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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Published: November 1, 2013 doi: 10.3791/50671
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono
* These authors contributed equally

Summary

マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン2の強力な阻害効果を発揮するために利用。

Abstract

マスト細胞はアレルギー疾患や寄生虫に対する免疫防御において重要な役割を果たしている。かつて（アレルゲンによって）アクティブに、彼らは、アレルギー性メディエーターのエキソサイトーシスで結果そのプロセスを脱顆粒。薬物および毒物による肥満細胞の脱顆粒の変調は、人の健康に正または悪影響を与える可能性があります。肥満細胞機能は、ラット好塩基球性白血病マスト細胞の使用（RBL-2H3）、ヒト粘膜肥満細胞の広く受け入れられているモデルまでの時間を詳細に切開されている。 6肥満細胞からのヒスタミンと連携して直線的に放出される肥満細胞顆粒成分およびアレルギーメディエーターβ-ヘキソサミニダーゼを、容易かつ確実に適しているマイクロプレートアッセイで測定可能な蛍光強度を得、蛍光原基質との反応により測定することができる高スループット研究1。もともとNaal らによって出版した。1、我々は、スクリーニングOは、この脱顆粒アッセイを適応しているfは薬物や毒物、ここでその使用方法を示しています。

トリクロサンは、多くの消費者製品中に存在し、このエフェクトのメカニズムは不明であるが、人間のアレルギー性皮膚疾患における治療7-11援助であることが見出されている広域スペクトル抗菌剤である。ここでは、マスト細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの効果についてのアッセイを実証する。我々は、最近、トリクロサンを強くマスト細胞機能2に影響を与えることを示した。有機溶媒の使用を回避する目的で、トリクロサン熱と攪拌しながら水性緩衝液中に直接溶解させ、得られた濃度は、12（ε280 = 4,200 L / M / cmで使用）UV-可視分光光度計を用いて確認された。このプロトコルは、より広く、そのアレルギー電位をマスト細胞の脱顆粒に対する効果を決定するために様々な化学物質と一緒に使用される可能性があり、。

Introduction

マスト細胞は喘息、アレルギー、寄生虫防衛および発癌13-16で重要なメディエーターとして機能性の高い造粒免疫エフェクター細胞である。彼らは、脱顆粒するために活性化されるまで、彼らは無事に質顆粒にアレルギー性および炎症性メディエーターを保管ほぼすべての血管組織15に存在します。脱顆粒は、そのようなヒスタミン、トリプターゼ、およびロイコトリエン15と薬理学的に活性なメディエーターの放出をもたらす膜結合顆粒のエキソサイトーシスである。寄生虫に対する防御だけでなく、アレルギー性喘息、および発がん応答15を開始することをマウントする上で重要であるI型過敏性反応の開始でこのプロセスは結果。

肥満細胞および好塩基球は、FcεRIを受容体、免疫グロブリンE（IgE抗体）17のための高親和性受容体を発現する。アレルゲンまたは抗原への曝露は、複数のIgE結合したFcεRIを受容体17の凝集を引き起こし、それがこのsであるチロシンリン酸化事象のカスケード、ホスホリパーゼC、内部貯蔵からのカルシウムの流出、およびセル18へのカルシウムの流入の活性化：脱顆粒プロセスを開始したIgEに結合したFcレセプターの"架橋" O-と呼ばれる。このカルシウム流入は、脱顆粒のために必要であり、さらに、顆粒のエキソサイトーシス15を起こす前に、膜と顆粒の融合を通知します。実験的に、カルシウムイオノフォアを直接本質的にすべてのシグナル伝達は、上流または下流のものとして毒物による経路標的の同定を可能にする、カルシウム流入工程20の前にステップ迂回細胞膜19を横切って往復カルシウムを使用することができカルシウム20に信号を送る 。

脱顆粒は、ヒスタミン6一緒に顆粒から直線的に放出される細胞上清の中にβ-ヘキソサミニダーゼの放出を監視することにより、迅速かつ効果的に測定された、しかし、私ができるシンプルな酵素 - 基質反応およびアッセイ蛍光生成物をするマイクロプレートリーダーを用いて検出するのははるかに簡単。このマイクロプレートアッセイ、プロトコル·セクションに詳述したように、最初にNaal らによって開発された堅牢な方法に基づいている。1で4 -メチル-N-アセチル-β-D-グルコ蛍光基質の切断を定量化β-ヘキソサミニダーゼ。私たちは、トリクロサンはここに強調​​して、薬や毒物の影響をテストするためのアッセイ法を変更しました。この方法は確実に脱顆粒を定量化する、例えば、フローサイトメトリーベースの検出方法21に安価な代替品であり、抗アレルギー薬の多種多様なハイスループットスクリーニングにうまく自分自身を貸すする可能性があるだけでなく、免疫毒性またはアレルギー物質。この最後の点は、21 世紀 、2007年の国立研究協議会報告書"毒性試験の観点から特に重要である：ビジョンとストラトEGY "（ http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970マウスのような伝統的な実験動物の高価な使用を減らすために、細胞培養を利用した高スループット毒性試験の開発のための提唱）。 Naal らによって開発された1、私達2によって変更された脱顆粒プロトコルは、相同なヒト粘膜肥満細胞または好塩基球3-5に広く受け入れられているモデルであるRBL-2H3細胞株を利用する。 （培養RBL-2H3細胞のための方法は、ハッチンソンらに詳述されている。22）。このアッセイは、おそらく接続されているすべての肥満細胞のタイプに適合させることができる。

トリクロサン（TCS）は、病院、パーソナルケア製品、および消費財23,24において30年以上に使用されている広域スペクトル抗菌薬である。 TCSの抗菌特性の作用機序は、エノイル-アシルを阻害することによって可能性が高い、脂肪酸生合成の阻害であるキャリアタンパク質レダクターゼ25,26。このようなシャワージェル、ハンドローション、歯磨き粉、うがい薬、および0.3％または10 mMの24までの濃度におけるハンドソープのような消費者製品の広い範囲で世界的に見られる。 TCSの普及は人間27-29や河川30で検出可能なレベルをもたらしました。 Allmyr らによって行われた研究27は、TCSとその代謝物は、授乳中の母親からプラズマとミルクの両方に存在していることを実証した。重要なのは、TCSは容易に皮膚31-37に吸収される。 Queckenberg ら 37は、肥満細胞が存在する皮膚にかなりの濃度で、その結果、12時間以内に人間の皮膚に〜70mMのTCSクリームの約10％の吸収を発見した。

TCSは、ヒトのアレルギー性皮膚疾患7-11を管理するために臨床的に示されているが、TCSが、アレルギー性皮膚疾患を緩和する機構は38知られていなかった。蛍光マイクロプレートアッセイを使用してdetailedがこのビデオでは、我々は最近、2μMという低濃度でTCSは、かなりこれらの臨床データ2のための潜在的な説明を提供して、マスト細胞機能と脱顆粒を減衰することを実証した。これらの臨床データの説明を提供することに加えて、パーマーら、我々の知見は、 図 2には、TCSがカルシウム流入の下流シグナル伝達分子標的とすることを示唆している。多くの免疫学的および他の生物学的プロセスにおけるカルシウムシグナル伝達の重要性のために、TCSは、潜在的に必要な生物学的プロセスの様々に悪影響を及ぼす可能性がある。実際には、Udoji ら 39は、TCSが別の重要な先天性免疫機能、ヒトナチュラルキラー細胞溶解活性を抑制することが示された。

アレルギー性皮膚疾患（または、逆に、免疫毒性など）で治療補助としての可能性を超えて、TCSもかく乱40-49内分泌かもしれません。このように、溶液中のこの化学物質を準備する方法についての明確な手順I毒物への興味のあるの。 TCSが小さい疎水性分子であるため、有機ビヒクルは、しばしば、水に溶けやすくするために使用される。 TCSがテストされているほとんどの毒性試験では、製剤は、エタノール、アセトン、または油2,50,51などの有機溶媒を用いて水に溶解関与している。しかし、しばしばこれらの溶剤は、それによって被験物質データ51の解釈を複雑にし、自分自身を生物学的に活性である。実際には、Rufli らによる。52等53は、水生毒性実験のための試験溶液は、毒性成果物を作成するための化学溶媒の電位により、化学的方法を介して物理的方法を用いて調製されることが推奨される。我々は以前TCSが0.24％のエタノール/水（体積/体積）中に溶解し、30分を減衰RBLマスト細胞の脱顆粒2超音波処理することを示した。 0.24％より高い濃度でエタノールが肥満細胞degraを抑制することが示されているnulation 54,55-examplesの毒性試験で有機溶剤の潜在的交絡効果の。

それだけではなく生物又は研究のために使用される細胞に対する溶媒の影響を考慮することが重要であるだけでなく、それは被験物質自体に溶媒の影響を監視することが重要である。たとえば、Skaare ら 51は、油中の解散は、関数の完全な損失を引き起こしながら、（一般的に歯磨きやうがい薬で見つかった）ポリエチレングリコールでTCSを溶解が健康な女性の女性の抗細菌および抗プラーク効果を弱めていることがわかった。したがって、異なる溶媒の能力はTCSを含む、毒物および薬物を調節するために、効果をアッセイ設計において考慮されるべきである。油または風味添加物の使用は様々な製品50,51におけるTCSの効果を妨げる可能性があります。

有機溶剤を使用する必要性を排除する目的で、我々は、有機ゾルの使用を排除することによってTCS 2を溶解させるための手法に改良ベント。現在のプロトコルでは、我々は熱（≤50°C）で水性緩衝液に直接TCS顆粒を溶解した後、紫外可視分光光度法によってこのTCSの株式の濃度を確認してください。 TCSは、40μM（最大水溶性であるため、これらの改良が可能であるhttp://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ）および50℃（加熱されたときに分解に抵抗することが示されているhttp:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ）56,57。 TCSも強く4,200 L /モル/ cmで12モル吸光係数が280nmの58で吸収することが知られているように、我々はまた、UV-可視分光測定の付加的な利点を有する。

このプロトコルは、低コストかつ迅速な検証を含む、有機溶剤を使用せずにバッファにTCS顆粒を溶解するために、シンプルでありながら効果的な方法を提供濃度、およびマスト細胞の脱顆粒に対する化学的影響を監視するための強力な蛍光マイクロプレートアッセイを説明しています。

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Protocol

すべてのバッファレシピがプロトコルテキストの末尾の表に含まれていることに注意してください。

1日目 ：

1。細胞の調製

  1. エッジ効果を避けるために、レイアウト上の試験サンプルを中心に、96ウェルプレートセットアップ方式を計画。割り当て3は、各TCS濃度は（抗原またはイオノフォアの±脱顆粒刺激）テストだけでなく、自然放出（無顆粒刺激）に対して三連、最大放出（0.2％トリトンX-100 [TX]洗剤溶解）と同様に、のために複製井戸は、背景サンプル（無細胞を含まないでしょうが）のために予約。各反復実験の日に、TCSサンプル濃度の新しいランダムレイアウトを選択します。
  2. 37℃の水浴中で暖かいRBLメディア（レシピは、表に記載されている）およびトリプシン。
  3. 良いヒールの一般的な兆候をT-25フラスコ内のRBL細胞（2-4最後の通過日から、それらが解凍されてから3〜4ヶ月未満）をチェック目：メディアの色、濁りの欠如によって示され、適切なpH値。フラスコは、汚染がないことを、細胞が正常に合流健康表示され、主に付加ことを確認するために、光学顕微鏡下でフラスコを置きます。細胞は約6週間ごとに22マイコプラズマ汚染のためにチェックする必要があることに注意してください。
治療 三重
刺激され、0μMTCS A7、B7、C7、F4、G4、H4
刺激され、0.001μMTCS F6、G6、H6
刺激され、0.1μMTCS A4、B4、C4
刺激され、1μMTCS A6、B6、C6
刺激し、5μMTCS F5、G5、H5
刺激され、10μMTCS A3、B3、C3
刺激され、15μMTCS A5、B5、C5
刺激され、20μMTCS G7 F7、H7
刺激され、加えて最高[TCS] F3、G3、H3
（モックを含む）いいえTCS、自発 A10、A11、A12、B10、B11、B12、A1、A2、A8、B1、B2、B8、C1、C2、C8、F1、F2、F8、G1、G2、G8、H1、H2、H8
TX-100、ノーTCS D10、D11、D12、E10、E11、E12
いいえ細胞はない、背景、プラス最高[TCS] G10、G11、G12、H10、H11、H12

図1
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  1. 無菌組織培養（TC）フードにRBL細胞フラスコを取る。細胞は、ボットに接続されているフラスコのトム。 TCのフードの下で働いて、標準的な無菌技術を使用して、滅菌ピペットを用いてフラスコからすべてのメディアを取り出し、細胞がフラスコの底部に取り付けられたまま。次に、2 mlのトリプシンでフラスコをすすぎ、その後、この洗浄を捨てる。
  2. フラスコの底をカバーするために正確に2ミリリットルトリプシンを追加します。 5分間℃のインキュベーター、細胞がフラスコの底から切り離すことができるように37に入れた。
  3. 5分後、細胞を緩め、オープン手のひらでフラスコの側面を押してください。直ちに、フラスコから細胞を洗浄し、トリプシンをクエンチし18ミリリットルRBLメディアを追加。直ちにフラスコと新しい、無菌の50mlチューブ（このチューブの総容積は現在20ミリリットルである）への転送セルメディアトリプシン混合物を取り出します。
  4. 優しくしかし徹底的に混合した後、このチューブからの細胞懸濁液50μlを削除し、カウントされる試料は1.5 mlの滅菌マイクロ遠心チューブに移す。このサンプルを取るだけでなく、50ミリリットル0;ベンチにTCフードの細胞メディアトリプシン混合物を含むチューブ。
  5. 500×gで8分間遠心分離を50 mlチューブを（適切なバランスで）スピン、この力ペレット細胞を効果的に。
  6. スピンこの間、スピニング前単離したサンプル中の細胞を数える。これを行うには、最初の1.5 mlのチューブに細胞の50μlにトリパンブルー色素の50μlを添加し、ゆっくりとしかし徹底的に混在させることが5倍アップするピペットダウン。直ちに、ガラス血球計数器にこの混合物10μlを転送し、メーカーの指示に従ってグリッド領域内のセルを数える。合理的な統計結果には、少なくとも100個の細胞をカウントします。
  7. 戻るTCフードで、スピンダウンした細胞からの上清を除去します。
  8. セルチューブにフタをし、細胞を緩めチューブの底にペレットをフリック。
  9. 細胞数をもとにして0.5×10 6細胞/ mlの密度を得トリプシン処理細胞にメディアを追加する。 メッキ手順中に懸濁された細胞を維持するために十分ですが優しく混ぜる。ピペットマンを用いて、プレートテンプレートシート続いて、96ウェルプレート（平、黒下）に100μl/ウェルの細胞を入れた。細胞は、系統誤差を回避する、三ウェルの各セットが追加された後に混合するためのウェルに添加する方法をランダム化する。背景サンプルのラベルが付いウェルに細胞を入れないようにしてください。
  10. 一度すべてのセルが転送された、プレートにプレートカバーを置き、一晩（37℃/ 5％CO 2）インキュベーターに移す。標準無菌続くクリーンアップします。

2日目 ：

2。トリクロサンの調製

  1. ラベルの付いた500ミリリットルの三角フラスコにメスシリンダー、測定250mlのタイロードバッファーを（表に記載されているレシピ）を使用して、 "TCS-バッファ。"バーをかき混ぜる追加。 TCSでの使用のみのために指定棒、温度計をかき混ぜる、ガラス製品を使用してください。
  2. また、この時、測定値250別の500mL三角フラスコにミリリットルタイロード、ラベルの付いた "制御バッファ。"使用ガラス製品は、バー、TCS用に指定されていない温度計をかき混ぜる。バーをかき混ぜる追加。
  3. TCS顆粒と "TCS-バッファ"フラスコ（250mlのタイロードバッファーを含む）への転送0.0022グラムを秤量する。効率的に三角フラスコに顆粒を転送するためには、すべてのTCSが転送されたことを確認し、ボートを量る洗い落とすために測定された250mlのタイロードから10ミリリットルを使用しています。
  4. 場所組み合わせホットプレート/磁気攪拌プレート上に "TCS-バッファ"フラスコ、およびmanageably高速で攪拌し、それを設定してください。一度よく混合、このTCSストックは公称30μM（実際の濃度は、加熱後に計算されます）になります。 （化学ヒュームフード内のすべてのミキシングを行います。）
    1. また、この時点で、第二の組み合わせホットプレート/磁気撹拌プレート上に "バッファコントロール"フラスコない（TCSを含まない）を配置し、同様の速度で攪拌するように設定する。
  5. 後で使用するために、ランプをウォームアップするUV / Visのランプをオンにします。
  6. 絶えず攪拌しながら50℃に "TCS-バッファ"ソリューションを熱し。かつて最大90分間温度、時間に。 90分の間、頻繁に50℃の温度、適切な撹拌速度を監視し続けています。
    1. 同時に、°C連続的に攪拌しながら50に "制御バッファ"ソリューションを（プレーンタイロードバッファーのちょうど250ミリリットルです）加熱。 50に到達すると、時間温度（50℃で維持し）、撹拌を監視する両方その間°C、90分間の時間、。
  7. 90分の終わりには、ホットプレートや卓上への転送をオフに三角フラスコの両方を取る。
  8. ブランクマシンが加熱 "TCS-バッファ"液1mlをスキャンする前に加熱 "制御バッファ"溶液1mlに、UV /可視分光光度計で波長スキャン機能を使用する。 、スペクトルの形状を確認する280nmでのDレコード吸光度値。濃度を決定するために、ランベルト·ベールの式を使用します（A 280 =ε280ℓc）のεを使って4200の280 L /モル/ cmで12と1cmのℓ。
  9. TCSの濃度を決定した後、 "TCS-バッファ"ソリューションの残りの249ミリリットルに0.249グラムのウシ血清アルブミン（BSA）を追加し、よく混ぜる。
    1. 同時に、 "制御バッファ"ソリューションの残りの249ミリリットルに0.249グラムBSAを追加し、よく混ぜる。

2日目 ：

3。 RBL-2H3細胞を用いた抗原刺激脱顆粒アッセイ

  1. 開始する前に、使用されているすべてのバッファのpHをチェックし、彼らは曇り明確ではないことを確認してください：これはタイロード緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、およびグリシン炭酸バッファー（レシピは表に記載されている）が含まれています。
  2. 37暖かいRBLメディアおよびトリプシン℃の水浴。
  3. BTを（1 mg / mlのメイク0;タイロード緩衝液中のBSA）：0.05グラムBSA + 50ミリリットルタイロード緩衝液（X2）。 37℃の水浴に入れた。
  4. BTの3.136ミリリットル+ 10％の64μlのトリトンX-100（トリトンX-100の最終濃度は0.2％です）トリトンX-100 0.2％を加えます。反転でよく混ぜますが、ボルテックスしないでください。 37℃の水浴に入れた。
  5. 。TCS、温水タイロードバッファー（ステップ"2、"上記） 注の準備を開始します。 "TCS-バッファ"と"制御バッファ"ソリューションは、50℃で攪拌されるまで、次のステップ（IgEの露出を）開始しないでください90分ヒート/攪拌時間の最初の70分。
  6. 両方の溶液を70分間50℃で攪拌された後、（100μl/ウェル）感作であることがサンプルウェルのためにRBLのメディアでは0.1μg/ mlの抗DNPマウスIgE抗体（Sigma）を構成しています。 4℃で保存した場合、IgEの在庫が30日以上経過してはいけません℃、在庫があるか古いレコード。混在させるフリックが、ボルテックスしないのIgEを行う。
  7. TCのボンネットの下に、を50mlチューブに6ミリリットルRBLメディアに0.6μlのIgEの株式を（在庫が1 mg / mlのです）を追加します。第二の50mlチューブでは、唯一の平野RBLメディア（非感作のサンプルのために意図されている）の6ミリリットルを追加します。
  8. シンクに96ウェルプレート（1日目に調製した）から、すべてのメディアをダンプし、TCのボンネットの下にプレートを持参。
  9. ランダム（48ウェル合計）刺激されるべきであるウェルに100μlのメディア/ IgEの混合物を追加します。この混合物は、 "自発的"、 "TX"、および "背景"のサンプルについては意図されていない。
  10. ランダムにのみ、 "TX"、 "自発的"と "背景"ウェルに100μlの平野RBLメディアを追加。
  11. プレートにプレートカバーを入れて、その後1時間℃のインキュベーター、5％CO 2/37にプレートを移動します。
  12. 3.24から1時間のインキュベーションの間、手順3.13に従ってください。
  13. ベンチでは、抗原希釈液を準備します。 1.6 mg / mlの株式DNP-BSA + 850μlの＆＃の0.53μLを追加160、BTは1μgの/ mlのの抗原濃度を取得する。渦と混合し、この株式を反転。
  14. かつて "TCS-バッファ"と "制御バッファ"加熱された後、50℃で90分間撹拌°C、TCSプロトコル（ - 2.8.1ステップ2.6に行く）準備の残りの部分を続行。 BSAは、両方のソリューションに溶解させた後、以下に続ける。
  15. ±銀、±TCSと、露出バッファの準備を開始。まず、 "TCS-バッファ"ソリューション（すでに90分間加熱攪拌されたこと）、新しい50 mlコニカルチューブに移す50mlを249ミリリットルサンプルから。これを50mlアリコート20μlのを削除し、0.0004μgの/ mlのDNP-BSAの最終抗原濃度のため、以前の準備1μgの/ mlの抗原20μlのと交換してください。ボルテックスと反転。
    1. ラベルはこの "チューブ1、ハイTCS / +銀/ + BT。"それは希釈し、最高TCS濃度曝露のために使用されます。
    2. "制御バッファ"ソリューションの249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlチューブに50ミリリットルを転送。この新しい50mlのアリコート20μlのを削除し、0.0004μgの/ mlのDNP-BSAの最終抗原濃度のため、以前の準備1μgの/ mlの抗原を20μlと交換してください。ボルテックスと反転。
      1. ラベルはこの "チューブ2、ノーTCS / +銀/ + BT"。 TCSの希釈と0μMTCS濃度露光に用いられる。
    3. 今 "TCS-バッファ"溶液50mlを取り出し、別の50 mlのチューブに入れた。この新しい50mlのアリコートから20μLを取り外し、平野BT20μlのと交換してください。ボルテックスと反転。いいえ抗原は追加されません。
      1. この "チューブ3、ハイTCSなし/銀/ + BT。"これは背景に使用されます。ラベルを付け
    4. 別の50 mlのチューブに "制御バッファ"溶液50mlを転送します。このNEから20μLを取り出す W 50mlのアリコートと平野BT20μlのと交換してください。ボルテックスと反転。 （いいえ銀は追加されません。）
      1. この "チューブ4、ノーTCSなし/銀/ + BT。"これは背景と自発のサンプルに使用されます。ラベルを付け
    BSA TCS 抗原
    チューブ1 チェックマークハイ[] チェックマーク
    チューブ2 チェックマーク NO チェックマーク
    チューブ3 / files/ftp_upload/50671/check.jpg "幅=" "15px /> ハイ[] NO
    チューブ4 チェックマーク NO NO
    1. "TCS-バッファ"株式の濃度を決定した後、希釈用のボリュームを計算し、記録する。各希釈濃度の総ボリュームは、1ミリリットルでなければなりませんし、滅菌マイクロチューブに準備する必要があります。校正されたP2およびP1000ピペットマンを使用してください。
    濃度 ハイトリクロサン+タイロード+ BSA 0.0004μgの/ mlの銀
    （上からチューブ1）     		加熱BT 0.0004μgの/ mlの銀
    （上からチューブ2）
    20μM
    10μM
    5μM
    1μM
    0.1μM
    0.001μM
    0μM（プレートの上部） ----------------------- 500μlを加えて別の500μlの
    0μM（プレートの底） ----------------------- 500μlを加えて別の500μlの
    1. 1-HRのIgEインキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り出してシンクにすべてのメディアを投げる。 （注：テストの化学物質が消費者製品TCSよりも毒性があることが知られている場合、有害な廃棄物処理が必要になることがあります。）
    2. Combitipを使用して、ランダムにBSA-タイロード緩衝液（200で96ウェルプレートに細胞を洗浄/ウェル）。付着した細胞を乱すことを避けるために、むしろ直接接続されているセルの上にも、井戸の側面に洗浄バッファーを解放します。プロセスをもう一度繰り返します。
    3. アプリケーション、渦の治療を準備し、右のプレートに添加する前に希釈を反転させる。
    4. プレートの上部のセクション以降では：ランダム対応するウェルに抗原溶液200μlの各（TCSの正しい濃度）の三重を追加します。プレートの底に進みます。プレート上のすべての "モック"を "制御バッファ"ソリューションプラスのAg（上記の "チューブ2"から）を追加します。
    5. 対応するウェルに適切な解決策を200μlを追加します。
      1. 0.2％トリトンX-100 "TX"に、指定されたウェルを200μlを加える。
      2. 次に、プレートの "バックグラウンド（BKGD）最高TCS"というラベルの付いた3ウェルにチューブ3を200μlを加える。
      3. 最後に、200μlのを追加チューブの4〜6ウェルは "自発的"というラベル
    6. 37℃/ 5％CO 2で1時間プレートをインキュベートする。
    7. 1時間のインキュベーション中：氷の2つのバケット（インキュベーター内で "古い"プレート用と新しいプレート用1）を取得します。それは光に敏感であるため、ホイルに保つ最大40分室温で解凍4 - メチル-N-アセチル-β-D-グルコ（4-MU）、。
      1. 一度4-MU在庫が解凍されて、4-MUワーキングソリューションを構成する：150μlの株式+冷たい酢酸緩衝液の14.85ミリリットル（表に記載レシピ）、渦と反転。ホイルに包まれた50ml遠心管、および使用するまで氷上で保管してください。
      2. Combitipを使用すると、ランダムにNEWグルニエ黒96ウェルプレート（アイスバケット＃2上の）の各ウェルの一番下に100μlの冷たい4-MUワーキングソリューションを追加。 、ランダムトリトンX-100ウェル内に、ランダムプレートの底内に、プレートの上部内でランダム作動溶液を添加することによって最初に起動そして最後にランダムに背景井戸内。
      3. 次のステップのためのP200チップの新しいボックスを入手してください。
    8. 1時間のインキュベーションの終わりには、良好な混合のためのよく回ったが混合しながら細胞に触れていない、（静かに、気泡を導入していません）4-5X上下アイスバケット＃1、ピペット上澄みにインキュベーターからセルプレートを置く。体系的に、基板（サンプルの同じ順序は、当初出予定）で新しいプレートに各ウェル場所から25μlのサンプルを取り出す。ときに、新しいウェル内の気泡を導入することなく、徹底的にサンプルを混ぜて上下ピペット。
    9. 37℃/ 5％CO 2で30分間インキュベートする。
    10. 30分間のインキュベーションの後、ランダムに325μlの合計に井戸を埋めるために、ウェル当たりコールドグリシン - 炭酸塩緩衝液200μlを（Combitipを使用）を追加します。 （トリトンX-100波及を回避するために、この添加は、トリトンX-100サンプルの最後にしてください）​​。プレートを読む前に気泡をチェック（クリーンP10ピペットで突くTE先端）は、任意の気泡をポップする。
    11. （セクション4へ）蛍光プレートリーダーでプレートを実行します。

    2日目 ：

    4。蛍光プレートリーダーの命令とデータ解析

    1. GEN5プログラム、オープン実験セクションを開きます。
    2. プレートリーダーとインサートプレート（左上隅がA1である）をオンにします。
    3. プロトコル矢印手順矢印カスタム測定値を設定するために読んでください。各ウェルからの生の蛍光データを収集するためにサンプルを、複製などについては何も追加しないでください。
    4. トップ50％を選択し、 "蛍光"、 "エンドポイント"、 "ノーマルスピード"、 "ゲイン40"、 "励起40分の360"、 "エミッション40分の460、"光学の位置を "読む"の下。光学トップオフセット：7メートルM。いいえぶれなし、遅延、無動力、よくないモニター、温度：インキュベーターオフ。
    5. フラットブラックボトム、96ウェルプレート（グルニエ96ウェル、平底）を選択します。
    6. プレートレイアウトとのディール：プロトコル矢印プレートレイアウト。繰り返し、希釈などを示すことなく、サンプルをセットアップする
    7. プレート矢印読み。
    8. ファイルを保存します：Excelにデータファイルをエクスポートします "エクセル"ボタンをクリックします。プレートレイアウトのためにとマトリックスのためにこれを行う。コンピュータとUSBドライブ上のファイルを保存します。
    9. Excelで、トリトンX-100の井戸を含むすべてのサンプルからの読み取りの平均バックグラウンドを減算します。
    10. 平均トリトンX-100の値で（すでにバックグラウンドを差し引いたた）それぞれの値を分割することによって、相対％の脱顆粒を計算し、その割合にするために100を掛けます。
    11. 平均は、すべて三連、標準偏差を計算します。平均値としてExcelのグラフのデータ値±標準偏差。統計的なテストのために、グラフパッドによってPrismソフトウェアになりました移動します。

    2日目 ：

    5。 RBL-2H3細胞を用いたイオノフォア刺激脱顆粒アッセイ

    1. 上記のように指示し、 "細胞の調製"のためのプロトコル（第1節、1日目）と "トリクロサンの調製"（第2節2日目）に従う。イオノフォア刺激のためのプレートレイアウト例を以下に示す。
    治療 三重
    刺激され、0μMTCS A7、B7、C7、F4、G4、H4
    刺激され、0.001μMTCS F6、G6、H6
    刺激され、0.01μMTCS F3、G3、H3
    刺激され、0.1μMTCS A4、B4、C4
    刺激され、1μMTCS A6、B6、C6
    刺激し、5μM[TCS F5、G5、H5
    刺激され、10μMTCS A3、B3、C3
    刺激され、15μMTCS A5、B5、C5
    刺激され、20μMTCS G7 F7、H7
    DMSO、無TCS（モックを含む）と、自発 A10、A11、A12、B10、B11、B12、A1、A2、A8、B1、B2、B8、C1、C2、C8、F1、F2、F8、G1、G2、G8、H1、H2、H8
    DMSO、無TCSとTX-100、 D10、D11、D12、E10、E11、E12
    いいえセルの背景ない、DMSOと、プラス最高[TCS] G10、G11、G12、H10、H11、H12

    図1 大きな画像を表示するには、ここをクリック 。

    1. 開始する前に、使用されているすべてのバッファのpHをチェックし、それらが明確で曇っていないことを確認してください。タイロード、酢酸ナトリウム緩衝液、およびグリシン炭酸塩緩衝液（レシピはテーブルに設けられた）。
    2. 50ミリリットルのタイロードバッファーに0.05グラムBSAを追加することで、よく混ぜてボルテックスでBTの1 50ミリリットルコニカルチューブを準備します。 37℃の水浴中でインキュベートする。
    3. 10％トリトンX-100〜4.704ミリリットルBTの96μLを加えることにより0.0032% DMSO（最終カルシウムイオ車両濃度）で、0.2％トリトンX-100を加えます。よく混ぜる。次に、この溶液を0.155μLを取り出して捨てる。今100％DMSOの0.155μlの後ろに追加します。
    4. イオノフォアバイアルに新鮮な100％DMSO400μlのを追加して混合するボルテックスすることにより粉末からA23187イオノフォアの5mMの株式（2.5 mg / mlの）を準備します。一度溶液中で、1.5 mlコニカルチューブ、記録の内容と今日の日付と有効期限（準備から3ヶ月-20℃で適切に保存されている）に転送。
      1. また、氷の上で今日の凍結ストックを使用している場合は、解凍、および5mM A23187イオノフォアはよく混合し、明確であることを確認します。渦、フリック、および使用する前に、この株式を反転。 ＃このA23187の準備とロトの基準日。
    5. かつて "TCS-バッファ"と "制御バッファ"は加熱して90分間攪拌してきた、TCSプロトコル（手順2.6-2.8.1に行く）準備の残りの部分を継続する。 BSAは、両方のソリューションによく混合した後、残りのプロトコルの手順を続行します。
    6. "TCS-バッファ"液249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。 50ミリリットルのアリコートの1.8μLを外し、5 mMのイオノフォア株式の1.8μLを加える。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転。ファイナルイオノフォア濃度は1です80 nmである。 A23187のこの濃度は、株式効力によって異なりますので注意してください、とA23187イオノフォア用量応答がRBL-2H3に非細胞毒性として同定されているおよそ20％の最大放出の脱顆粒のレベルを惹起A23187の濃度を特定することをお勧めします細胞毒性アッセイによる細胞（2参照）。
      1. この "チューブ1、ハイTCS / +イオノフォア/ + BT。"希釈と最高TCS濃度暴露に使用するラベル。
    7. "制御バッファ"ソリューションの249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。 50ミリリットルのアリコートの1.8μLを取り出し、5 mMのイオノフォア株式の1.8μlの後ろに追加します。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転。イオノフォアの最終濃度が180 nMである。
      1. ラベルは、この "チューブ2、ノーTCS / +イオノフォア/ + BT。"これは、希釈して0μMTCS濃度のために使用されます。
    8. Rの249ミリリットルのサンプルから 20、TCS-バッファ "ソリューション、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。新しい50ミリリットルのアリコートの1.8μLを取り出し、100％DMSOの1.8μLを加える。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転、無イオノフォアが追加されます。
      1. ラベルは、この "チューブ3、ハイTCS /いいえイオノフォア/ + BT / + DMSOは";背景に使用されます。
    9. "制御バッファ"ソリューションの249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。新しい50ミリリットルのアリコートから1.8μLを取り出し、100％DMSOの1.8μLを加える。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転。いいえイオノフォアは追加されません。
      1. ラベルは、この "チューブ4、TCS /ノーイオノフォア/ + BT / + DMSOいいえ";自発リリースサンプルに使用されます。
    BSA TCS イオノフォア追加された100％のDMSO
    チューブ1 "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "幅=" 15px "/> ハイ[] チェックマーク NO
    チューブ2 チェックマーク NO チェックマーク NO
    チューブ3 チェックマークハイ[] NO チェックマーク
    チューブ4 チェックマーク NO NO エックマーク "のfo：コンテンツ幅=" "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "幅=" "15px />で.1
    1. "TCS-バッファ"株式の濃度を決定した後、希釈用のボリュームを計算し、記録する。校正されたP2およびP1000ピペットマンを使用してください。各希釈濃度の合計体積1mlのであるべきであり、滅菌マイクロ遠心チューブ中で調製されるべきである。
    <TD>
    濃度 ハイトリクロサン+タイロード+ BSA 180 nMのA23187（チューブ1上から） 加熱BT +180 nMのA23187（チューブ2上から）
    20μM
    15μM
    10μM
    5μM
    1μM
    0.1μM
    0.001μM
    0μM（プレートの上部） ---------------------------------- 500μlを加えて別の500μlの
    0μM（プレートの底） ---------------------------------- 500μlを加えて別の500μlの
    1. インキュベーターのメッキ昨日の細胞を取り出して、シンクにメディアを空にします。 Combitipを使用すると、ランダムにBTと96ウェルプレート（200μL/ウェル）で細胞を洗浄する。洗浄をもう一度繰り返します。
    2. アプリケーション、渦の治療を準備し、右のプレートに添加する前に希釈を反転させる。プレートの上部のセクションで始まる：ランダムcorrespoに200μlに三重TCSの正しい濃度のそれぞれを追加よくnding。プレートの底に進みます。プレート上のすべての "モック"を "制御バッファ"ソリューションプラスA23187を（ "チューブ2"上から）を追加します。
    3. 対応するウェルに適切な解決策を200μlを追加します。
      1. 0.2％トリトンX-100 "TX"に、指定されたウェルを200μlを加える。
      2. 次に、プレートの "バックグラウンド（BKGD）最高TCS"というラベルの付いた3ウェルにチューブ3を200μlを加える。
      3. 最後に、ラベルの付いたチューブ4〜6のウェルを200μl加える "自発的に。"
    4. 37℃/ 5％CO 2で1時間プレートをインキュベートする。
    5. 1時間のインキュベーション中：氷の2つのバケット（インキュベーター内で "古い"プレート用と新しいプレート用1）を取得します。それは光に敏感であるため、ホイルに保つ最大40分室温で解凍4 - メチル-N-アセチル-β-D-グルコ（4-MU）、。
      1. 一度4-MU在庫が解凍されて、4-MUワーキングsolutiを作る上：150μlの株式+ 14.85冷たい酢酸緩衝液（表に記載レシピ）、渦と反転。ホイルに包まれた50ml遠心管、および使用するまで氷上で保管してください。
      2. Combitipを使用すると、ランダムにNEWグルニエ黒96ウェルプレート（アイスバケット＃2上の）の各ウェルの一番下に100μlの冷たい4-MUワーキングソリューションを追加：上部の内ランダムに実用的なソリューションを追加することで、最初に起動ランダムにプレートの底内、ランダムにトリトンX-100井戸の中、最後にランダムに背景井戸内プレート、。
      3. 次のステップのためのP200チップの新しいボックスを入手してください。
    6. 1時間のインキュベーションの終わりには、良好な混合のためのよく回ったが混合しながら細胞に触れていない、（静かに、気泡を導入していません）4-5X上下ピペット上清、第1位アイスバケットにインキュベーターからセルプレートを置く。体系的に、基板と各ウェルと場所から新しいプレートに25μlのサンプルを取り出し（同じSAの順序mples、当初）を計画した。ときに、新しいウェル内の気泡を導入することなく、徹底的にサンプルを混ぜて上下ピペット。
    7. 37℃/ 5％CO 2で30分間インキュベートする。
    8. 30分間のインキュベーションの後、ランダムに325μlの合計（トリトンX-100波及を回避するために、最後のトリトンX-100をサンプルに、この付加を作る）に井戸を埋めるために、ウェル当たり200μlの冷たいグリシン - 炭酸バッファー（Combitipを使用）を追加します。プレート（任意の気泡をポップするために、クリーンP10ピペットの先端で突く）を読む前に気泡を確認してください。
    9. （第4章のすべての手順に従ってください）​​蛍光プレートリーダーでプレートを実行します。

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Representative Results

90分間50℃に加熱すると、TCSのためのUV-可視吸収スペクトルは図1に示すように、280nmの付近のピークで、260〜300nmの間の強力な、滑らかな曲線を生成する。 UV-可視分光光度計は、従って、280nmで公開されてモル吸光係数が4,200 L /モル/ cmで12であるので、濃度を計算するために利用することができる重要なツールである。我々は、TCSが50°Cに加熱した（データは示さず）後に、全体の脱顆粒実験の時間枠の間に溶液から脱落しないことを見出した。

マストから解放β-ヘキソサミニダーゼのレベルを記録し、このアッセイは、水性緩衝液に直接TCSを溶解するために、この加熱法を使用した後、我々はNaal らから最適化された蛍光ベースのアッセイを用いて肥満細胞の脱顆粒にTCSの効果を検討した。1蛍光発生基質産物を検出することにより、一時間のインキュベーション後の細胞。 DNP-BSによって脱顆粒に刺激するかどうか抗原（ 図2）やカルシウムイオノフォアA23187（ 図3）は 、1は明らかにTCSがβ-ヘキソサミニダーゼの放出の有意な用量反応性の阻害（ すなわち脱顆粒）を引き起こすことがわかります。

図2は、1 "TCS-バッファ"で時間や"制御バッファ、"インキュベートし、0.0004μgの/ mlでのDNP-BSA抗原線量に曝露したIgE抗体感作RBL細胞について得られた結果を表している。 DNP-BSAのこの濃度は、±0.1（平均±標準偏差）TCSの不在下で22.5％の平均絶対脱顆粒応答を誘発した。脱顆粒の統計的に有意な阻害が脱顆粒のレベルが0μMTCS制御レベルの0.79倍±0.05（平均±SD）であった5μM、で始まった。 TCS濃度が増加するにつれて、TCSのより大きな減衰効果が強い用量反応関係を示すがある。 TCS、20μMで、almostは完全に自発的な脱顆粒（まだ抗原が存在しない場合）にほぼ等しいレベルまで、脱顆粒応答をabrogates。全体的に、この図は、有機溶媒を使用せずに、濃度を検証TCSに起因する多価抗原刺激肥満細胞の脱顆粒の強力な阻害を示す。

図3において、カルシウムイオノフォアA23187はTCS-誘発されRBL肥満細胞の脱顆粒の減衰機構を調査するための方法として使用した。それは上流のカルシウム流入のFcεRIを架橋やその他のシグナル伝達事象をバイパスし、それでも脱顆粒を引き起こすので、A23187は、代替興奮剤として使用されます。 RBL肥満細胞を、1 "TCS-バッファ"で時間または180 nMでのカルシウムイオノフォア用量を含有する "制御バッファ、"インキュベートした。 TCSの非存在下で、A23187のこの濃度は、25.1％の平均絶対脱顆粒応答を誘発±4.7（平均±標準偏差）。脱顆粒の阻害であったわずか1μMで見つかったTCS（0.63±0.11 [平均±SD]）。 TCS濃度が増加するにつれて、阻害の程度は行います5μM、0.21倍±0μMTCS制御レベルの0.04で、10μM、0.09±0.05で、15μM、0.077±0.006であり、20μMで、0.09±0.02（平均±SD）。実際には、5μMとTCSの高濃度から、A23187-誘導性脱顆粒のレベルは自発的制御のレベル（ここで、まだA23187が全く存在しない）の近くであることがわかった。全体的に、 図3は 、 図2と組み合わせて、TCSが標的分子事象は、カルシウム流入の可能性が下流であることを示している。

図1
図1：代表TCS紫外-可視吸収スペクトル TCSは、堅牢なエンドウ豆を持っています。簡単280の決定、ならびにタイロード緩衝液に溶解TCSの実際の濃度を決定するために、4,200 L /モル/ cmで12モル吸光係数を使用する能力を与えるを可能に280nmでkは、。黄色い線が280nmのピークを示している。この例では、280 nmの吸光度の値が28.28μMのTCSの濃度を示している、0.11876です。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2
図2：0.0004μgの/ mlのDNP-BSA抗原及びTCS（0-20μM）にさらされたIgE感RBLマスト細胞の代表脱顆粒応答自発リリース値（無存在する抗原）は参考のために描かれている。値は意味を表す7、三重サンプルの標準偏差。提示されたように、データは、制御（0μMTCS）に正規化し、有意差はTukeyの事後検定（比較は0.001μMTCS平均応答に対して行われた）、続いて一元配置ANOVAによりPrismソフトウェアで測定した。意義は、*** P <0.001で表されます。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3
図3：TCS（0-20μM）の存在下で180 nMのA23187カルシウムイオノフォアで刺激RBL肥満細胞の代表脱顆粒応答自発リリースサンプルがない（イオノフォア現在）参考のために描かれている。値は三連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。ケートとしてdは、データは対照（0μMTCS）に正規化され、有意な差はTukeyの事後検定（比較は0.001μMTCS平均応答に対して行われた）、続いて一元配置ANOVAによりPrismソフトウェアで測定した。意義は、*** P <0.001で表されます。** P <0.01。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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Discussion

2004年に、Naal ら は、脱顆粒1の高スループット試験のため、肥満細胞バイオセンサーを開発した。それは私達が私達のTCS研究のために適応され、このビデオで詳述していることを堅牢アッセイである。前にNaal ら 1アッセイ、マスト細胞の脱顆粒が日常β-ヘキソサミニダーゼ59-61によって評価が、これらの初期の方法は、一つのサンプルを一度に読み込みされた蛍光光度計を利用した。されていた重要なのは、Naal ら 。マイクロプレートリーダーおよびサンプルは蛍光光度計の1つずつを読んでされた以前の方法を利用してそれらのよりハイスループットな方法との間の直接的な一致を確立した。要するに、Naal ら 1が大幅同様にワークフローにいくつかの変更を組み込むことにより、ハイスループットマイクロプラットフォームにそれを適応させることでスピード、パワー、シンプルさ、および検定の信頼性を向上させた。ここでは、ここでさらに、具体的には、様々なテストの化学物質の研究のために、このアッセイを適応している、ユビキタス薬TCS。ビデオの詳細この非常に有用なアッセイの手順。さらに、我々はまた、水性緩衝液中でTCSを適用した有機溶媒を含まない方法を開発しており、我々は、TCS濃度を検証するためのシンプルで低コストな手順を示す。これらのメソッドは、トリクロサン毒性の明らかに成長している分野に役立つことがあります。同様に他の化学物質をテストするために、この脱顆粒アッセイを使用して、この議論では、我々は詳細のいくつかの考慮事項。

TCSは、有機溶媒を用いずに水性緩衝液中に直接作製し、濃度をUV-可視分光光度計（ 図1）によって確認した後、TCS（<30μM）の効果は、マスト細胞の脱顆粒（ 図2および図3）上に検討した、脱顆粒のためのβ-ヘキソサミニダーゼ、代理マーカーの存在を検出するために蛍光マイクロプレートアッセイを使用して。我々は、TCSが大幅β-hexosaの放出を抑制することができることを見出した直接、水性緩衝液中に、ここに示されている低いエタノールの濃度（0.24％体積/体積）2または、に溶解したときRBL肥満細胞からminidase。有機溶剤前述のことにより、我々は実際にTCSが0.24％エタノールに溶解させた我々の研究（容量/容量）を比較して、抗原誘発脱顆粒における減衰より顕著に参照してください。例えば、ここで我々はTCSが0.24％のエタノールに溶解し、10μMのために報告〜25％削減（0.76倍よりもはるかに大きい抗原誘発脱顆粒における> 50％削減（0.46倍±0.07）を、実証している±0.02）2。同じ静脈では、5μMで、TCSは、自然放出レベルに脱顆粒を抑制し、A23187-刺激された細胞のために決定され、この効果は我々の以前の、エタノールを利用し、研究2で10μMTCSまで実証されていませんでした。この矛盾のために2つの理由があります：どちらか0.24％エタノール車両2はアクティブマストCELを阻害するTCSの能力を減衰私たちが使用していたLの脱顆粒、またはTCSは（濃度が以前の研究2で紫外可視分光光度法により確認されていなかったので）予想よりも少ない濃縮した。肥満細胞脱顆粒のTCSの阻害のための分子標的については、その可能性カルシウム流入2のシグナル伝達カスケードの下流側のどこかに発生している。我々は早期のシグナル伝達事象を回避する脱顆粒刺激剤として、カルシウムイオノフォアA23187を使用し、TCSの抑制効果が持続し、脱顆粒経路におけるTCS阻害の標的可能性が高いカルシウム流入の上流に位置していないことを示す。我々は以前に、これらの細胞の膜波打ちも共通経路のターゲット2の可能性を示唆して、TCSの処理により抑制されることが示されている。

以前の研究ではTCSが280nmで最大ピークを有し、モル吸光係数は、このwavelenで4200 L /モル/ cmであると評価されたの吸光度スペクトルを発見したGTH 12（pK aを以下のpH値において）。なお、TCSを加熱して熱劣化57につながらないことが示されており、有機溶媒°C 56の助けを借りずに50まで加熱しながら、別の研究では、水にTCSを溶解するの成功を示している。任意の新しいテスト化学物質が使用される場合、水性緩衝液中の溶解度は、もちろん、注意深く考慮されなければならない。より長い期間にわたって加熱されると、これはTCSの劣化がないことを示唆している：我々はまた、TCSを加熱するとき、読み出しスペクトルの形状は、それが40〜90分（データは示さず）で加熱されているかどうかに影響されないことを見出した時間。ただし、そのTCSの溶解が40分以上90分で大きくなる。我々はまた、TCSが脱顆粒実験（データは示さず）の間、溶液から脱落しないことを確認した。

本研究で用いたDNP-BSA抗原およびカルシウムイオノフォア濃度は、抗原とイオノフォア用量反応アッセイに基づいて選択されたdは、代表図2及び図3中程度のレベルの脱顆粒を誘発するために選択した。抗原の用量反応アッセイの例は我々の以前の研究2の図1Aに見られる。 RBL-2H3細胞が時々可変機能ので、実験で使用する抗原又はイオノフォア濃度を決定するとき、それは、典型的には少なくとも2ヶ月覚醒剤用量応答実験を定期的に行う必要があることに注意することが重要である。希望の脱顆粒率をもたらす濃度は、細胞の年齢及び抗原/イオノフォア準備に応じて変えることができる。我々は、無機ヒ22と見てきたようにまた、絶対的な脱顆粒の割合は（抗原のレベルが使用される）RBL脱顆粒上の毒物の影響のレベルに影響を与えることができるので、毒物の用量応答は、いくつかの異なる抗原/イオノフォア濃度で行われる必要があります。最終conceを考慮することも重要です脱顆粒を62 DMSOの影響があるため、イオノフォアで脱顆粒を刺激DMSO車両のntration。私たちは、このプロトコルで使用されるDMSO濃度は脱顆粒、バックグラウンドの測定値、または0.2％トリトンX-100の値2には影響を与えません発見した。

多価抗原DNP-BSAおよびカルシウムイオノフォアA23187に加えて、RBL-2H3刺激のいくつかの他の方法が存在する。これらの方法の一つは、ケルセチン63と一緒に48/80、化合物への暴露を介して刺激である。我々は以前にTCSの露出2と一緒にテストされたもう一つは、抗IgE IgGでのIgEに結合した受容体の架橋である。他の多くの刺激方法が存在し、これらの方法の各々は、マスト細胞の脱顆粒の異なるメカニズムの態様に対処する。このプレートリーダーアッセイはさらにその有用性を拡大し、これらの代替刺激装置の多くで使用するために適合させることができる。

この脱顆粒プロトコルは哲、多種多様で使用する可能性を秘めているmicals。このアッセイを使用して、任意の被験物質の研究では、コントロールは次の場合に実行する必要があります背景に被験物質（無細胞）の測定値の（1）の効果;自発脱顆粒上の化学物質（2）効果（無IgEをもつ細胞、無抗原、無イオノフォア）;溶解細胞のトリトン-X-100の値（無抗原、無イオノフォア）上の化学物質（3）効果。これらのテストは簡単にプレートのレイアウトに加工することができる。以前は、私たちは、TCSがこれら3つのパラメータ2のいずれに影響を与えませんが見つかりました。さらに、テストはテスト化学などの付録パーマーらの補足データセクションの図S1に記載されて無細胞準備中のβ-ヘキソサミニダーゼ酵素/基質反応自体に干渉しないことを決定するために実行する必要があります。2私たちは、TCSが切断するβ-ヘキソサミニダーゼの能力蛍光基質4-MU 2と干渉しないことがわかった。使用される任意の溶媒の影響も考慮しなければならないこれらすべての対照実験である。例えば、我々はDMSO、イオノフォアための溶媒は、トリトン-X-100サンプル蛍光レベル（データは示していない）には影響を与えないことを確認した。我々はまた、我々は環境ホルモンビスフェノールAを含まないため、本研究で使用されているすべてのプラスチックを選択したことに注意して、残念なことに、しかし、現在市場に出回っているすべてのプラスチックは、おそらく潜在的にデータ64を混乱可能性が活動を中断するいくつかの内分泌を含んで行う。

トラブルシューティングが必要とされる場合には、このプロトコルのいくつかの潜在的な態様は、見直されるべきである。 （2）刺激剤および/または被験物質のいずれかと用量反応が観察されず、又は（3）例えば、（1）自然放出のレベルが（溶解値の約7％を超える）高すぎることであってもよい溶液中のTCS濃度（20μM未満）が低すぎる。最初のケースでは、高い自発レベルが長すぎるか、マイコプラズマで汚染されている文化の中でされた細胞の兆候かもしれませんので、2-20週の間の文化にされているRBL-2H3細胞でこれらの実験を試して、定期的にマイコプラズマのためのテスト。興奮剤の用量応答が観察されていない場合は、溶解した刺激剤濃度が低すぎることがあり、かつ在庫が作り直されるべきである。一例として、カルシウムイオノフォアは、典型的には、細心の注意と多くのボルテックスを必要とする、DMSOを用いて再構成されるように、薄膜として設けられている。さらに、別のロット番号を持つ新しいイオノフォアストックはロット間のばらつきに単に起因異なる効力を持つことができますので、顆粒の用量反応は、それぞれ新たに購入したイオノフォア在庫とお勧めします。また、与えられた被験物質との効果の欠如、この化学物質が効果を引き起こすために、長い潜伏期間を必要とするかもしれないことを示しているかもしれないことは注目に値する。あなたが溶液中で高いTCSの収量を達成していない場合は、顆粒はバッファに溶解している間、温度（50℃±5）一定していることを確認してください。 T彼は温度計はフラスコの底、溶液の温度の過大評価につながる位置に手を触れてはいけません。また、温度は最初、50℃に達するまで、そこに一定の激しく撹拌であり、90分のカウントダウンが開始されていないことを確認してください

トラブルシューティングについては、表。

問題

潜在的な理由

ソリューション

TCS株式は<20μMであると判断された

液の不均一加熱

温度計は、それが溶液中に懸濁し、フラスコの底に触れていないように配置されていることを確認する。

攪拌が十分に活発ではない

フラスコの外にジャンプするための解決策を生じさせることなく、活発である攪拌のレベルを達成するために攪拌プレート上に磁気攪拌を増やします。適切なサイズの磁気撹拌棒が使用されていることを確認します。

分光光度計の問題

UVランプの適切なウォームアップ（通常は10分）を可能に、または必要に応じて電球を交換してください。

自発的な脱顆粒レベル（>〜7％）が高すぎる

細胞は培養液中であまりにも多くの時間のために異常な遺伝子変異を獲得した

新しい細胞融解を用いた実験を行います。

細胞があるため機械的剪断の死んでいる

バッファや治療接着細胞を追加する場合は、マイクロウェルの側面に慎重にこれらのボリュームを追加することによって、細胞を乱さないように注意してください。 Combitipを使用して練習します。

のIgE / DNP-BSAが自発リリース·レベル以上のβ-ヘキソサミニダーゼの放出を引き起こすことはありません

IgEが30日以上経過しているか、雪解けを凍結するために施されている

IgEの新しい、適切に保存された分量を使用します。

DNP-BSAが正しく混合されていません

慎重に円錐管とtにDNP-BSAの少量を追加してください徹底的にoが渦。

A23187イオノフォアは、自発的なリリース·レベル以上のβ-ヘキソサミニダーゼの放出を引き起こすことはありません

A23187株式が正しく再構成されていません

製品は、 "薄膜"と到着し、ケアとはるかにボルテックスで再構成されなければならない。転送は、ストレージ用の新しい1.5 mlチューブに株式を再構成。

A23187株式が正しく格納されていない

株式市場は、光に敏感です。一度再構成された、パラフィルム上、およびストアは-20℃でホイルに包まれた株式の保管についての質問がある場合は、破棄して新しい株式でテストを開始します。

A23187イオノフォアの180 Nmは誘発しない以前のアッセイで見られるような相対的な脱顆粒応答の同じレベル、

A23187イオノフォアのロット間のばらつき

イオノフォアのそれぞれの新しい多くの線量応答実験を行います。また、同一ロットからの在庫が再構成プロセスでの潜在的な変動性のために、テストされることをお勧めします。

どんな毒物/薬理学実験のように、被験物質は、試験濃度であからさまに有毒であってはならない。我々は、原形質膜（例えば乳酸脱水素酵素の漏れなど）への一般的な損害に対してアポトーシスと壊死の両方のためのテスト、個別に、または組み合わせ（例えばクローン原性アッセイと同様に）、同様にテストするメソッドを使用することをお勧めします。 TCSは、本研究で示した濃度で、RBL-2H3細胞2に細胞毒性はありません。イオノフォアの研究と関心の特に注目すべきはそのイオノフォアプラスイオノフォア車です（おそらくDMSO）に加え、被験物質に加え、使用されるすべての有機溶媒は、パーマーらで行われように慎重に、制御されなければならない潜在的に細胞毒性醸造、可能性があります。2

有機溶媒を使用せずにTCS溶液を調製するための我々のプロトコルは、溶媒アーティファクト、水生毒性で特に重要な検討事項との干渉なしに、このユビキタス化学物質のさらなる毒性試験のために有用であろう。これらの方法はまた、TCSの濃度の検証を可能にするソリューションや、TCSなどの化学物質は、マスト細胞の脱顆粒に与える影響の定量化した。このプロトコルは、例えば、薬品55を破壊することが疑われる内分泌ように、マスト細胞の脱顆粒上に多種多様な化学物質の効果を評価するために使用することができ、潜在的にハイスループットスクリーニングのためにスケールアップすることができる。さらに、他の肥満細胞タイプは将来作業では、このアッセイにおいて使用することができる。

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Disclosures

我々は、開示することは何もありません。

Acknowledgments

LMWとRHKは生物医学科学と工学（GSBSE）のUMaine大学院によってサポートされています; RHKもメイン農業＆森林試験場によってサポートされていました。追加資金は、一般医科学研究所（NIH P20-GM103423）、メイン州農業＆フォレスト実験ステーション（グラント番号ME08004-10、JAG）、メインADVANCEライジングタイドセンター（NSFグラント＃1008498）大学によって提供されました、とPhRMAの基礎（JAG）から薬理/毒性の研究スターターグラント。私たちは、博士に感謝します。抗原およびセルのデイビッドHolowkaとバーバラベアード。我々は、機器と注文のヘルプのためのひなハシミ、アレハンドロベレス、とアンドリューAbovianに感謝しています。これは、メイン州農業＆森林試験場公開番号3311です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RBL-2H3 Cells

 ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

 Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

 Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

 Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

 Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

 Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

 Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

 Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

 J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

 VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

 Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

 J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

 Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

 Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

 EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

 Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

 Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

 Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

 Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

 VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

 Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

 Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

 VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

 VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

 VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

 VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

 VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

 Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

 BioTek

Module S

Hematocytometer

 Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

 VWR

97042-634

Centrifuge

 Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

 VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

 The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

 ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

 VWR

Range: P2-P1000

Balance

 Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

 Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

 Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

 Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Acetate Buffer, pH 4.4

 Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

 Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

 26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

 135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

 Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
Plastic material used:

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

 VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

 VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

 VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

 VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

 N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

 Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

 Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

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References

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RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響
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Weatherly, L. M., Kennedy, R. H.,… More

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

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