，H1，H2，H8 |
| TX-100，没有TCS | D10，D11，D12，E10，E11，E12 |
| 无细胞，背景，再加上最高[TCS] | G10，G11，G12，H10，H11，H12 |
点击这里查看大图 。
- 以RBL细胞瓶中进入无菌组织培养（TC）罩。将细胞附着的机器人汤姆的烧瓶中。 TC罩下工作，使用标准的无菌技术，用无菌吸管从瓶中取出所有媒体;细胞仍然附着在烧瓶底部。接下来，冲洗量瓶中，用2毫升胰蛋白酶，然后丢弃这个洗。
- 正是加入2毫升的胰蛋白酶覆盖瓶底。放入到37℃培养箱中培养5分钟，以使细胞从烧瓶底部分离。
- 5分钟后，将烧瓶与一个张开的手掌打在边松开细胞。随即，关闭烧瓶中加入18毫升RBL媒体洗涤细胞，解渴的胰蛋白酶。立即采取细胞介质胰蛋白酶混合物的烧瓶中，并转移到一个新的，无菌的50毫升管（在该管的总体积为20毫升）。
- 混合后轻轻，但彻底的，从这个管取出50微升细胞悬液，然后转移到1.5毫升无菌离心管中，这是一个样品进行计数。以这个样本，以及50毫升0;管含有细胞媒体胰蛋白酶混合物TC罩的工作台。
- 8分钟，在500 XG旋转50毫升离心管（有适当的平衡），这股力量颗粒细胞有效。
- 在自旋时间，细胞计数在样本中分离出的纺前。要做到这一点，首先加入50微升台盼蓝染料50微升的细胞在1.5毫升管，轻轻但彻底吸管向上和混合了5倍。随即，10微升这种混合物转移到玻璃血细胞计数，并按照制造商的说明在网格区域的细胞计数。合理的统计结果，至少有100个细胞计数。
- 早在TC罩，除去上清液细胞降速。
- 盖上细胞管型，滑动沉淀在试管底部，松开细胞。
- 上传媒体对胰蛋白酶消化细胞，得到密度为0.5×10 6细胞/ ml，根据细胞计数。 轻轻拌匀，但保持细胞悬浮在电镀过程中。使用的Pipetman，将100微升细胞/孔在96孔平板（平板，黑色底）后，板模板书。随机细胞如何被添加到水井，以免系统误差，混匀后，各组三口井被添加。请务必不要把细胞背景样品标记为入井。
- 一旦所有的细胞已经转移，将板到板盖，并转移到孵化器（37℃/ 5％CO 2）过夜。清理后的标准的无菌技术。
第2天 ：
2。制备三氯生
- 使用带刻度的量筒，措施250毫升的Tyrodes缓冲液（配方中提供的表）到500ml的锥形烧瓶中，标记为“TCS-缓冲液中。加入搅拌棒。使用玻璃器皿，搅拌棒，温度计指定仅用于与TCS。
- 此外，在这个时候，测量250毫升的Tyrodes到一个单独的500毫升锥形瓶中，标有“控制的缓冲区。”使用玻璃器皿，搅拌棒，温度计不被指定为TCS。添加搅拌栏。
- 掂量出0.0022克，TCS颗粒，并转移到“TCS缓冲区”瓶（即含有250毫升的Tyrodes缓冲器）。为了有效地颗粒转移至锥形瓶中，用10毫升从测得的250毫升的Tyrodes洗掉重船，确保所有TCS已经转移。
- “TCS缓冲瓶上的组合烤盘/磁力搅拌板，将它设置为一个便于管理高速搅拌。一旦混合，TCS股票名义上是30μM（实际浓度将加热后计算）。 （所有的混合化学通风柜）。
- 此外，在这个时候，这里的“控制缓冲区”烧瓶（不包含TCS）组合的第二加热板/磁搅拌盘上，并且将其设置为在类似的速度搅拌。
- 打开紫外/可见光灯热身灯供以后使用。
- “TCS缓冲”的解决方案，到50°C加热，同时不断搅拌。一旦达到正常温度，时间为90分钟。在90分钟期间，继续监测50℃的温度和适当的搅拌速度频繁。
- 同时，“控制缓冲区”的解决方案（这是平原的Tyrodes缓冲区仅有250毫升）加热至50℃，并不断搅拌。一旦达到50℃，时间90分钟，在此期间，温度（保持在50℃）和搅拌的同时监测。
- 在90分钟结束，两个锥形瓶中，断热板和转移到台式。
- 在紫外/可见分光光度计使用的波长扫描功能，空白机加热“控制缓冲区”的解决方案在扫描1毫升的温水“TCS缓冲”的解决方案之前，1毫升。检查的频谱形状，D记录在280 nm处的吸光度值。 ε= 280升浓度的确定，使用比尔-朗伯方程（A 280 C）用ε280 4200 L / mol /平方厘米的12ℓ1厘米。
- TCS浓度确定后，添加0.249克的牛血清白蛋白（BSA），剩下的249毫升的“TCS缓冲”解决方案，并拌匀。
- 同时，加0.249克BSA余下的249毫升的“控制缓冲区”的解决方案，并拌匀。
第2天 ：
3。抗原刺激的使用RBL-2H3细胞的脱颗粒的含量
- 在开始之前，请检查所有正在使用的缓冲区的pH值，并确保他们清楚，不混浊：这包括的Tyrodes缓冲区，醋酸钠缓冲液，甘氨酸碳酸盐缓冲液（配方表）。
- 温暖的的RBL媒体和胰蛋白酶在37℃水浴。
- 让BT（1毫克/毫升0; BSA Tyrodes缓冲）：0.05克。BSA + 50毫升Tyrodes缓冲区（X2）。放入37℃水浴。
- 0.2％的Triton X-100：3.136毫升BT + 64微升10％的Triton X-100（终浓度的Triton X-100是0.2％）。拌匀反转，但不要旋涡。放入37℃水浴。
- 开始准备的TCS和加热的Tyrodes缓冲区（步骤“2”以上）。 注意 ：不要启动下一步（IgE的曝光），直到“TCS缓冲”和“控制缓冲区”的解决方案，达到50℃，搅拌第70分钟，90分钟加热/搅拌时间。
- 一旦双方的解决方案已经在50℃下搅拌70分钟，使0.1微克/毫升抗DNP小鼠IgE（Sigma公司）的样品井的RBL媒体的敏化（100μl/孔）。 IgE的股份，不得超过30天，保存在4℃;记录股票怎么老。滑动混合，但不要涡的IgE。
- 在一个TC罩，6毫升RBL媒体在50毫升管中加入0.6微升IgE的股票（股票为1毫克/毫升）。在第二个50毫升的试管中，加6毫升纯RBL媒体（其目的是为不灵敏样品）。
- 转储所有媒体从96孔板（第1天）成片，，并带来TC罩下盘。
- 随机添加的100微升媒体/ IgE的混合物，应刺激（共48口井）的井。该混合物中的目的不是为“自发的”，“传送”和“背景”的样品。
- 随机加100微升平原的RBL媒体只“TX”，“自发”和“背景”井。
- 板将板盖，然后将板放入5％CO 2/37℃培养箱中培养1小时。
- 在孵化1小时，按照的步骤3.13 - 3.24。
- 在工作台，准备抗原稀释。加入0.53微升1.6毫克/毫升的股票DNP-BSA + 850微升＆＃160; BT得到的抗原浓度为1微克/毫升。涡和反转此股票混合。
- 一旦“TCS-缓冲液”和“控制缓冲器”被加热，然后在50℃下搅拌90分钟，继续使用该制剂的其余部分在TCS协议（步骤2.6 - 2.8.1）。商业软件联盟（BSA）溶解到这两个解决方案后，继续下面。
- 开始准备，±银，±TCS曝光缓冲区。首先，从“TCS-缓冲液的溶液（已经被加热和搅拌90分钟），转移50毫升到一个新的50毫升锥形管的249毫升的样品。取出这50毫升和20微升20微升1微克/毫升提前准备作最后的抗原浓度为0.0004微克/毫升DNP-BSA抗原取代它。涡和反转。
- 标签“管1，高TCS /银/ + BT”。它用于稀释和最高TCS浓度接触。
- 从249毫升样本“控制缓冲区”的解决方案，将50毫升到一个新的50毫升管。删除这个新的50毫升等分的20微升和更换用20μl的提前准备的一个最后的抗原浓度为0.0004μg/ ml的DNP-BSA 1μg/ ml的抗原。涡和反转。
- 标签这个“管2，无TCS / +银/ + BT”。用于的TCS稀释和0微米TCS浓度接触。
- 现在拿出50毫升的“TCS缓冲”的解决方案，并放入另一个50毫升管。从这个新的50毫升，取出20微升20微升纯BT取代它。涡和反转。不添加抗原。
- 标签这个“管3，高TCS /无银/ + BT”这是用于背景。
- 转移“控制缓冲区”的解决方案，另外50毫升管50毫升。从这个东北取出20微升 W 50毫升和20微升纯BT取代它。涡和反转。 （无银加。）
- 标签这个“管4，无TCS /银/ + BT”这是用于背景和自发样品。
BSA TCS 抗原 管1 
高[] 管2 NO 管3 / files/ftp_upload/50671/check.jpg的“宽度=”15px的“/> 高[] NO 管4 NO NO - 计算并记录确定“TCS缓冲”股票的浓度稀释后卷。总成交量为每个稀释浓度应该是1毫升，并应做好无菌的离心管。使用校准P2和P1000的Pipetman。
浓度 高三氯生+ Tyrodes + BSA 0.0004微克/毫升银
（从上面的管1）加热BT 0.0004微克/毫升银
（从上面的管2）20μM 10μM 5微米 1微米 0.1μM 0.001μM 0微米（板顶） ----------------------- 500微升另加500微升 0微米（板底部） ----------------------- 500微升另加500微升 - 1小时后IgE的孵化，板的孵化器和媒体折腾成片。 （注意：如果测试是已知的化学物质的毒性比消费产品TCS，危险废物处置可能是必要的。）
- 使用一个Combitip，随机洗与BSA-Tyrodes缓冲液（200细胞在96孔板微升/孔）。推出的洗涤缓冲液的孔的侧面上，而不是直接安装在贴壁细胞，以避免干扰连接的细胞。第二次重复的过程。
- 为了准备治疗应用，涡旋反转前除了板稀释。
- 与板的顶边的开始：随机添加到相应的孔中各加入200μl的抗原溶液（具有正确的浓度的TCS）一式三份。继续板块的底部。添加“控制缓冲”解决方案，再加上银（从“管2”以上）的平板上的所有“嘲笑”。
- 添加200微升适当的解决方案，以相应的井：
- 添加200微升0.2％的Triton X-100“TX”指定井。
- 接下来，添加200微升3标有“背景（BKGD）最高TCS”上盘3口油井管。
- 最后，添加200微升管4至6口井的标有“自发的。”
- 孵育板1小时，在37°C / 5％的CO 2。
- 在1小时孵化：两桶冰（在孵化器的“老”板和新板）。解冻4 - 甲基伞形酮-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷（4-MU），在室温下搅拌40分钟，保持箔，因为它是光敏感。
- 一旦4-MU股票解冻，弥补4-MU的工作解决方案：150μL股票+ 14.85毫升冷醋酸缓冲液（配方表中给出）;涡和反转。请在50毫升离心管中，在铝箔包裹，直到用冰。
- 使用Combitip，随机加100微升冷到一个新的雷尼尔黑色96孔板（在冰桶＃2）每口井最底部的4-MU的工作解决方案。首先启动的工作溶液添加随机的顶部内板，内随机盘底，内随机的Triton X-100的井和背景井终于内随机。
- 获取了一盒新的P200提示下一步。
- 结束1小时孵化，从孵化器把单元板到冰桶＃1，吸上清上下的4-5倍（轻拿轻放，不引入气泡），绕来绕去以及良好的混合，但不接触的细胞，而混合。系统化，取出25微升样品从每口井和地点到新板基板（样品相同的顺序，按原定计划）。移液器上下彻底混合样品，在新井时，没有引入气泡。
- 于37°C / 5％CO 2中温育30分钟。
- 孵育30 min后，随机加200微升的每口井的冷甘氨酸碳酸盐缓冲（使用Combitip），以填补高达325μL总井。 （请这除了去年的Triton X-100样品，避免的Triton X-100外溢）。检查阅读前板泡沫（用干净P10吸管捅TE尖头弹出任何气泡）。
- 运行板块中的荧光酶标仪（第4条）。
第2天 ：
4。荧光酶标仪指令和数据分析
- 打开GEN5方案，并开放性实验部分。
- 打开板读数器和插入板（左上角为A1）。
- 协议
程序阅读设置自定义的读数。有关样品中不添加任何东西，复制等 ，从每口井，以收集原始荧光数据。 - 在“阅读”选择“荧光”，“端点”，“常速”，“增益40，”励磁360/40“，”排放460/40，“光学位置：50％。顶级光学偏移：7M米无震动，无延迟，无动力学，没有监测井，温度：孵化器关闭。
- 选择地势平坦的黑色底，96孔板（雷尼尔96孔平底）。
- 协议处理板布局： 板布局。设置没有说明重复，稀释等样品
- 盘阅读。
- 保存文件：点击“创先争优”按钮，将数据导出到Excel文件。板布局和矩阵。将文件保存在电脑上的USB驱动器上。
- 在Excel中，减去平均背景阅读从每个样品中，包括的Triton X-100口井。
- 计算相对％的Triton X-100的平均价值除以每个值（已经扣除背景）脱颗粒，然后乘以100，使它的百分比。
- 平均一式三份，并计算标准偏差。在Excel中的图形数据平均值±标准差。统计测试，现在移动GraphPad棱镜软件。
第2天 ：
5。钙离子载体刺激RBL-2H3细胞脱颗粒含量
- 按照协议“细胞制备”（第1节，第1天）和“制备三氯生”（第2节，第2天），上述指示。离子载体刺激的板的布局的例子如下所示。
治疗 一式三份 刺激，0微米TCS A7，B7，C7，F4，G4，H4 刺激，0.001微米TCS F6，G6，H6 刺激，0.01微米TCS F3，G3，H3 刺激，0.1微米TCS A4，B4，C4的 刺激，1微米TCS A6，B6，C6 刺激，5微米[TCS F5，G5，H5 刺激，10微米TCS A3，B3，C3 刺激，15微米TCS A5，B5，C5 刺激，20微米TCS F7，G7，H7 自发的，与DMSO，无TCS（包括嘲笑） A10，A11，A12，B10，B11，B12的A1，A2，A8，B1，B2，B8，C1，C2，C8，F1，F2，F8，G1，G2，G8，H1，H2，H8 TX-100，用DMSO，没有TCS D10，D11，D12，E10，E11，E12 无细胞背景，用DMSO，再加上最高[TCS] G10，G11，G12，H10，H11，H12 
点击这里查看大图 。 - 在开始之前，请检查正在使用的所有缓冲区的pH值，并确保他们是明确的，不混浊。的Tyrodes，乙酸钠缓冲液，甘氨酸碳酸盐缓冲液（在表中提供的配方）。
- 准备一个50毫升锥形管的BT加入0.05克BSA〜50毫升的Tyrodes缓冲区和涡旋拌匀。在37℃水浴孵育。
- 0.2％的Triton X-100，0.0032％的DMSO（钙离子载体的最终浓度）的车辆中，通过加入96微升10％的Triton X-1004.704毫升BT。拌匀。接下来，取出0.155微升这种解决方案，并丢弃。现在加回100％DMSO 0.155微升。
- 准备一个5毫米的股票（2.5毫克/毫升）A23187载体粉末加入400微升新鲜的100％DMSO成的载体小瓶和涡旋混合。一旦在溶液中，转移到1.5毫升锥形管，记录内容和今天的日期和到期（3个月内准备妥善储存在-20°C时）。
- 另外，如果使用冷冻该股今日解冻，冰，检查5毫米A23187载体混合清晰。涡，一抖，使用前反转此股票。记录日期＃A23187的准备和地段。
- 一旦的“TCS缓冲”和“控制缓冲区”已加热和搅拌90分钟，继续剩下的编制为TCS协议（转到步骤2.6-2.8.1）。 BSA后混入这两种解决方案，继续与余下的协议的步骤。
- 从249毫升样品“TCS缓冲的”解决方案，将50毫升到一个新的50毫升锥形管。取出1.8微升50毫升加1.8μL5 mM的载体股票。涡3，持续8秒，反转3倍。最终载体浓度为180纳米。请注意，此浓度的钙离子载体A23187会有所不同根据库存效力，和建议，找出引出一个水平的约20％的最大释放，这已被确定为无细胞毒性的RBL-2H3细胞脱颗粒的浓度的钙离子载体A23187，A23187离子载体剂量反应细胞的细胞毒性测定（参见图2）。
- 标签这个“管1，高TCS /离子载体/ + BT”。用于稀释和最高TCS浓度接触。
- 从249毫升样本“控制缓冲区”的解决方案，将50毫升到一个新的50毫升锥形管。取出1.8微升50毫升，并加回1.8微升5毫米载体股票。涡3，持续8秒，反转3倍。最终载体浓度为180牛米。
- 标签“管2，无TCS /离子载体/ + BT。”这是用于稀释和0微米TCS浓度。
- 从249毫升样品的R 20; TCS缓冲“解决方案，将50毫升到一个新的50毫升锥形管。 1.8微升的新的50毫升，加入1.8微升的100％DMSO。涡3倍，持续8秒，反转3倍;无载体。
- 标签这个“管3，高TCS /无钙离子载体/ + BT / + DMSO”;用于背景。
- 从249毫升样本“控制缓冲区”的解决方案，将50毫升到一个新的50毫升锥形管。取出1.8微升，新的50毫升和100％DMSO中加入1.8微升。涡3，持续8秒，反转3倍。不添加钙离子载体。
- 标签这个“管4，无TCS /无钙离子载体/ BT / + DMSO”;用于自发释放样品。
BSA TCS 载体 增加了100％DMSO 管1 “SRC =”/ files/ftp_upload/50671/check.jpg“宽度=”15px的“/> 高[] NO 管2 NO NO 管3 高[] NO 管4 NO NO ECK标记“FO：内容宽度=”.1“SRC =”/ files/ftp_upload/50671/check.jpg“宽度=”“/> 15px的 - 计算并记录确定“TCS缓冲”股票的浓度稀释后卷。使用校准P2和P1000的Pipetman。总成交量为每个稀释浓度应该是1毫升，并应做好无菌的离心管：
浓度 高三氯Tyrodes + BSA +180 NM A23187（管从上面） 加热BT +180 NM A23187（管从上面） 20μM 15μM 10μM 5微米 1微米 <TD>0.1μM 0.001μM 0微米（板顶） ---------------------------------- 500微升另加500微升 0微米（板底部） ---------------------------------- 500微升另加500微升 - 以昨天镀细胞的孵化器，空传媒入水槽。使用一个Combitip，随机洗涤细胞与BT（200μl/孔）在96孔板。重复洗了第二次。
- 为了准备治疗应用，涡旋反转前除了板稀释。与板顶部分开始：随机加200微升一式三份的正确浓度的TCS到corresponding良好。继续板块的底部。添加“控制缓冲区”的解决方案加上A23187（从“管2”以上）盘上的所有“嘲笑”。
- 添加200微升适当的解决方案，以相应的井：
- 添加200微升0.2％的Triton X-100“TX”指定井。
- 接下来，添加200微升3标有“背景（BKGD）最高TCS”上盘3口油井管。
- 最后，添加200微升管4至6口井的标有“自发”。
- 孵育板1小时，在37°C / 5％的CO 2。
- 在1小时的潜伏期：两桶冰（在孵化器的“老”板和新板）。解冻4 - 甲基伞形酮-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷（4-MU），在室温下搅拌40分钟，保持箔，因为它是光敏感。
- 一旦4-MU股票解冻，弥补4-MU工作的解决方案：150微升股票+ 14.85毫升冷醋酸缓冲液（配方表中给出）;涡和反转。请在50毫升离心管中，在铝箔包裹，直到用冰。
- 使用Combitip，随机到最底部一个新的雷尼尔黑色96孔板（在冰桶＃2）每孔加入100μl冷的4-MU的工作解决方案：首先启动内随机的顶部加入工作液板，内板，内随机的Triton X-100的井的底部，最终内随机背景井随机。
- 获取了一盒新的P200提示下一步。
- 结束1小时孵化，从孵化器把单元板冰桶＃1，吸上清向上和向下的4-5倍（轻拿轻放，不引入气泡），绕来绕去的以及良好的混合，但不接触的细胞，而混合。系统化，取出25微升样品到新板基板（萨相同的顺序从每口井和地点的mples，按原定计划）。移液器上下彻底混合样品，在新井时，没有引入气泡。
- 于37°C / 5％CO 2中温育30分钟。
- 孵育30 min后，随机加200μL冷甘氨酸碳酸盐缓冲液，每孔（使用Combitip），以填补井325μL总（的Triton X-100样品最后，来避免的Triton X-100外溢）。检查气泡阅读前板（用干净的P10的枪头捅弹出任何气泡）。
- 运行该板块中的荧光酶标仪（按照第4节中的所有步骤）。
程序
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
当加热至50℃下进行90分钟的UV-Vis吸收光谱为TCS产生一个强大的，平滑的曲线之间的260〜300nm的，在280nm处具有峰值，如在图1中示出。紫外-可见分光光度法，因此，一个重要的工具，可以用来计算浓度，既然发布的在280nm处的摩尔吸光系数为4200升/ 12摩尔/厘米。我们已经发现，TCS不会掉出的时间范围内的整个脱颗粒实验的溶液后，50℃加热（数据未示出）。
使用这种加热方法直接进入含水缓冲液溶解TCS后，我们研究了影响TCS的肥大细胞脱颗粒，使用基于荧光的测定，这是优化的NaAl 等。1此检测记录水平的β-氨基己糖苷酶的释放从肥大一个小时的孵育后，细胞通过检测荧光底物的商品。无论是刺激脱颗粒DNP-BSA抗原或钙离子载体A23187（ 图3）（图2），可以清楚地看到，TCS会导致显着的剂量-反应抑制β-氨基己糖苷酶的释放（ 即脱颗粒）。
图2是代表IgE致敏的的RBL细胞中，孵育1小时，在“TCS-缓冲液”或“控制缓冲器，”暴露0.0004微克/毫升到DNP-BSA抗原剂量得到的结果。这种浓度的DNP-BSA引起，其平均绝对脱颗粒反应的22.5％±0.1（平均值±标准差）的情况下的TCS。统计学上显着的抑制脱颗粒的时间开始在5μM，脱颗粒水平分别为0.79倍±0.05（平均值±标准差）的0μMTCS控制水平。随着TCS浓度的增加，还有一个更大的缓冲作用，TCS，呈现出强劲的剂量反应关系。在20微米，TCS，almos完全废除脱颗粒反应，自发脱颗粒（如无抗原存在）大致相等的水平。总体而言，该图中显示了较强的抑制多价抗原刺激肥大细胞脱颗粒，由于浓度验证的TCS，在使用有机溶剂的情况下。
在图3中，钙离子载体A23187，作为一种方法来调查TCS-诱导的在RBL肥大细胞脱颗粒抑制的机制。 A23187是用来作为一种替代的兴奋剂，因为它绕过了FcεRI交联和其他信号事件上游的钙离子内流，但仍引起脱颗粒。 RBL肥大细胞孵育1小时，在“TCS-缓冲液”或“控制的缓冲液，含有钙离子载体剂量为180 nM。浓度的钙离子载体A23187的TCS的情况下，这引起了25.1％，其平均绝对脱颗粒反应的±4.7（平均值±标准差）。抑制脱粒发现与1微米少TCS（0.63±0.11 [平均值±SD]）。作为TCS浓度的增加，抑制的严重程度：5μM，0.21倍±0.04 0μMTCS控制水平，10μM，0.09±0.05，在15μM，0.077±0.006，在20μM的0.09±0.02（平均值±SD）。事实上，从5微米和较高浓度的TCS，各级A23187诱导脱颗粒被发现附近的自发控制水平（没有A23187是目前在所有）。总体而言，结合图2，图3中，表示由TCS对象的分子事件有可能钙离子内流的下游。
图1：代表TCS紫外-可见吸收光谱。TCS有一个强大的豌豆k在280 nm处，便于测定A 280，以及负担能力使用4200 L / mol /平方厘米的12摩尔消光系数确定TCS溶于的Tyrodes缓冲区中的实际浓度。黄线表示在280 nm处的峰值。在这个例子中，在280 nm处的吸光度值是0.11876，这表明了TCS浓度为28.28μM。 点击此处查看大图 。
图2：一个有代表性的IgE致敏的RBL肥大细胞的脱颗粒反应暴 露0.0004μg/ ml的DNP-BSA抗原和TCS（0-20μM）。甲自发释放值（无抗原）的描述以供参考。数值代表的意思7，标准偏差一式三份样本。所提出的数据进行归一控制（0μMTCS），以及一个Tukey的post hoc检验 （0.001μMTCS平均响应的比较）接着用单因素方差分析，显着性差异在棱镜的软件确定。表示的意义是由*** P <0.001。 点击这里查看大图 。
图3：180纳米钙离子载体A23187 TCS（0-20微米）的存在，RBL刺激肥大细胞脱颗粒反应的一位代表。自发释放样品（无载体礼物）描绘，以供参考。价值观代表一式三份样品的平均值±标准差。由于PRESENTEð，数据被归一化到控制（0μMTCS），后跟一个Tukey的post hoc检验 （0.001μMTCS平均响应的比较）用单因素方差分析，显着性差异在棱镜的软件确定。意义是代表*** P <0.001; ** P <0.01。 点击这里查看大图 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
的NaAl 等[1]在2004年，开发高通量检测脱颗粒肥大细胞生物传感器。它是一个强大的检测，我们已经适应了我们的TCS研究，在这部影片中详述。在此之前的NaAl 等。1法，肥大细胞脱颗粒已常规通过评估β-氨基己糖苷酶的59-61，但这些早期的方法，利用一次读取一个样本的荧光。重要的是，的NaAl 等 。他们利用高通量的方法样品一读，一时间在荧光酶标仪和以前方法之间建立了直接的一致性。的NaAl 等1总之，大大提高的速度，功率，简单，和检测的可靠性适应一种高通量微孔板平台，以及通过合并一些更改工作流。这里，我们已经进一步适应各种测试的化学品，该测定的研究，特别是，在这里，无处不在药物TCS的。视频详细介绍了这个非常有用的检测步骤。此外，我们还开发了一种有机溶剂的方法申请TCS在水溶液缓冲，我们显示了一个简单的，低成本的程序验证TCS浓度。这些方法应该是有帮助的三氯生毒理学领域明显增长。在这次讨论中，我们详细使用此脱颗粒的检测，以测试其他化学品以及几方面的考虑。
TCS直接进入含水缓冲液制备的有机溶剂不借助验证的UV-Vis分光光度法（ 图1）的浓度，然后检查的TCS（<30μM）的效果，对肥大细胞脱颗粒（ 图2和3）使用荧光微孔板检测来检测是否存在β-氨基己糖苷酶，脱颗粒的替代指标。我们已经发现，TCS是能够显着抑制的β-hexosa的释放氨酸酶从RBL肥大细胞时，溶解在乙醇中的低浓度（0.24％体积/体积）2或，这里所描述的，直接进入含水缓冲液。通过上述有机溶剂，实际上我们看到更为显着抑制抗原诱导细胞脱颗粒相比，我们的研究中，TCS溶解在0.24％乙醇（体积/体积）。例如，在这里我们已经证明抗原诱导细胞脱颗粒减少> 50％（0.46倍±0.07），这是远远大于〜25％的减少，我们报为10μMTCS溶解在0.24％乙醇（0.76倍±0.02）2。同样，我们确定为A23187刺激的细胞，通过5微米，TCS抑制脱颗粒自发释放水平没有表现出这样的效果至10微米TCS在我们前面的，利用乙醇，研究2。这种差异的原因有两种可能：要么0.24％乙醇车2衰减TCS的能力，抑制肥大CEL活跃升脱颗粒，或在TCS我们使用的是集中比预期少（因为浓度不经紫外-可见分光光度法，在先前的研究中2）。关于TCS的肥大细胞脱颗粒抑制的分子靶标，它是有可能发生的钙离子内流2的信号转导级联的下游某处。我们用钙离子载体A23187作为脱颗粒兴奋剂绕过早期信号事件，并持续TCS的抑制效果，表明TCS抑制脱颗粒途径的目标是不太可能位于上游的钙离子内流。我们以前曾表明，膜皱裂，这些细胞也抑制由于TCS的处理，提示共同通路靶2的可能性。
以前的研究已经发现TCS的具有最大峰值在280nm处的摩尔吸光系数进行评价，以4200升/摩尔/厘米，这wavelen的吸收光谱的g个（在pH值低于pK a值）12。它已被证明，加热TCS不会导致热降解57，另一项研究中已显示成功TCS在水中溶解，同时加热至50℃，无援助的有机溶剂的56。当任何新的试验化学品的使用，其在水性缓冲液中的溶解度，当然，必须仔细考虑。我们还发现，加热时的TCS，光谱读出的形状的影响，无论是加热40-90分钟（数据未显示），这表明缺乏对TCS的降解一段较长的加热时时间。但是请注意，该TCS溶解40分钟，在90分钟比更大。此外，我们已证实，TCS不会掉出溶液的脱颗粒实验（数据未示出）的持续时间。
DNP-BSA抗原和钙离子载体的浓度在本研究中所用的抗原和载体的剂量反应实验的基础上，选择一个d的选择，引起脱颗粒适中水平，代表图2和3。抗原的剂量反应实验的一个例子，可以看出，在图1A中，我们先前的工作2。当确定在实验中使用的抗原或离子载体浓度时，重要的是要注意，兴奋剂剂量反应实验需要定期进行，通常为至少每两个月一次，因为有时RBL-2H3细胞的功能可变。产生所需的脱颗粒百分比的浓度可以取决于细胞的年龄和抗原/载体制剂。此外，正如我们所看到的无机砷的22，绝对的脱粒百分比（抗原水平）可以影响毒物作用的水平RBL脱颗粒，所以在几个不同的抗原/载体浓度毒物的剂量-反应应该做。同样重要的是要考虑最终conce刺激脱颗粒时ntration DMSO载体与离子载体，二甲基亚砜（DMSO）62，自脱颗粒的影响。我们已经发现，在这个协议中的DMSO浓度不影响脱颗粒，背景阅读，或0.2％的Triton X-100值2。
除了多价抗原DNP-BSA和钙离子载体A23187，存在刺激RBL-2H3的许多其他的方法。这些方法之一是通过曝光以及槲皮素63化合物48/80的刺激。另一种是交联的抗IgE抗体IgE结合的受体，如我们之前测试过的一起TCS曝光2。存在许多其他的刺激方法，这些方法中的每一个地址不同的机理方面的肥大细胞脱颗粒。这板读数器测定，可以适合于许多使用这些替代刺激器，进一步扩大了它的效用。
此脱颗粒协议有可能被用于各种各样的枝学品。任何使用该测定的试验化学品在一项研究中，必须运行控制项目如下：（1）测定化学物质的背景上（无细胞）读数的影响，（2）自发脱颗粒（IgE的细胞没有影响的化学，无抗原性，无离子载体）（3）的化学品的Triton-X-100裂解细胞（无抗原，无离子载体）的值的效果。这些测试可以很容易地加工成板布局。以前，我们发现TCS的影响没有这三个参数2。此外，测试运行，以确定试验物质不干扰与β-氨基己糖苷酶的酶/底物反应本身无细胞制剂，Palmer 等人附录A的补充数据部分中所描述的图S1。我们发现，TCS不会干扰的能力的β-氨基己糖苷酶的荧光底物裂解4-MU 2。使用任何溶剂的影响，还必须考虑在所有这些控制实验。例如，我们确认，DMSO，为离子载体的溶剂，没有任何效果的Triton-X-100的样品的荧光水平（数据未示出）上。我们也注意到，我们选择在这项研究中使用的所有塑料不含有内分泌干扰物双酚A，不过，遗憾的是，目前市场上的所有塑料可能确实包含了一些内分泌干扰活性，这可能混淆数据64。
故障诊断是必需的事件，几个潜在的方面，这个协议应该检讨。例如，这可能是因为（1）自发释放水平过高（大于％〜7％的溶解值），（2）未观察到与任何兴奋剂和/或测试化学剂量反应，或（3） TCS在溶液中的浓度太低（低于20μM）。在第一种情况下，一个高自发的水平可能是一个迹象在文化过长或支原体污染的细胞，因此尝试这些实验一直在2-20周之间的文化与RBL-2H3细胞，并定期检测支原体。如果一种兴奋剂的剂量反应不遵守，可能是的溶解兴奋剂浓度太低，股票应该重拍。作为一个例子，钙离子载体通常被提供为薄膜，用DMSO进行复原，需要小心注意，很多的涡流。此外，一个新的载体不同批号的股票可能有不同的效力，只是由于很多很多的变化，因此，一个脱粒剂量响应建议每个新购买的载体股票。这也是值得注意的是，一个给定的测试化学效果明显缺乏可能是一个迹象，这种化学品造成影响，可能需要较长的潜伏期。如果您不是在溶液中实现了TCS产量高，检查的温度一直保持恒定（50℃±5），而颗粒溶解到缓冲区。 Ť他不应该接触温度计的烧瓶的底部，一个位置，会导致在将溶液温度的高估。此外，请确保有不断的剧烈搅拌90分钟倒计时开始，直到温度达到50°C。
表故障排除。
问题 | 潜在原因 | 解 | |||
TCS股票被确定为小于20微米 | 非均匀加热的溶液 | 确保温度计的位置，以便它在溶液中悬浮，并没有接触到烧瓶底部。 | |||
搅拌不够旺盛 | 增加搅拌盘上的磁力搅拌，以获得一定程度的搅拌，剧烈而导致溶液将烧瓶跳出。确保一个适当大小的磁搅拌棒。 | ||||
问题分光光度计 | 允许进行适当的预热UV灯（一般为10分钟），或如有必要，更换灯泡。 | ||||
自发脱颗粒含量过高（> 7％） | 细胞有收购异常的基因突变，由于太多的时间在文化 | 执行一个新的细胞解冻的实验。 | 由于机械剪切的细胞死亡 | 当加入缓冲或处理贴壁细胞，小心，不要扰乱细胞，通过仔细地将这些卷两侧的微孔。练习使用Combitip。 | |
IGE / DNP-BSA的β-氨基己糖苷酶的释放不会造成自发释放水平 | IgE是30天以上，或已遭受冻融 | 使用新的，正确存储等分的IgE。 | |||
DNP-BSA没有得到应有的混合 | 请务必仔细添加小体积的DNP-BSA锥形管和tØ涡流彻底。 | ||||
A23187载体自发释放水平不会造成β-氨基己糖苷酶的释放 | A23187股票没有被正确的重组 | 产品到达作为“薄膜”，并必须重组与护理和太多的震荡。转让再生库存存储到新的1.5毫升管。 | |||
A23187股票还没有被妥善保存 | 股票是光敏感。一旦重组，封口膜顶部，并存储在铝箔包裹在-20°C。如果有一个问题是关于存储的股票，放弃并开始测试一个新的股票。 | ||||
180纳米A23187载体不会引起相对的脱颗粒反应，在前面的试验中发现的相同水平的 | 地段 - to-lot变化A23187载体 | 进行剂量反应实验，每一批新载体。我们还建议，股市从同一批次进行测试，由于在重组过程中潜在的变异。 |
在任何毒理学/药理学实验，测试化学品必须不公开的有毒测出的浓度。我们推荐使用的方法，测试细胞凋亡和坏死，单独或组合（如克隆形成实验），以及测试的损坏一般的质膜（如乳酸脱氢酶泄漏）。 TCS，在这项研究中所示的浓度，是没有细胞毒性的RBL-2H3细胞2。与载体的研究关注的是一个特定的音符载体加载体车辆（可能DMSO），加试验化学物质，再加上使用任何有机溶剂，可能是一个潜在的细胞毒性冲泡，必须小心地控制，Palmer 等人做。
这种无处不在的化学品的进一步的毒性测试我们的协议而使用的有机溶剂的制备TCS的解决方案将是有用的，无溶剂工件的干扰，在水生毒理学的一个特别重要的考虑因素，在这些方法还允许浓度的TCS，核实在溶液中，定量的化学物质，如TCS，对肥大细胞脱颗粒的影响。这个协议可以用来评估各种各样的化学品对肥大细胞脱颗粒，如可疑内分泌干扰物55的影响，并可能会被缩放的高通量筛选。此外，其他的肥大细胞类型，可以使用在该测定在以后的工作中。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
LMW和RHK的缅因大学的研究生院生物医学科学和工程（GSBSE）支持; RHK还得到了缅因州的农业和林业试验场。提供额外拨款，由国家普通医学科学研究所（NIH P20-GM103423），缅因州的农业和林业试验场（批准号ME08004-10，JAG），大学缅因州ADVANCE：涨潮中心（NSF格兰特＃1008498）和研究入门格兰特（JAG）从PhRMA的基础药理/毒理。我们感谢博士。的大卫Holowka和芭芭拉·贝尔德抗原和细胞。雏哈什米，亚历杭德罗·贝莱斯，和安德鲁Abovian的设备和订单的帮助，我们非常感谢。这是缅因州农业和林业试验场出版3311。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RBL-2H3 Cells |
ATCC | CRL-2256 |
The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC |
| Triclosan/Irgasan |
Sigma | 72779 CAS# 3380-34-5 |
Should be stored in a low humidity environment |
| Trypsin |
Gibco | 25300-054 CAS# 3380-34-5 |
|
| EMEM |
Lonza | 12-611F |
|
| Fetal Bovine Serum |
Atlanta Biologicals | S11150 |
|
| Gentamycin Sulfate |
Lonza Biological Sciences | 17-518 |
|
| Albumin, Bovine Serum |
Calbiochem | 12659 CAS# 9048-46-8 |
|
| Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution) |
Pierce | 28314 CAS# 9002-93-1 |
|
| HEPES |
J.T Baker | 4153-01 CAS# 75277-39-3 |
|
| Magnesium Chloride |
VWR | BDH0244-500G CAS# 7791-18-6 |
|
| D-(+)-Glucose |
Biomedicals | 152527 CAS# 50-99-7 |
|
| Potassium Chloride Crystal |
J.T Baker | 3046-01 CAS# 7447-40-7 |
|
| Calcium chloride dihyrdate |
Acros Organics | 207780010 CAS# 10035-04-8 |
|
| Glycine |
Sigma | G8898 CAS# 56-40-6 |
|
| 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU) |
EMD Biosciences | 474502-250MG CAS # 37067-30-4 |
Wrap in foil – is light-sensitive |
| Anti-DNP Mouse IgE |
Sigma | D8406 |
Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month. |
| DNP-BSA |
Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University | Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018 |
|
| Calcium Ionophore A23187 |
Sigma | C75-22-1mg |
Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully |
| DMSO |
Sigma | D2650 CAS# 67-68-5 |
|
| Acetic Acid |
VWR | BDH3094-2 CAS# 64-19-7 |
|
| Anhydrous Sodium Carbonate |
Sigma | 222321 CAS# 497-19-8 |
|
| Sodium Chloride |
Sigma | 71376 CAS# 7647-14-5 |
|
| Hydrochloric Acid |
VWR | BDH3026 CAS# 7647-01-0 |
|
| Reference Buffer, pH 7 |
VWR | BDH5046 |
|
| Reference Buffer, pH 10 |
VWR | BDH5072 |
|
| Reference Buffer, pH 4 |
VWR | BDH5018 |
|
| pH electrode storage solution |
VWR | 14002-828 |
|
| Equipment: | |||
| DU 7500 Spectrophotometer |
Beckmann | No longer sold |
|
| Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software |
BioTek | Module S |
|
| Hematocytometer |
Hausser Scientific | 3110 |
|
| 7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate |
VWR | 97042-634 |
|
| Centrifuge |
Eppendorf | 5430 |
|
| Tissue culture water bath |
VWR | Model# 89032-206 |
|
| Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood) |
The Baker Company | Model# SG403A-HE |
|
| Tissue culture incubator |
ThermoScientific | Model# 3598 |
|
| Pipetman |
VWR | Range: P2-P1000 |
|
| Balance |
Mettler Toledo | Model# AG204 |
|
| pH meter |
Symphony/VWR | Model# SB70P |
|
| Pipet-Aid |
Drummond Scientific | 4-000-100 |
|
| Combitip dispenser |
Eppendorf | 4981 000.019 |
|
| Recipes: | |||
| Acetate Buffer, pH 4.4 |
Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml | Sterile Filter into autoclaved glass bottle |
|
| Substrate (4-MU) |
Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again | For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer |
|
| Glycine Carbonate Buffer, pH 10 |
26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| Tyrodes (2 L), pH 7.4 |
135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| RBL Cell Media |
Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only. | Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle |
|
| Plastic material used: | |||
| 200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack |
VWR | 53509-009 |
polypropylene |
| 1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery |
VWR | 89003-420 |
polyethylene |
| 10 µl micro tip low binding sterile |
VWR | 14217-704 |
polypropylene |
| Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force |
VWR | 20170-038 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-178 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-103 |
polypropylene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 690175 |
polystyrene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 658175 |
polystyrene |
| CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 607180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 710180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 606180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 760180 |
polystyrene |
| 1 cm cuvettes |
N/A | N/A |
polystyrene |
| CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate |
Greiner Bio One | 655086 |
polystyrene |
| Combitips |
Eppendorf | 022266501 |
Polypropylene/ polyethylene |
References
- Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
- Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
- Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
- Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
- Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
- Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
- Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
- Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
- Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861 (1997).
- Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
- Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
- Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
- Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
- Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
- Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
- Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
- Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
- Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
- Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
- Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
- Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
- Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
- Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
- McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
- Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
- Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
- Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
- Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
- Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
- Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937 (2002).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
- Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
- Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
- Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
- Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
- Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
- Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
- Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
- Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
- Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
- Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
- Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
- Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
- Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
- Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
- Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
- Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
- Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
- Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
- Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
- Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
- Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
- Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
- Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
- Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
- Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
- Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
- Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
- Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
- Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).
