Summary
비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용.
Abstract
비만 세포는 알레르기 질환과 기생충에 대한 면역 방어에 중요한 역할을한다. 일단 (알레르겐에 의해 예) 활성화, 그들은 degranulate, 프로세스가 알레르기 중재자의 exocytosis에 결과. 약물 및 독성 물질에 의한 비만 세포의 탈과립의 변조는 인간의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 비만 세포 기능은 쥐 염기성 백혈병 비만 세포의 사용 (RBL-2H3), 3-5 인간의 점막 비만 세포의 널리 사용되는 모델을 자세히 해부하고있다. 6 마스트 세포에서 히스타민과 협력하여 선형 출시 비만 세포 과립 구성 요소와 알레르기 중재자 β-헥 소사 미나는, 쉽게 신뢰성에 대한 의무가 마이크로 분석에서 측정 형광 강도를 산출, 형광 기질과의 반응을 통해 측정 할 수있다 높은 처리량 연구 1. 원래이 NaAl 등 1.에 의해 게시, 우리는 검사 O이 탈과립 분석을 적응F 약물 및 독성 물질과 여기에서의 사용을 보여줍니다.
트리클로산은 많은 소비자 제품에 존재하며이 효과에 대한 메커니즘은 알 수 있지만, 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11 치료 도움이 될 발견되었습니다 광범위한 스펙트럼 항균 에이전트입니다. 여기에서 우리는 비만 세포 탈과립에 트리클로산의 효과에 대한 분석을 보여줍니다. 우리는 최근 트리클로산 강하게 비만 세포의 기능이 영향을 미치는 것으로 나타났다. 유기 용매의 사용을 방지하기위한 노력의 일환으로, 트리클로산은 열 교반 수성 버퍼에 직접 용해되고, 결과 농도는 12 (ε 280 = 4,200 L / M / ㎠ 사용) UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 확인됩니다. 이 프로토콜은, 더 넓게 자신의 알레르기 가능성을 비만 세포 탈과립에 미치는 영향을 결정하기 위해 다양한 화학 물질과 함께 사용할 수있는 잠재력을 가지고 있으며,.
Introduction
비만 세포는 높은 천식의 주요 매개체 역할을 면역 효과기 세포, 알레르기, 기생충 방어 및 발암 13-16 알갱이 있습니다. degranulate을 활성화 때까지 안전하게 세포질 과립에 알레르기와 염증 매개을 저장할 위치를 그들은 거의 모든 혈관 조직 15에 있습니다. 탈과립은 히스타민, tryptase 및 류코트리엔 15와 같은 약리학 적 활성 중재자의 릴리스에서 결과 막 바인딩 된 과립의 exocytosis에 있습니다. 유형의 시작이 처리 결과 I 기생충에 대한 방어를 장착뿐만 아니라 알레르기 천식 및 발암 응답하기 15 시작의 중요한 과민 반응.
비만 세포와 호염기구는 FcεRI 수용체 면역 글로불린 E (IgE에) 17의 높은 친화력 수용체를 표현한다. 알레르겐 또는 항원에 노출 여러 IgE에 결합 FcεRI 수용체 17의 집계를 발생하고,이 s의티로신 인산화 이벤트, 내부 상점에서 포스 C, 칼슘 유출의 활성화 및 세포 18에 칼슘의 유입의 폭포 : 탈과립 프로세스를 시작 IgE에 결합 구단 수용체의 "가교"오 -라고. 이 칼슘 유입 탈과립을 위해 필요하며, 더욱, 과립 exocytosis에 15을 초래하기 전에 막으로 과립 융합을 알립니다. 실험적으로, 칼슘 이온 운반체 상류되거나 하류로 독성 물질에 의해 경로 대상의 식별을 허용, 직접 기본적으로 모든 신호 전달은 칼슘 유입 20 단계 이전 단계를 거치지 세포막을 19 일에 걸쳐 셔틀 버스 칼슘을 사용할 수 있습니다 칼슘은 20 신호.
탈과립은 히스타민 6 함께 과립에서 선형 적으로 해제 세포의 상층 액을,에 β-헥 소사 미나의 방출을 모니터링하여 신속하고 효율적으로 측정 할 수 있지만 난의 훨씬 쉽게 분석 형광 제품에 대한 간단한 효소 기질 반응 및 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 감지합니다. 같은 프로토콜 절에 자세히 설명이 마이크로 분석은에 의해 β-형광 기판의 절단 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide을 정량화 원래이 NaAl 등에 의해 개발. 강력한 방법 1을 기반으로합니다 헥 소사 미나. 트리클로산은 여기에서 강조와 함께 우리는 약물과 독성 물질의 테스트 효과 분석을 수정했습니다. 이 방법은 신뢰성 탈과립을 정량화 예를 들어, 유세포 기반의 탐지 방법 21에 저렴한 대안입니다, 안티 - 알레르기 약물의 다양한 높은 처리량 검사에 잘 자신을 빌려 잠재력을 가지고뿐만 아니라, immunotoxic 또는 극성 물질. 이 마지막 점은 21 세기 2007 년 국립 연구위원회 보고서 "독성 시험에 비추어 특히 중요하다 : 비전과 스트랫EGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 는 마우스와 같은 전통적인 실험 동물의 비용 사용을 줄이기 위해 세포 배양을 활용 높은 처리량 독성 시험의 개발을지지한다). 이 NaAl 등 1.가 개발하고 우리 2로 수정 탈과립 프로토콜은, 상동 인간의 점막 비만 세포 나 호염기구에 3-5 잘 받아 들여진 모델 RBL-2H3 세포 라인을 사용합니다. (배양 RBL-2H3 세포에 대한 방법은 허친슨 등에 자세히 설명되어 있습니다. 22). 이 분석 가능성이 장착 된 비만 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.
트리클로산 (TCS)는 병원, 개인 배려 제품, 소비자 제품 23,24에서 30 년 이상 사용되어왔다 광범위한 스펙트럼 항균이다. TCS의 항균 특성에 대한 행동의 모드는 억제 enoyl-아실 의한 것으로, 지방산 생합성의 억제입니다운반 단백질 환원 25,26. 이 같은 샤워 젤, 핸드 로션, 치약, 양치질, 0.3 % 또는 10 mM의 최대 24 농도에서 손을 비누와 같이 가전 제품의 넓은 범위에서 세계적으로 발견된다. TCS의 대폭적인 사용은 인간 27-29의 강과 하천 (30)에 검출 수준 귀착되었다. Allmyr 등에 의해 수행 연구. 27 TCS와 그 대사 산물이 혈장과 모유로 기르는 어머니의 우유 모두에 존재하는 것을 보여 주었다. 중요한 것은, TCS는 쉽게 피부에 31-37로 흡수된다. Queckenberg 등. 37 비만 세포가있는 피부에 상당한 농도의 결과, 12 시간 이내에 인간의 피부에 ~ 70 밀리미터 TCS 크림 ~ 10 %의 흡수를 발견했다.
TCS는 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11을 관리하기 위해 임상 적으로 표시되었지만, TCS는 알레르기 성 피부 질환을 완화하는 메커니즘은 38 알 수있다. 형광 마이크로 플레이트 분석 detaile를 사용하여D는이 비디오에서 우리는 최근에 2 μM의 낮은 농도 TCS는 크게 이러한 임상 데이터 2에 대한 잠재적 인 설명을 제공하는 비만 세포 기능과 탈과립을 꺾는 것을 보여 주었다. 이러한 임상 데이터에 대한 설명을 제공 할뿐만 아니라, 파머 등 우리의 연구 결과는. 2 TCS 칼슘 유입의 하류 신호 분자 표적으로하는 것이 좋습니다. 많은 면역 및 기타 생물 학적 과정에 신호 칼슘의 중요성으로 인해, TCS는 잠재적으로 필요한 생물 학적 과정의 다양한에 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 사실, Udoji 등. 39 TCS는 또 다른 중요한 타고난 면역 기능, 인간의 자연 살해 세포의 세포 용해 활성을 억제 것으로 나타났다.
알레르기 성 피부 질환 (또는, 반대로, immunotoxicant 등)의 치료 원조로의 잠재력을 넘어, TCS는 장애 물질 40-49 내분비 할 수 있습니다. 따라서, 용액이 화학 물질을 준비하는 방법에 대한 명확한 절차 I독성 학자의 관심의. TCS는 작은 소수성 분자이기 때문에, 유기 차량은 종종 물에 용해성하기 위해 사용됩니다. TCS가 테스트되었습니다 가장 독성 연구에서, 준비는 에탄올, 아세톤 또는 석유 2,50,51 등의 유기 용매의 도움으로 물에 용해를 포함하고있다. 그러나 종종 이러한 용매 번하여 테스트 화학 물질 데이터를 51의 해석을 복잡하게, 자신 생물학적으로 활성 상태입니다. 사실, Rufli 등에 따라. 52 등 53, 그것은 수생 독성 실험을위한 테스트 솔루션은 독성 아티팩트를 생성하는 화학 용제의 가능성으로 인해, 화학적 방법을 통해 물리적 인 방법을 사용하여 준비하는 것이 좋습니다. 우리는 이전 TCS는 0.24 % 에탄올 / 물 (권 / 권)에 녹여 30 분 꺾 RBL 비만 세포의 탈과립 2 초음파 것으로 나타났습니다. 0.24 %보다 높은 농도의 에탄올 비만 세포 degra을 저해하는 표시되었습니다nulation 54,55 - 예 독성 연구에서 유기 용제의 잠재적 인 혼란 함을 주죠 효과.
뿐만 아니라 그것은 생물체 또는 연구에 사용되는 세포에 대한 용매의 영향을 고려하는 것이 중요하지만, 또한이 시험 화학 물질 자체에 용매의 효과를 모니터링하는 것이 중요합니다. 예를 들어, Skaare 등. 51 기름에 용해 함수의 완전한 손실이 발생하면서 폴리에틸렌 글리콜의 TCS를 (일반적으로 치약 및 구강에서 발견) 용해하는 건강한 여성 여성 안티 박테리아 및 안티 플라크 효과를 약화 것으로 나타났습니다. 따라서, 다른 용매의 능력 TCS 등 독성 물질 및 약물을 조절하는 효과를 분석 설계에 고려되어야한다. 오일이나 맛 첨가제의 사용은 다양한 제품 50,51에서 TCS의 효과를 방해 할 수 있습니다.
유기 용제를 사용하는 필요성을 제거하기위한 노력의 일환으로, 우리는 유기 졸의 사용을 제거하여 TCS 2 용해 우리의 방법에 따라 개선배출. 본 프로토콜에서는, 우리는 열 (≤ 50 ° C)과 수성 버퍼에 직접 TCS 과립을 분해 한 후 UV-VIS 분광 광도법으로이 TCS 주식의 농도를 확인합니다. TCS는 40 μM (최대 물에 용해하기 때문에 이러한 개선이 가능 http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) 50 ° C (가열시 분해에 저항하기 위해 표시되었습니다 http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. TCS도 강하게 4,200 L / 몰 / CM 12의 몰 흡광 계수와 280 nm의 58에서 흡수하는 것으로 알려져 있습니다대로 우리는 또한 UV-VIS 분광 광도계의 장점이 있습니다.
이 프로토콜은 저렴한 비용과 신속한 확인 등 유기 용제의 도움없이 버퍼에 TCS 과립을 분해 할 수있는 간단하면서도 효과적인 방법을 제공합니다농도, 그리고 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 모니터링하기위한 강력한 형광 마이크로 플레이트 분석을 설명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 버퍼 조리법이 프로토콜 텍스트의 끝에서 테이블에 포함되어 있습니다.
DAY 1 :
1. 세포의 준비
- 가장자리 효과를 방지하기 위해 레이아웃을 테스트 샘플을 중심으로 96 - 웰 플레이트 설치 계획을 계획합니다. 할당 세 각 TCS 농도 시험 (항원 또는 이온 운반체의 ± 탈과립 자극제)뿐만 아니라, triplicates 자연 릴리스 (아무 탈과립 자극제), 최대 버전 (0.2 % 트리톤 X-100 [TX] 세제 용해) 등을위한 복제 우물 배경 샘플 (더 셀이 포함되지 않습니다)을 위해 예약되어 있습니다. 각 복제 실험의 날, TCS 샘플 농도의 새로운 무작위 레이아웃을 선택합니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 RBL 미디어 (레시피 테이블에서 제공)와 트립신.
- 좋은 치유의 일반적인 징후 T-25 플라스크에 RBL 세포 (2-4 최종 통과 이후의 일 그리고 그들은 해동 된 이후 3~4개월 미만) 확인일 : 적절한 매체의 색상으로 표시 산도, 그리고 백탁의 부족. 플라스크 오염이되어 있고 세포가 제대로 합류 건강 나타나며, 주로 부착되었는지 확인하기 위해 광학 현미경 플라스크를 놓습니다. 세포가 마이코 플라스마 오염 약 6 주마다 22 확인해야합니다.
| 치료 | Triplicates |
| 자극, 0 μM TCS | A7, B7, C7, F4, G4, H4 |
| 자극 0.001 μM TCS | F6, G6, H6 |
| 자극, 0.1 μM TCS | A4, B4, C4 |
| 자극, 1 μM TCS | A6, B6, C6 |
| 자극, 5 μM TCS | F5, G5, H5 |
| 자극, 10 μM TCS | A3, B3, C3 |
| 자극, 15 μM TCS | A5, B5, C5 |
| 자극, 20 μM TCS | G7 F7, H7 |
| 자극 플러스 최고 [TCS] | F3, G3, H3 |
| 자연, 아니 TCS는 (조롱을 포함하지 않음) | A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8 |
| TX-100, 아니 TCS는 | D10, D11, D12 E10, E11, E12 |
| 더 셀없고, 배경, 플러스 최고 [TCS] | G10, G11, G12, H10, H11, H12 |
- 무균 조직 배양 (TC) 후드에 RBL 세포 플라스크를 가져 가라. 세포는 로봇에 부착되어플라스크의 탐. TC 후드에서 작업 표준 무균 기술을 사용하여, 멸균 피펫 플라스크에서 모든 미디어를 제거합니다 세포가 플라스크의 바닥에 붙어 남아 있습니다. 다음으로, 2 ML 트립신로 플라스크를 씻어,이 씻어 버린다.
- 플라스크의 바닥을 커버 정확히 2 ㎖ 트립신을 추가합니다. 5 분 ° C 배양기에서 세포가 플라스크의 바닥에서 분리 할 수 있도록 37에 넣습니다.
- 5 분 후, 세포를 느슨하게 오픈 손바닥으로 플라스크의 측면을 누르십시오. 즉시 플라스크 떨어져 세포를 씻어 18 ML RBL 미디어를 추가하고 트립신을 해소 할 수 있습니다. 즉시 플라스크에서 세포 미디어 트립신 혼합물을 가지고 새로운 멸균 50 ML 튜브 (이 튜브의 전체 볼륨이 이제 20 ML이다)로 전송할 수 있습니다.
- 부드럽지만 철저하게 혼합 한 후,이 튜브에서 세포 현탁액의 50 μl를 제거하고 계산하는 샘플입니다 1.5 ML 살균 microcentrifuge 관에 전송합니다. 이 샘플을 취할뿐만 아니라, 50 ML0, 벤치 탑에 TC 후드의 세포 미디어 트립신 혼합물을 포함하는 관.
- 500 XG에서 13 분 동안 원심 분리기 50 ML 튜브를 (적절한 균형) 회전,이 힘 과립 세포를 효과적으로.
- 스핀 시간 동안 회전하기 전에 고립 된 샘플에서 세포를 계산합니다. 이 작업을 수행하려면 먼저 1.5 ML 튜브에 세포의 50 μL에 판 블루 염색의 50 μl를 추가하고 부드럽게하지만 철저하게 섞어 아래 배 피펫. 즉시 유리 hematocytometer이 혼합물의 10 μl를 전송하고, 제조업체의 지침에 따라 그리드 영역에서 세포를 계산합니다. 합리적인 통계 결과에 대한 최소 100 세포를 계산합니다.
- 위로 TC 후드에 아래로 회전 한 세포에서 뜨는을 제거합니다.
- 세포 관 모자, 세포를 느슨하게 튜브의 하단에있는 펠렛을 가볍게.
- 세포 수에 따라 0.5 × 10 6 세포 / ML의 농도를 산출하는 트립신 세포에 미디어를 추가 할 수 있습니다. 도금 과정 중에 부유 세포를 유지하기 위해 잘 조심스럽게 섞는다. Pipetman를 사용하여 플레이트 템플릿 시트에 따라 96 - 웰 플레이트 (평면, 블랙 하단)에서 /에 100 μl의 세포를 넣어. 세포는 세 우물의 각 집합 후 체계적인 오류 및 혼합을 방지하기 위해 우물에 추가하는 방법을 랜덤이 추가됩니다. 배경 샘플 표시된 우물에 세포를 넣어하지 않도록합니다.
- 일단 모든 셀이 전송되었습니다 접시에 접시에 뚜껑을 배치하고 하룻밤 (37 ° C / 5 % CO 2) 배양기로 전송합니다. 표준 멸균 방법에 따라 정리합니다.
DAY 2 :
2. 트리클로산의 준비
- 표시된 500 ML 삼각 플라스크에 눈금 실린더, 측정 250 ML의 Tyrodes 버퍼 (레시피 테이블에서 제공)를 사용하여 "TCS-버퍼입니다."교반 막대를 추가합니다. TCS와 함께 사용을 위해 지정된 바, 온도계를 저어 유리를 사용합니다.
- 또한이 시간에 측정 250별도의 500 mL의 삼각 플라스크에 넣고 ML의 Tyrodes 레이블이 "제어 버퍼입니다."사용 유리, 바, TCS에 대한 지정되지 않다 온도계를 저어. 교반 막대를 추가합니다.
- TCS 과립 0.0022 g을 달아 "TCS-buffer"라는 플라스크 (250 ML Tyrodes 버퍼를 포함하는)에 전송할 수 있습니다. 효율적으로 삼각 플라스크에 과립을 전송하기 위해 모든 TCS가 전송되었는지 확인하고, 배의 무게를 씻어 측정 250 ML의 Tyrodes에서 10 ㎖를 사용합니다.
- 장소 "TCS-버퍼"조합 열판 / 자기 저어 접시에 플라스크와는 manageably 빠른 속도로 저어 설정합니다. 일단 잘 혼합이 TCS의 주가는 명목상 30 μM (실제 농도는 가열 후 계산됩니다) 될 것입니다. (화학 물질 흄 후드있는 모든 믹싱 작업을 수행합니다.)
- 또한이 시간에, 두 번째 조합 열판 / 자기 저어 접시에 "제어 버퍼"플라스크 (아무런 TCS를 포함하지 않음) 배치하고 비슷한 속도로 저어로 설정합니다.
- 나중에 사용하기 위해 램프를 따뜻하게 UV / 마주 램프를 켭니다.
- 지속적으로 교반하면서 50 ° C에 "TCS-버퍼"솔루션을 가열한다. 일단 90 분 동안 온도, 시간에. 90 분 동안 자주 50 ° C 온도와 적절한 교반 속도를 지속적으로 모니터.
- 동시에 ° C 연속 교반과 함께 50 "제어 버퍼"솔루션 (일반 Tyrodes 버퍼의 단지 250 ML입니다) 가열한다. 50에 도달하면 시간 온도 (50 ° C에서 보관) 및 교반을 모니터링하는 둘 중에 ° C, 90 분의 시간.
- 90 분의 끝에, 핫 플레이트 및 벤치 탑로 전송 떨어져 삼각 플라스크를 모두 가져 가라.
- 빈 기계는 가열 "TCS-버퍼"액 1 mL를 스캔하기 전에 가열 "제어 버퍼"솔루션 1 ML에 UV / 광도계의 파장 스캔 기능을 사용하여. , 스펙트럼의 모양을 확인280 nm의 D 레코드 흡광도 값입니다. 농도를 결정하기 위해, 맥주 램버트 방정식을 사용 (A 280 = ε 280 ℓ C) ε을 사용하여 4200 280 L / 몰 / cm 12 1cm의 ℓ.
- TCS 농도를 결정한 후, 추가 0.249 g 소 (BSA) "TCS-버퍼"솔루션의 나머지 249 ML에, 잘 혼합 혈청 알부민.에게
- 동시에, "제어 버퍼"솔루션의 나머지 249 ML에 0.249 g BSA를 추가하고 잘 섞는다.
DAY 2 :
3. RBL-2H3 세포를 사용하여 항원 자극 탈과립의 분석
- 시작하기 전에 사용중인 모든 버퍼의 pH를 확인하고 흐린 명확하고 있지 않은지 확인 :이 Tyrodes 버퍼, 나트륨 아세테이트 버퍼, 글리신 탄산염 버퍼 (조리법 테이블에서 제공)가 포함되어 있습니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 RBL 미디어 트립신.
- BT를 (1 MG / ML 확인0; Tyrodes 버퍼 BSA) : 0.05 g BSA + 50 ML Tyrodes 버퍼 (X2). 37 ° C의 물을 욕조에 넣습니다.
- 확인 0.2 % 트리톤 X-100 : BT의 3.136 ML + 64 μL 10 % 트리톤 X-100 (트리톤 X-100은 0.2 %이다의 최종 농도). 반전으로 잘 섞는다하지만, 소용돌이하지 않습니다. 37 ° C의 물을 욕조에 넣습니다.
- . TCS, 온수 Tyrodes 버퍼 (단계 "2"이상) 주의 준비를 시작합니다 "TCS-버퍼"와 "제어 버퍼"솔루션은 50 ° C 및 교반에 도달 할 때까지 다음 단계 (IgE의 노출)를 시작하지 마십시오 90 분 가열 / 교반 시간의 처음 70 분.
- 두 솔루션은 70 분 동안 50 ° C에서 교반되고 나면, (물론 100 μL /) 감응 할 샘플 우물 RBL 미디어에서 0.1 ㎍ / ㎖ 방지 DNP 마우스 IgE에 (시그마)를 확인합니다. 4에 저장 될 때 IgE의 주식이 30 일 이상이어야한다 ° C, 재고가 얼마나 오래된 기록합니다. 혼합 쓸어 넘겨 있지만, 소용돌이하지 IgE의 작업을 수행.
- TC 후드 아래,50 ML 튜브에 6 ML RBL 미디어에 0.6 μL IgE의 주식 (재고 1 MG / ML입니다)를 추가합니다. 제 50 ML 튜브에 만 일반 RBL 미디어 (nonsensitized 샘플 의도) 6 ML을 추가합니다.
- 싱크대에 96 - 웰 플레이트 (1 일에 준비되었다)에서 모든 미디어를 덤프하고, TC 후드 아래에 접시를 가져옵니다.
- 무작위로 100 μL 미디어 / (48 우물 총) 자극해야한다 우물에 IgE의 혼합물을 추가합니다. 이 혼합물은 "TX"및 "배경"샘플 "자연"에 대한 것이 아닙니다.
- 무작위 자발성 "TX", ""및 "배경"우물에 100 μL 일반 RBL 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 접시에 접시 뚜껑을 넣은 다음 1 시간 동안 37분의 2 ° C 배양기 5 % CO에 판을 이동합니다.
- 3.24-1 시간 배양 동안 같이 3.13를 따르십시오.
- 벤치 탑에서 항원 희석을 준비합니다. 1.6 MG / ML 주식 DNP-BSA + 850 μL & # 0.53 μl를 추가160, BT는 1 ㎍ / ㎖의 항원 농도를 얻을 수 있습니다. 소용돌이와 혼합이 주식을 반전.
- 일단 "TCS-버퍼"와 "제어 버퍼는"가열 한 후 50 90 분 동안 교반 ° C는 (단계 2.6로 이동 - 2.8.1) TCS 프로토콜에 대한 준비의 나머지 계속 진행합니다. BSA는 모두 솔루션에 용해 후 아래 계속합니다.
- ± 자세, ± TCS와 노출 버퍼를 준비하고 시작합니다. 첫째, "TCS 버퍼"솔루션 (이미 90 분 동안 가열 교반되어있는), 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML 전송의 249 ML 샘플에서. 이 50 ML의 나누어지는 20 μl를 제거하고 0.0004 ㎍ / ㎖ DNP-BSA의 최종 항원 농도 이전 준비 1 ㎍ / ㎖ 항원의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전.
- 레이블이 "관 1, 높은 TCS / + AG는 / + BT."그것은 희석 가장 높은 TCS 농도를 노출하는 데 사용됩니다.
- "제어 버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 튜브에 50 ML을 전송합니다. 이 새로운 50 ML 나누어지는 20 μl를 제거하고 0.0004 ㎍ / ㎖ DNP-BSA의 최종 항원 농도 이전 준비 1 ㎍ / ㎖ 항원의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전.
- 레이블이 "관이 없음 TCS / + AG는 / + BT". TCS의 희석 및 0 μM TCS 농도에 노출을 위해 사용.
- 이제 "TCS-버퍼"솔루션의 50 ML를 꺼내 또 다른 50 ML 튜브에 넣어. 이 새로운 50 ML의 나누어지는의 20 μl를 제거하고 일반 BT의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전. 어떤 항원이 추가되지 않습니다.
- 이 "관 3, 높은 TCS / 없음 AG는 / + BT."이것은 배경에 사용됩니다. 레이블을
- 다른 50 ML 튜브 "제어 버퍼"솔루션의 50 ML을 전송합니다. 이 지점에서 20 μl를 꺼내 W 50-ML의 나누어지는 및 일반 BT의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전. (어떤 자세가 추가되지 않습니다.)
- 이 "관 4, 없음 TCS / 없음 AG는 / + BT."이것은 배경 및 자연 시료에 사용됩니다. 레이블을
BSA TCS 항원 튜브 1 
고 [] 관 (2) NO 관 (3) / files/ftp_upload/50671/check.jpg "폭 =" "15px /> 고 [] NO 관 (4) NO NO - 계산하고 "TCS-버퍼"주식의 농도를 결정한 후 희석 볼륨을 기록합니다. 각 희석 농도 총 부피는 1 ML해야하며, 살균 microcentrifuge 관에 준비해야한다. 보정 P2 및 P1000 Pipetman를 사용합니다.
집중 높은 트리클로산 + Tyrodes + BSA 0.0004 ㎍ / ㎖ 자세
(위에서 튜브 1)BT 0.0004의 ㎍ / ㎖ 자세 가열
(위에서 튜브 2)20 μM 10 μM 5 μM 1 μM 0.1 μM 0.001 μM 0 μM (플레이트의 상단) ----------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를 0 μM (접시 아래) ----------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를 - 1 시간 IgE에 배양 한 후 배양 접시를 꺼내 싱크대에 모든 미디어를 던져. (참고 : 시험 물질이 소비자 제품 TCS보다 더 독성이 알려진 경우, 유해 폐기물 처리가 필요할 수 있습니다.)
- Combitip을 사용하여 무작위 BSA-Tyrodes 버퍼 (200 96 - 웰 플레이트에 세포를 씻어잘 / μL). 첨부 된 세포를 방해하지 않도록하기 위해, 오히려 직접 연결된 셀 위에보다 우물의 측면에 세척 버퍼를 해제합니다. 프로세스를 두 번 반복합니다.
- 응용 프로그램 소용돌이에 대한 치료를 준비하고 오른쪽 판에 추가하기 전에 희석을 반전합니다.
- 판의 윗부분부터 시작하여 : 무작위 해당 우물에 200 μL 항원 솔루션의 각 (TCS의 정확한 농도)의 triplicates를 추가합니다. 판의 아래로 계속합니다. 접시에 모두 "조롱"을 "제어 버퍼"솔루션 플러스 자세를 (위의 "관 2"에서)를 추가합니다.
- 해당 우물에 적합한 솔루션 200 μl를 추가합니다 :
- 0.2 % 트리톤 X-100 "TX"으로 지정한 우물의 200 μl를 추가합니다.
- 다음으로, "배경 (BKGD) 최고 TCS"접시에 표시된 3 우물에 튜브 3의 200 μl를 추가합니다.
- 마지막으로, 200 μl를 추가합니다관의 4 ~ 6 우물은 "자발적."라는
- 37 ° C / 5 % CO 2에서 1 시간 동안 접시를 품어.
- 1 시간 배양 중 : 얼음의 두 개의 버킷을 (인큐베이터에서 "오래된"접시 하나 새 접시 하나)하세요. 해동 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide 상온에서 (4-MU)의 경우 최대가 빛에 민감하기 때문에 호일에두고 40 분에.
- 일단 4-MU 재고가 해동, 4-MU 작업 솔루션 구성 : 150 μL 주식 + 차가운 아세테이트 버퍼의 14.85 ML (표와 레시피) 소용돌이와 반전. 호일에 싸서 50 ML의 원심 분리기 튜브,와 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
- Combitip을 사용하여 무작위 NEW 레니에 블랙 96 - 웰 플레이트 (얼음 양동이 # 2)의 각 우물의 맨 아래에 100 μL 감기 4-MU 작업 솔루션을 추가합니다. 무작위 트리톤 X-100 우물에서 무작위로 접시의 바닥에서, 판의 상단에서 임의로 작업 솔루션을 추가하여 첫 번째 시작,그리고 마지막으로 무작위로 배경 우물에서.
- 다음 단계 P200 팁 새로운 상자를 얻을.
- 1 시간 보육의 끝에 대한 잘 돌고 아래로 (부드럽게 거품을 도입하지 않음) 4 배 얼음 양동이 # 1, 피펫 상층 업에 인큐베이터에서 세포 판을 넣어 혼합 좋지만 혼합하면서 세포 닿지 않도록 . 체계적으로, 기판 (샘플 같은 순서가 원래대로 밖으로 계획)와 함께 새 접시에 각각 잘 곳에서 25 μL 샘플을 꺼냅니다. 때 새 잘 거품을 도입하지 않고, 철저하게 샘플을 혼합 아래로 피펫.
- 37 ° C / 5 % CO 2에서 30 분 알을 품다.
- 30 분 부화 후, 무작위로 325 μL 총 우물을 채우기 위해 당 잘 감기 글리신 탄산 버퍼 200 μl를 (Combitip을 사용)을 추가합니다. (트리톤 X-100 유출을 방지하기 위해, 트리톤 X-100 샘플이 외에도 마지막으로 확인). (클린 P10 피펫과 포크 읽기 플레이트 전에 거품을 확인테 팁) 모든 거품을 팝업합니다.
- 형광 플레이트 리더 (섹션 4로 이동)에서 접시를 실행합니다.
DAY 2 :
4. 형광 플레이트 리더 지침 및 데이터 분석
- GEN5 프로그램 및 열려있는 실험 섹션을 엽니 다.
- 플레이트 리더 및 인서트 플레이트 (왼쪽 상단 모서리는 A1입니다)를 켭니다.
- 프로토콜
순서 사용자 정의 측정 값을 설정 참조하십시오. 각 우물에서 원시 형광 데이터를 수집하기 위해 샘플에 대해 아무것도, 복제 등을 추가하지 마십시오. - 최고 50 % 미만 "정상 속도" "," ", 형광", "이익 40", "흥분 40분의 360", "배출 40분의 460,"광학 위치를 끝점을 선택합니다 "를 읽어." 광학 위쪽 오프셋 : 7mm. 아무 흔들림 없음, 지연, 아니 동역학, 잘, 모니터, 온도 : 보육 전문가.
- 플랫 블랙 바닥 (레니에 96도, 편평한 바닥) 플레이트 96도를 선택합니다.
- 플레이트 레이아웃 거래 : 프로토콜 플레이트 레이아웃입니다. 반복, 희석 등을 표시하지 않고 샘플을 설정합니다
- 판 읽어보십시오.
- 파일을 저장 Excel로 데이터 파일을 내 보냅니다 "엑셀"버튼을 클릭합니다. 플레이트 레이아웃 및 매트릭스에 대해이 작업을 수행합니다. 컴퓨터와 USB 드라이브에 파일을 저장합니다.
- Excel에서 트리톤 X-100 우물 등 모든 샘플의 평균 배경 독서를 뺍니다.
- 평균 트리톤 X-100 값으로 각 값 (이미 배경 공제받은)을 나누어 상대 %의 탈과립을 계산 후 백분율하기 위해 100을 곱합니다.
- 평균은 모든 triplicates 및 표준 편차를 계산합니다. 같은 엑셀 그래프 데이터 값 ± 표준 편차를 의미한다. 통계적 테스트를 위해 GraphPad에 의해 프리즘 소프트웨어로 지금 이동합니다.
DAY 2 :
5. RBL-2H3 세포를 사용하여 이온 운반체 자극 탈과립의 분석
- "세포의 준비"에 대한 프로토콜 (제 1, 일 1)와 "트리클로산의 준비"(제 2 일 2)에 따라, 위에서 지시했다. 이온 운반체 자극에 대한 플레이트 레이아웃 예제는 다음과 같습니다.
치료 Triplicates 자극, 0 μM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4 자극 0.001 μM TCS F6, G6, H6 자극, 0.01 μM TCS F3, G3, H3 자극, 0.1 μM TCS A4, B4, C4 자극, 1 μM TCS A6, B6, C6 자극, 5 μM는 [TCS F5, G5, H5 자극, 10 μM TCS A3, B3, C3 자극, 15 μM TCS A5, B5, C5 자극, 20 μM TCS G7 F7, H7 DMSO, 아니 TCS와, 자연은 (Mock를 포함) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8 TX-100 DMSO와 함께, 아니 TCS는 D10, D11, D12 E10, E11, E12 더 셀 배경 없으며, DMSO와 더불어 최고 [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12 - 시작하기 전에 사용중인 모든 버퍼의 pH를 확인하고 그들은 명확하고 흐린 있지 않은지 확인. Tyrodes, 아세트산 나트륨 버퍼, 그리고 글리신 탄산염 버퍼 (조리법 테이블에서 제공).
- 50 ML의 tyrodes 버퍼에 0.05 g BSA를 첨가하여 잘 섞어 소용돌이로 교반하여 BT의 한 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 품어.
- 10 % 트리톤 X-100-4.704 ML BT의 96 μl를 추가하여 0.0032 % DMSO (최종 칼슘 이온 운반체 차량의 농도)로 0.2 % 트리톤 X-100을합니다. 잘 섞는다. 다음으로,이 솔루션의 0.155 μl를 꺼내 버립니다. 지금은 100 % DMSO의 0.155 μL에 다시 추가합니다.
- 이온 운반체 유리 병에 신선한 100 % DMSO 400 μL를 추가하고 혼합로 소용돌이 분말 A23187 이온 운반체의 5 MM의 주식 (2.5 밀리그램 / ML)를 준비합니다. 일단 솔루션,1.5 ML 원뿔 튜브, 기록 내용과 오늘의 날짜 및 만료 (준비로부터 3 개월 -20 ° C에서 제대로 저장)로 전송할 수 있습니다.
- 또는 얼음에 오늘 냉동 주식을 사용하는 경우, 해동, 및 5 mM의 A23187 이온 운반체 잘 혼합하고 깨끗한 지 확인합니다. 소용돌이, 영화, 사용하기 전에이 주식을 반전. #이 A23187의 준비와 롯의 기록 날짜입니다.
- 일단 "TCS-버퍼"와 "제어 버퍼가"가열 90 분 동안 교반되어, TCS 프로토콜 (단 2.6-2.8.1로 이동)를위한 준비의 나머지 부분을 계속합니다. BSA는 모두 솔루션으로 잘 혼합 한 후 나머지 프로토콜 단계를 계속 진행합니다.
- "TCS-버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 50 ML의 나누어지는의 1.8 μl를 제거하고 5 밀리미터 이온 운반체 주식의 1.8 μl를 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전. 최종 이온 운반체의 농도는 180 nm의. A23187이 농도 스톡 힘에 따라 달라질 수 있습니다, 그리고 A23187 이온 운반체 선량 반응은 RBL-2H3에 noncytotoxic로 확인 된 약 20 %의 최대 릴리스의 탈과립 수준을 이끌어 A23187의 농도를 확인하는 것이 좋습니다 세포 독성 분석에 의해 세포 (2).
- 레이블이 "관 1, 높은 TCS / + 이온 운반체 / + BT가."희석 가장 높은 TCS 농도에 노출에 사용됩니다.
- "제어 버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 50 ML의 나누어지는의 1.8 μL를 가지고 5 밀리미터 이온 운반체 주식의 1.8 μL에 다시 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전. 최종 이온 운반체의 농도는 180 nm 정도이다.
- 레이블이 "관 2 아니오 TCS / + 이온 운반체 / + BT."이것은 희석 및 0 μM TCS 농도에 사용됩니다.하지
- R의 249 ML 샘플에서 20, TCS 버퍼 "솔루션, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 새로운 50 ML의 나누어지는의 1.8 μL를 가지고 100 % DMSO의 1.8 μl를 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전 없음, 이온 운반체가 추가됩니다.
- 레이블이 "관 3, 높은 TCS / 없음 이온 운반체 / + BT / + DMSO는"; 배경에 사용됩니다.
- "제어 버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 새로운 50 ML의 나누어지는의 1.8 μL를 가지고 100 % DMSO의 1.8 μl를 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전. 더 이온 운반체가 추가되지 않습니다.
- 레이블이 "관 4, TCS / 없음 이온 운반체 / + BT / + DMSO 없음"; 자연 방출 샘플에 사용됩니다.
BSA TCS 이온 운반체 추가 100 % DMSO 튜브 1 "SRC ="/ files/ftp_upload/50671/check.jpg "폭 ="15px "/> 고 [] NO 관 (2) NO NO 관 (3) 고 [] NO 관 (4) NO NO 에크 마크 "FO : 콘텐츠 너비 =" "SRC ="/ files/ftp_upload/50671/check.jpg "폭 =" "15px />에서 .1 - 계산하고 "TCS-버퍼"주식의 농도를 결정한 후 희석 볼륨을 기록합니다. 보정 P2 및 P1000 Pipetman를 사용합니다. 각 희석 농도 총 부피는 1 ML해야하고, 살균 microcentrifuge 관에 준비되어야한다 :
집중 높은 트리클로산 + Tyrodes + BSA +180 nm의 A23187 (위에서 튜브 1) BT +180 nm의 A23187을 (위에서 튜브 2) 가열 20 μM 15 μM 10 μM 5 μM 1 μM <TD>0.1 μM 0.001 μM 0 μM (플레이트의 상단) ---------------------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를 0 μM (접시 아래) ---------------------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를 - 인큐베이터 어제 도금 셀 및 싱크에 용지 빈을 가져 가라. Combitip을 사용하여, 무작위 BT (200 μL / 잘)로 96 - 웰 플레이트에 세포를 씻으십시오. 세차를 두 번 반복합니다.
- 응용 프로그램 소용돌이에 대한 치료를 준비하고 오른쪽 판에 추가하기 전에 희석을 반전합니다. 판의 윗부분부터 시작하여 : 무작위 correspo 200 μL의 triplicates TCS의 정확한 농도를 각각 추가잘 nding. 판의 아래로 계속합니다. 접시에 모두 "조롱"을 "제어 버퍼"솔루션 플러스 A23187 (위 "관 2"에서)를 추가합니다.
- 해당 우물에 적합한 솔루션 200 μl를 추가합니다 :
- 0.2 % 트리톤 X-100 "TX"으로 지정한 우물의 200 μl를 추가합니다.
- 다음으로, "배경 (BKGD) 최고 TCS"접시에 표시된 3 우물에 튜브 3의 200 μl를 추가합니다.
- 마지막으로, 표시 관 (4) 여섯 우물의 200 μl를 추가 "자발적인을."
- 37 ° C / 5 % CO 2에서 1 시간 동안 접시를 품어.
- 1 시간 배양 중 : 얼음의 두 개의 버킷을 (인큐베이터에서 "오래된"접시 하나 새 접시 하나)하세요. 해동 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide 상온에서 (4-MU)의 경우 최대가 빛에 민감하기 때문에 호일에두고 40 분에.
- 일단 4-MU 재고가 해동, 4-MU 작업 soluti입니다 메이크업에 : 150 μL 주식 + 차가운 아세테이트 버퍼의 14.85 ML (표와 레시피) 소용돌이와 반전. 호일에 싸서 50 ML의 원심 분리기 튜브,와 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
- Combitip을 사용하여 무작위 NEW 레니에 블랙 96 - 웰 플레이트 (얼음 양동이 # 2)의 각 우물의 맨 아래에 100 μL 감기 4-MU 작업 솔루션을 추가의 상단에서 임의로 작업 솔루션을 추가하여 첫 번째 시작 무작위 무작위 트리톤 X-100 우물에서 접시의 바닥, 내 마지막으로 무작위로 배경 우물에서 접시.
- 다음 단계 P200 팁 새로운 상자를 얻을.
- 1 시간 배양의 끝에서 믹싱 좋지만 세포 닿지 혼합 동안 잘 돌고 아래로 (부드럽게 거품을 도입하지 않음) 4 배 얼음 양동이 # 1, 피펫 상층 업에 인큐베이터에서 세포 판을 넣어 . 체계적, SA의 기판 (동일한 순서로 새 접시에 각각 잘 곳에서 25 μL 샘플을 꺼내mples는 원래대로) 밖으로 계획. 때 새 잘 거품을 도입하지 않고, 철저하게 샘플을 혼합 아래로 피펫.
- 37 ° C / 5 % CO 2에서 30 분 알을 품다.
- 30 분 부화 후, 무작위로 325 μL 총 (트리톤 X-100 유출을 방지하기 위해, 지난 트리톤 X-100 샘플이 추가 확인)에 우물을 채우기 위해 잘 당 200 μL 차가운 글리신 탄산염 버퍼 (Combitip을 사용)을 추가합니다. 독서 플레이트 전에 거품 (모든 거품을 팝업하는 깨끗한 P10 피펫 팁 포크)를 확인합니다.
- (제 4의 모든 단계를 따르십시오) 형광 플레이트 리더에 접시를 실행합니다.
순서 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
50 가열하면 ° C 90 분, TCS에 대한 UV-VIS 흡수 스펙트럼은 그림 1에서 보는 바와 같이 280 nm의 피크 ~ 260, 300 nm의 사이에 강한, 부드러운 곡선을 생산하고 있습니다. 280 nm에서 발표 몰 흡광 계수는 4,200 L / 몰 / ㎠ 12 년부터 UV-VIS 분광 광도계는, 따라서 농도를 계산하는 데 이용 될 수있는 중요한 도구입니다. 우리는 TCS는 50 ° C 가열 (데이터가 표시되지 않음)에 따라, 전체 탈과립 실험의 기간 동안 용액 빠지지 않는 것으로 나타났습니다.
수성 버퍼에 직접 TCS를 해산이 가열 방법을 사용하면, 우리는이 NaAl 등의 최적화 된 형광 기반의 분석을 사용하여 비만 세포 탈과립에 TCS의 효과를 조사 하였다. 1이 분석은 돛대에서 풀어 β-헥 소사 미나의 수준을 기록 형광 기판 제품을 감지하여 한 시간 배양 한 후 세포. DNP-BS에 의해 degranulate을 자극 여부항원 (그림 2) 또는 칼슘 이온 운반체 A23187 (그림 3), 하나는 분명 TCS는 β-헥 소사 미나의 릴리스의 중요한 용량 - 반응 억제 (즉, 탈과립)를 일으키는 것을 볼 수 있습니다.
그림 2는 1 "TCS-버퍼"을 HR 또는 "제어 버퍼"에 대한 배양 및 0.0004 ㎍ / ㎖의 DNP-BSA 항원 선량에 노출 된 IgE에 감응 RBL 세포에 대해 얻은 결과의 대표입니다. DNP-BSA의이 농도는 ± 0.1 (평균 ± 표준 편차) TCS의 부재에서 22.5 %의 평균 절대 탈과립 반응을 이끌어. 탈과립의 통계적으로 유의 한 억제 탈과립 수준이 0 μM TCS 제어 수준 ± 0.05 (평균 ± 표준 편차) 0.79 배이었다 5 μM, 시작되었다. TCS의 농도가 증가함에 따라, TCS의 큰 완충 효과가 강한 용량 반응 관계를 보여주는있다. TCS, 20 μM에서, almos에t는 완전히 자발적 탈과립 (어떤 항원이 존재하지 않는 경우) 대략 같은 수준으로, 탈과립 반응을 abrogates. 전반적으로,이 그림은 유기 용매를 사용하지 않고 농도 확인 TCS로 인해 다가 항원 자극 비만 세포의 탈과립의 강력한 억제를 보여줍니다.
그림 3에서, 칼슘 이온 운반체 A23187는 TCS-유도 된 RBL 비만 세포의 탈과립의 완충의 메커니즘을 조사하는 방법으로 사용되었다. 이 FcεRI 가교 칼슘 유입의 상류 다른 신호 이벤트를 무시하지만, 여전히 탈과립의 원인이되기 때문에 A23187는 다른 자극제로 사용됩니다. RBL 비만 세포는 1 "TCS-버퍼"에있는 시간 또는 180 nm의 칼슘 이온 운반체의 복용량을 포함하는 "제어 버퍼,"동안 배양 하였다. TCS의 부재, A23187이 농도는 25.1 %의 평균 절대 탈과립 반응을 이끌어 ± 4.7 (평균 ± 표준 편차). 탈과립 억제했다최저 1 μM에서 발견 TCS (0.63 ± 0.11 [평균 ± SD]). TCS의 농도가 증가함에 따라, 억제의 심각성을 수행 5 μM에서, 0.21 배 ± 0 μM TCS 제어 수준 0.04, 10 μM, 0.09 ± 0.05, 그리고 20 μM, 15 μM, 0.077 ± 0.006에서 , 0.09 ± 0.02 (수단 ± SD). 사실, 5 μM과 TCS의 높은 농도에서, A23187에 의한 탈과립의 수준은 자발적인 제어 레벨 (여기서 더 A23187 전혀 존재하지 않는)에 가까운 것으로 나타났다. 전반적으로, 그림 3은 그림 2와 함께, TCS의 대상 분자 이벤트가 칼슘 유입의 가능성이 스트림을 나타냅니다.
그림 1 :. 대표 TCS UV-VIS 흡수 스펙트럼은 TCS는 강력한 완두콩가쉽게 280의 결정뿐만 아니라, tyrodes 버퍼에 용해 TCS의 실제 농도를 결정하기 위해 4,200 L / 몰 / CM 12의 몰 흡광 계수를 사용하는 능력을 affording 수 있도록 280 nm에서 K. 노란색 선은 280 nm에서 피크를 나타냅니다. 이 예에서는 280 nm에서의 흡광도 값은 28.28 μM의 TCS 농도를 나타냅니다, 0.11876이다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2 :. 0.0004 ㎍ / ㎖ DNP-BSA 항원 및 TCS (0-20 μM)에 노출 된 IgE에 감응 RBL 비만 세포의 대표 탈과립 반응 자연스러운 릴리스 값 (아무 항원 존재)는 참조 용으로 묘사된다. 값은 의미를 나타냅니다7, 세중의 샘플의 표준 편차. 제시로, 데이터 제어 (0 μM TCS)로 표준화하였고, 유의 한 차이는 Tukey의 사후 검사 (비교 0.001 μM TCS 평균 응답 가능) 다음 편도 ANOVA와 프리즘 소프트웨어에서 결정되었다. 의미에 의해 표현됩니다 *** p <0.001. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3 :. TCS (0-20 μM)의 면전에서 180 nm의 A23187 칼슘 이온 운반체로 자극 RBL 비만 세포의 탈과립 대표 응답 자발적인 방출 샘플 (아무 이온 운반체 선물) 참조 그려져 있습니다. 값은 세중의 샘플의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. PRESENTE로D는 데이터 컨트롤 (0 μM TCS)로 표준화되고, 유의 한 차이는 Tukey의 사후 검사 (비교 0.001 μM TCS 평균 응답 가능) 다음 편도 ANOVA와 프리즘 소프트웨어에서 결정되었다. 중요성은 *** p <0.001로 표현된다; ** p <0.01. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
2004 년,이 NaAl 등. 1 탈과립의 높은 처리량 테스트를 위해 비만 세포 바이오 센서를 개발했다. 그것은 우리가 우리의 TCS 연구에 대한 적응이 비디오에 설명 한 강력한 분석이다. 이전이 NaAl 등에 1. 분석은 비만 세포의 탈과립은 정기적으로 β-헥 소사 미나 59-61 통해 평가하지만, 이러한 초기의 방법은 하나의 샘플을 한 번 읽은하는 형광 분석기를 이용하고 있었다. 중요한 것은,이 NaAl 하였다. 자신의 마이크로 플레이트 리더를 활용하여 더 높은 처리량 방법 및 샘플 형광에 한 번에 하나를 읽은하는 이전 방법과 설정 직접적인 일치. 요컨대,이 NaAl 등 1. 크게뿐만 아니라 워크 플로에 몇 가지 변화를 통합하여, 높은 처리량 마이크로 플랫폼에 적응하여 속도, 전력, 단순 및 분석의 신뢰성을 향상 시켰습니다. 여기에, 우리는 또한 특히, 여기에 다양한 테스트 화학 물질의 연구에이 분석을 적응, 유비쿼터스 약 TCS. 비디오 세부 정보이 매우 유용한 분석의 단계. 또한, 우리는 또한 수성 버퍼에 TCS를 적용 유기 용매가없는 방법을 개발했습니다, 우리는 TCS 농도를 확인하기위한 간단하고 저렴한 비용으로 절차를 보여줍니다. 이러한 방법은 트리클로산 독성의 분명히 성장 분야에 도움이 될 것이다. 뿐만 아니라 다른 화학 물질을 테스트하려면이 탈과립 분석을 사용하여이 논의에서, 우리는 당신에게 세부 사항을 몇 가지 고려 사항입니다.
TCS는 유기 용제의 도움없이 수성 버퍼에 직접 제조 하였다 농도는 UV-VIS 분광 광도법 (그림 1)에 의해 확인 한 후, TCS (<30 μM)의 효과는 (그림 2, 3) 비만 세포 탈과립에 조사 하였다 , 탈과립에 대한 β-헥 소사 미나, 대리 마커의 존재를 감지하는 형광 마이크로 플레이트 분석을 사용하여. 우리는 TCS 크게 β-hexosa의 방출을 저해 할 수 있다는 것을 발견했다직접 수성 버퍼에 여기에 묘사 낮은 에탄올 농도 (0.24 % 부피 / 부피) 2, 용해 할 때 RBL 비만 세포에서 minidase. 유기 용매 전술 한으로, 우리가 실제로 TCS는 0.24 %의 에탄올에 용해 된 우리의 연구 (권 / 권)을 비교 항원에 의한 탈과립에 완충 두드러 참조하십시오. 예를 들어, 여기에 우리는 TCS가 0.24 %의 에탄올에 녹여 10 μM에 대해보고 ~ 25 % 감소 (0.76 배보다 훨씬 큰 항원에 의한 탈과립의> 50 % 감소 (0.46 배 ± 0.07)를 보여 주었다 ± 0.02) 2. 같은 맥락에서, 우리는 5 μM로, TCS는 자연 릴리스 레벨에 탈과립을 억제, A23187-자극 세포에 대한 결정,이 효과는 우리의 이전, 에탄올 활용 연구 2에서 10 μM TCS까지 증명되지 않았다. 이 차이에 대한 두 가지 이유가 있습니다 : 하나 0.24 %의 에탄올 차량이 활성 돛대 CEL을 억제하는 TCS의 능력을 감쇠우리가 사용되었다 L 탈과립, 또는 TCS는 (농도가 이전의 연구 2 UV-VIS 분광 광도법에 의해 검증되지 않은 이후) 예상보다 집중했다. 비만 세포의 탈과립의 TCS의 억제를위한 분자 표적에 대한, 그것은 가능성이 칼슘 유입 2의 신호 전달 폭포 하류 어딘가에 발생합니다. 우리는 초기 신호 이벤트를 우회하는 탈과립 자극제로 이온 운반체 A23187 칼슘을 사용하고, TCS의 억제 효과는 탈과립 경로에있는 TCS 억제의 대상 가능성이 칼슘 유입의 상류에 위치하지 않은 것을 나타내는 지속. 우리는 이전에이 세포의 막 물결이 일게 또한 일반적인 경로 대상 2의 가능성을 제안, TCS 처리에 의한 억제하는 것으로 나타났습니다.
이전 연구는 TCS는 280 nm에서 최대 피크를 가지고와 몰 흡광 계수는이 wavelen에서 4200 L / 몰 / ㎠ 것으로 평가되었다의 흡광도 스펙트럼을 발견했습니다GTH 12 (약동학 이하의 pH에서). 그것은 TCS를 가열하여 열분해 57로 이어질하지 않는 것으로 나타났습니다, 그리고 ° C 유기 용제 (56)의 도움없이 50로 가열하면서 또 다른 연구는 물에 TCS를 용해에서 성공을 보이고있다. 새로운 시험 화학 물질이 사용되는 경우, 수성 버퍼의 용해도는 물론, 신중하게 고려되어야한다. 우리는 또한 TCS를 가열 할 때, 스펙트럼 판독의 모양은 40-90 분 (데이터 표시되지 않음) 가열 여부를 영향을받지 않고, 발견했습니다 긴 기간의 가열 할 때 TCS 저하의 부족을 제시 시간입니다. 참고 그러나, TCS 용해 40 분 이상 90 분에서 크다. 우리는 또한 TCS는 탈과립 실험 (데이터 표시되지 않음)의 기간 동안 용액 빠지지 않는 것을 확인했습니다.
본 연구에서 사용 DNP-BSA 항원과 칼슘 이온 운반체의 농도는, 항원 및 이온 운반체 - 용량 반응 시험 법에 근거하여 선정되었다D는 대표적인 그림 2와 3 정도의 탈과립 수준을 유도하기 위해 선정되었다. 항원 용량 반응 분석의 예는 우리의 이전 작업 2의 그림 1A에서 볼 수 있습니다. 실험에 사용되는 항원 또는 이온 운반체의 농도를 결정할 때, 그것은 RBL-2H3 세포 때때로 변하기 기능 때문에 자극제 용량 반응 실험은 적어도 두 달에 일반적으로 정기적으로 수행해야 함을 인식하는 것이 중요합니다. 원하는 탈과립 비율을 산출 농도는 세포의 연령과 항원 / 이온 운반체 준비에 따라 달라질 수 있습니다. 우리가 무기 비소 22에 보이는 것처럼, 또한 절대 탈과립의 비율은 (사용 된 항원 수준) 용량 - 반응은 여러 가지 항원 / 이온 운반체 농도에서 수행되어야하므로 독성 물질, RBL 탈과립에 독성 물질 효과의 수준에 영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 최종 conce을 고려하는 것도 중요하다DMSO 차량의 ntration 탈과립은 DMSO 62에 의해 영향 때문에, 이온 운반체와 탈과립을 자극합니다. 우리는이 프로토콜에 사용되는 DMSO 농도 탈과립, 배경 독서, 또는 0.2 % 트리톤 X-100 값이 영향을 미치지 않습니다 발견했습니다.
다가 항원 DNP-BSA와 칼슘 이온 운반체 A23187뿐만 아니라, RBL-2H3 자극의 여러 가지 다른 방법이 존재한다. 이러한 방법 중 하나는 케르세틴 63와 함께 80분의 48을 화합물에 노출을 통해 자극이다. 우리가 이전 TCS 노출이와 함께 테스트로서 또, 항 IgE의 IgG를 가진 IgE에 결합 수용체의 가교이다. 많은 다른 자극 방법이 존재하고, 이러한 방법은 각각 비만 세포의 탈과립의 다른 기계적인 측면을 해결합니다. 이 플레이트 리더 분석은 더 이상의 유틸리티를 확장, 이러한 대체 자극의 많은 함께 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.
이 탈과립 프로토콜 체의 다양한 함께 사용할 수있는 잠재력을 가지고micals. 이 분석을 사용하는 시험 화학 물질의 연구에서 컨트롤은 다음과 같은 사항에 대해 실행해야합니다 : 배경에 시험 화학 (무 세포) 독서 (1) 효과, 자연 탈과립에 화학 물질 (2) 효과 (무 IgE에있는 셀 아무 항원도없고, 이온 운반체) 용해 세포의 트리톤 - X-100 값 (아무 항원, 아니 이온 운반체)에 화학 물질 (3) 효과. 이러한 테스트는 쉽게 플레이트 레이아웃으로 작업 할 수 있습니다. 이전에, 우리는 TCS가이 세 가지 매개 변수 2을 전혀 영향을주지 않습니다 발견했습니다. 또한, 시험은 시험 화학 물질로 부록 팔머 등의 부가 데이터 섹션의 그림 S1에 설명 된 셀이없는 준비 β-헥 소사 미나 효소 / 기질 반응 자체를 방해하지 않는 것을 결정하기 위해 실행해야합니다. 2 우리는 TCS는 다니엘에게 β-헥 소사 미나의 능력을 형광 기질 4-MU 2에 방해가되지 않는 것으로 나타났습니다. 사용되는 용매의 영향도 고려되어야한다이러한 모든 제어 실험한다. 예를 들어, DMSO, 이온 운반체의 용매, 트리톤 - X-100 샘플 형광 수준 (데이터 표시되지 않음)에 아무런 영향이 없음을 확인 하였다. 우리는 또한 내분비 장애 물질은 비스페놀 포함하지 않는이 연구에 사용 된 모든 플라스틱을 선택한 점에 유의 불행하게도하지만, 현재 시장에있는 모든 플라스틱은 아마 잠재적으로 데이터 64 혼동 수있는 활동을 방해하는 몇 가지 호르몬을 포함한다.
문제를 해결해야하는 경우,이 프로토콜의 몇 가지 잠재적 인 측면을 검토해야한다. (2) 하나 흥분제 및 / 또는 테스트 화학 물질과 용량 - 반응이 관찰되지 않고, 예를 들어, (1) 자연 방출 수준 (용해 값 ~ 7 % 이상) 너무 높은 것을 수 있습니다 나 (3) 솔루션 TCS 농도는 (이하 20 μM) 너무 낮습니다. 첫 번째 경우에는 높은 자연 수준이 너무 길거나 마이코 플라스마 오염 된 문화에되는 세포의 표시가 될 수 있으므로, 2-20주 사이의 문화에있다 RBL-2H3 세포에서 이러한 실험을 시도하고, 정기적으로 마이코 플라즈마에 대한 테스트. 흥분제 투여 반응이 관찰되지 않는 경우, 용해 흥분제 농도가 너무 낮을 수 있습니다, 그리고 주식 리메이크해야합니다. 예를 들어, 칼슘 이온 운반체는 일반적으로 세심한주의와 많은 소용돌이로 교반을 필요로 DMSO로 재구성 될 수있는 박막으로 제공됩니다. 또한, 다른 로트 번호를 가진 새로운 이온 운반체의 주식 로트의 변화로 인해 단순히 다른 힘을 가질 수 있으므로, 탈과립 용량 응답은 각각 새로 구입 한 이온 운반체의 주식으로 권장합니다. 그것은 주어진 테스트 화학 물질과 효과의 명백한 부족이 화학 물질이 효과를 일으킬하기 위해 긴 잠복기를 요구할 수 있다는 표시가 될 수 있다고도 지적 가치가있다. 당신이 솔루션의 높은 TCS 수율을 달성하지 않는 경우, 온도가 유지되었는지 확인 일정 (50 ° C ± 5) 과립 버퍼에 용해하는 동안. 티그는 온도계는 플라스크의 바닥, 용액의 온도가 과대 평가 될 것이다 위치를 만지지 마십시오. 또한, 온도는 처음 50 ° C.에 도달 할 때까지이 일정한 격렬하게 교반이며 90 분의 카운트 다운이 시작되지 않았는지 확인
문제 해결 표.
문제 | 잠재적 인 이유 | 해결 | |||
TCS 주식은 <20 μM로 결정된다 | 용액의 균일 가열 | 온도계는 용액에 현탁하고 플라스크의 바닥에 닿지 않게 배치되어 있는지 확인합니다. | |||
교반이 충분히 활발하지 | 솔루션 플라스크 밖으로 뛰어 원인이없이 활발입니다 감동의 수준을 달성하기 위해 볶음 접시에 자석 교반을 증가시킨다. 적절한 크기의 자석 교반 막대가 사용되는지 확인합니다. | ||||
분광 광도계 문제 | UV 램프의 적절한 워밍업 (보통 10 분)에 대해 허용 또는 전구 필요한 경우 교체하십시오. | ||||
자연 탈과립 수준 (> ~ 7 %)가 너무 높다 | 세포는 문화에 너무 많은 시간 때문에 비정상적인 유전자 변이를 획득 한 | 새로운 세포의 해동 실험을 수행 할 수 있습니다. | 세포 때문에 기계적 전단으로 죽어 가고있다 | 버퍼 또는 치료 자기편 세포를 추가 할 때, microwells의 측면에주의 깊게 볼륨을 추가하여 세포를 방해하지 않도록주의해야합니다. Combitip를 사용하여 연습합니다. | |
IgE에 / DNP-BSA는 자연 릴리스 레벨에 β-헥 소사 미나의 방출을 일으키는 원인이되지 않는다 | IgE에 30 일 이상이거나 녹여 동결의 대상이되었습니다 | IgE에의 새로운, 제대로 저장 나누어지는을 사용합니다. | |||
DNP-BSA 제대로 혼합되지 않았습니다 | 주의 원뿔 튜브와 t에 DNP-BSA의 작은 볼륨을 추가해야합니다철저 오 소용돌이. | ||||
A23187 이온 운반체는 자연 릴리스 레벨에 β-헥 소사 미나의 방출을 일으키는 원인이되지 않는다 | A23187 주식은 제대로 재구성되지 않았습니다 | 제품은 "박막"로 도착 및 관리 등을 소용돌이로 교반으로 재구성해야합니다. 전송 저장을위한 새로운 1.5 ML 튜브에 재고를 재구성. | |||
A23187 재고가 제대로 저장되지 않았습니다 | 주식은 빛을 구분합니다. 일단 재구성, 파라 필름 위쪽 및 저장소는 -20 ° C.에 호일에 싸여 재고의 보관에 대한 질문이 있으면 버리고 새 주식으로 테스트를 시작합니다. | ||||
A23187 이온 운반체의 180 nm의은 유도하지 않습니다이전 분석에서 발견 된 것과 관련 탈과립 반응의 수준, | A23187 이온 운반체의 로트의 변화 | 이온 운반체의 새 제비를위한 용량 반응 실험을 수행 할 수 있습니다. 또한 같은 많은에서 주식 인해 재구성 프로세스의 잠재적 변동성을 테스트 할 것을 권장합니다. |
어떤 독성 / 약리 실험에서와 같이 시험 화학 시험 농도에서 명백히 독성이 없어야합니다. 우리는 방법을 사용하는 것이 좋습니다 세포 사멸 및 괴사, 개별적으로 또는 조합 (예 : clonogenic의 분석처럼)뿐만 아니라 세포막 (예 : 젖산 탈수소 효소 누설 등)에 일반 손해에 대한 테스트를 모두 테스트.에게 TCS는 본 연구에서와 같이 농도, RBL-2H3 세포 2 세포 독성이 없습니다. 이온 운반체 연구와 관심의 특정주의는 이온 운반체 플러스 이온 운반체 차량(가능성 DMSO), 플러스 시험 화학 물질, 플러스 사용되는 유기 용매는, 파머 등의 수행으로 조심스럽게 제어해야 잠재적으로 독성 양조 될 수 있습니다. 2
유기 용제를 사용하지 않고 TCS 솔루션을 준비하기위한 우리의 프로토콜은 용매 유물, 수생 독성에 특히 중요한 고려 사항의 간섭없이,이 유비쿼터스 화학의 추가 독성 시험에 유용 할 것입니다.이 방법은 또한 TCS의 농도를 검증 할 수 같은 TCS와 같은 화학 물질, 비만 세포 탈과립에 미치는 영향 솔루션 정량화한다. 이 프로토콜은 이러한 화학 물질 55를 중단 의심 내분비 같은 비만 세포 탈과립에 대한 화학 물질의 다양한 효과를 평가하는 데 사용될 수 있으며, 잠재적으로 높은 처리량 검사를 위해 확장 할 수 있습니다. 또한, 다른 마스트 세포 유형은 향후 연구에서이 분석에 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
LMW 및 RHK는 생명 과학 및 엔지니어링 (GSBSE)의 UMaine의 대학원에 의해 지원됩니다 RHK는 메인 농업 및 산림 실험 역에 의해 지원되었다. 추가 자금은 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIH P20-GM103423), 메인 농업 및 산림 시험장 (허가 번호 ME08004-10, JAG), 타이드 센터 (NSF 그랜트 # 1,008,498)를 상승 메인 ADVANCE의 대학에 의해 제공되었다 및 PhRMA 재단 (JAG)에서 약리학 / 독성학의 연구 스타터 부여합니다. 우리는 Drs에 감사드립니다. 항원 세포 데이비드 Holowka와 바바라 베어드. 우리는 히나 Hashmi, 알레한드로 벨 레즈, 장비 및 명령에 대한 도움말 앤드류 Abovian에 감사합니다. 이 메인 농업 및 산림 시험장 간행물 번호 3311입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RBL-2H3 Cells |
ATCC | CRL-2256 |
The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC |
| Triclosan/Irgasan |
Sigma | 72779 CAS# 3380-34-5 |
Should be stored in a low humidity environment |
| Trypsin |
Gibco | 25300-054 CAS# 3380-34-5 |
|
| EMEM |
Lonza | 12-611F |
|
| Fetal Bovine Serum |
Atlanta Biologicals | S11150 |
|
| Gentamycin Sulfate |
Lonza Biological Sciences | 17-518 |
|
| Albumin, Bovine Serum |
Calbiochem | 12659 CAS# 9048-46-8 |
|
| Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution) |
Pierce | 28314 CAS# 9002-93-1 |
|
| HEPES |
J.T Baker | 4153-01 CAS# 75277-39-3 |
|
| Magnesium Chloride |
VWR | BDH0244-500G CAS# 7791-18-6 |
|
| D-(+)-Glucose |
Biomedicals | 152527 CAS# 50-99-7 |
|
| Potassium Chloride Crystal |
J.T Baker | 3046-01 CAS# 7447-40-7 |
|
| Calcium chloride dihyrdate |
Acros Organics | 207780010 CAS# 10035-04-8 |
|
| Glycine |
Sigma | G8898 CAS# 56-40-6 |
|
| 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU) |
EMD Biosciences | 474502-250MG CAS # 37067-30-4 |
Wrap in foil – is light-sensitive |
| Anti-DNP Mouse IgE |
Sigma | D8406 |
Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month. |
| DNP-BSA |
Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University | Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018 |
|
| Calcium Ionophore A23187 |
Sigma | C75-22-1mg |
Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully |
| DMSO |
Sigma | D2650 CAS# 67-68-5 |
|
| Acetic Acid |
VWR | BDH3094-2 CAS# 64-19-7 |
|
| Anhydrous Sodium Carbonate |
Sigma | 222321 CAS# 497-19-8 |
|
| Sodium Chloride |
Sigma | 71376 CAS# 7647-14-5 |
|
| Hydrochloric Acid |
VWR | BDH3026 CAS# 7647-01-0 |
|
| Reference Buffer, pH 7 |
VWR | BDH5046 |
|
| Reference Buffer, pH 10 |
VWR | BDH5072 |
|
| Reference Buffer, pH 4 |
VWR | BDH5018 |
|
| pH electrode storage solution |
VWR | 14002-828 |
|
| Equipment: | |||
| DU 7500 Spectrophotometer |
Beckmann | No longer sold |
|
| Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software |
BioTek | Module S |
|
| Hematocytometer |
Hausser Scientific | 3110 |
|
| 7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate |
VWR | 97042-634 |
|
| Centrifuge |
Eppendorf | 5430 |
|
| Tissue culture water bath |
VWR | Model# 89032-206 |
|
| Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood) |
The Baker Company | Model# SG403A-HE |
|
| Tissue culture incubator |
ThermoScientific | Model# 3598 |
|
| Pipetman |
VWR | Range: P2-P1000 |
|
| Balance |
Mettler Toledo | Model# AG204 |
|
| pH meter |
Symphony/VWR | Model# SB70P |
|
| Pipet-Aid |
Drummond Scientific | 4-000-100 |
|
| Combitip dispenser |
Eppendorf | 4981 000.019 |
|
| Recipes: | |||
| Acetate Buffer, pH 4.4 |
Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml | Sterile Filter into autoclaved glass bottle |
|
| Substrate (4-MU) |
Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again | For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer |
|
| Glycine Carbonate Buffer, pH 10 |
26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| Tyrodes (2 L), pH 7.4 |
135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4 | Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
| RBL Cell Media |
Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only. | Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle |
|
| Plastic material used: | |||
| 200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack |
VWR | 53509-009 |
polypropylene |
| 1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery |
VWR | 89003-420 |
polyethylene |
| 10 µl micro tip low binding sterile |
VWR | 14217-704 |
polypropylene |
| Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force |
VWR | 20170-038 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-178 |
polypropylene |
| Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR | 21008-103 |
polypropylene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 690175 |
polystyrene |
| CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One | 658175 |
polystyrene |
| CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 607180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 710180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 606180 |
polystyrene |
| CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One | 760180 |
polystyrene |
| 1 cm cuvettes |
N/A | N/A |
polystyrene |
| CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate |
Greiner Bio One | 655086 |
polystyrene |
| Combitips |
Eppendorf | 022266501 |
Polypropylene/ polyethylene |
References
- Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
- Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
- Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
- Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
- Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
- Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
- Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
- Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
- Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861 (1997).
- Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
- Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
- Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
- Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
- Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
- Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
- Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
- Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
- Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
- Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
- Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
- Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
- Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
- Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
- McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
- Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
- Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
- Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
- Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
- Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
- Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937 (2002).
- Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
- Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
- Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
- Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
- Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
- Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
- Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
- Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
- Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
- Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
- Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
- Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
- Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
- Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
- Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
- Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
- Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
- Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
- Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
- Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
- Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
- Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
- Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
- Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
- Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
- Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
- Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
- Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
- Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
- Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).
