Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Microplade Assay til vurdering af kemiske Virkninger på RBL-2H3 mastcelledegranulering: Effekter af Triclosan uden brug af et organisk opløsningsmiddel

Published: November 1, 2013 doi: 10.3791/50671
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono
* These authors contributed equally

Summary

Mastcelledegranulering, frigivelse af allergiske mediatorer, er vigtig i allergi, astma og parasit forsvar. Her viser vi teknikker 1. til vurdering effekter af narkotika og giftstoffer på degranulering, metodologi for nylig udnyttet til at udstille den magtfulde hæmmende effekt af antibakterielt middel triclosan 2..

Abstract

Mastceller spiller vigtige roller i allergisk sygdom og immun forsvar mod parasitter. Når aktiveret (fx ved et allergen), de degranulate, en proces, der resulterer i exocytose af allergiske mediatorer. Modulation af mastcelledegranulering af narkotika og giftstoffer kan have positive eller negative virkninger på menneskers sundhed. Mastcelle funktionen er dissekeret i detaljer med anvendelsen af rotte basofile leukæmi mastceller (RBL-2H3), en bredt accepteret model for humane slimhinde mastceller 3-5. Mastcelle granula komponent og den allergiske mediator β-hexosaminidase, som frigives lineært i tandem med histamin fra mastceller 6, nemt og pålideligt kan måles ved reaktion med et fluorogent substrat, gav målelig fluorescensintensitet i en mikroplade assay, der er modtagelig for high-throughput undersøgelser 1.. Oprindeligt udgivet af NAAL et al. 1., har vi tilpasset denne degranulering assay for screening of narkotika og giftstoffer, og demonstrerer dens anvendelse her.

Triclosan er et bredspektret antibakterielt middel, der er til stede i mange forbrugerprodukter og har vist sig at være en terapeutisk støtte i human allergisk hudsygdom 7-11, selvom mekanismen for denne virkning er ukendt. Her viser vi et assay for effekten af ​​triclosan på mastcelledegranulering. Vi har for nylig vist, at triclosan kraftigt påvirker mastcelle funktion 2. I et forsøg på at undgå brugen af et organisk opløsningsmiddel, er triclosan opløses direkte i vandig puffer med varme og omrøring, og resulterende koncentration bekræftes ved hjælp af UV-Vis spektrofotometri (hjælp ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Denne protokol har potentialet til at blive brugt med en række kemikalier til at bestemme deres virkninger på mastcelledegranulering, og mere generelt, deres allergiske potentiale.

Introduction

Mastceller er stærkt granulerede immuneffektorceller der tjener som centrale mediatorer ved astma, allergi, parasitter forsvar og cancerogenitetsundersøgelser 13-16. De bor i næsten alle vaskulariseret væv 15, hvor de sikkert gemme allergiske og inflammatoriske mediatorer i cytoplasmatiske granula indtil aktiveres for at degranulate. Degranulering er exocytose af membranbundne granulat, hvilket resulterer i frigivelsen af farmakologisk aktive mediatorer, såsom histamin, tryptase, og leukotriener 15.. Denne proces resulterer i indledningen af type I overfølsomhedsreaktioner, der er kritiske i montering forsvar mod parasitter samt indlede allergiske, astmatiske og kræftfremkaldende reaktioner 15..

Mastceller og basofile udtrykker FcsRl receptorer, de høj affinitet receptorer for immunglobulin E (IgE) 17. Udsættelse for et allergen eller antigen forårsager aggregering af multiple IgE-bundet FcERI receptorer 17, og det er dette so-kaldet "tværbinding" af IgE-bundne Fc-receptorer som igangsætter degranulation processen: en kaskade af tyrosinphosphorylering begivenheder, aktivering af phospholipase C, udstrømningen af calcium fra interne butikker, og calcium-influx i cellen 18. Denne calciumindløb er nødvendig for degranulering, og endvidere signalerer granulat fusion med membranen, før forårsager granulat exocytose 15. Eksperimentelt kan et calciumionophor anvendes til shuttle calcium direkte over cellemembranen 19, som i det væsentlige omgår alle signaltransduktion skridt før calciumindløb trin 20, der giver mulighed for identifikation af en sti målet ved en giftstof som værende opstrøms eller nedstrøms calcium signalering 20..

Degranulering kan måles hurtigt og effektivt ved at overvåge frigivelse af β-hexosaminidasens i celle supernatant, som frigives lineært fra granulatet sammen histamin 6, men jegs meget lettere at detektere ved hjælp af en simpel enzym-substrat reaktion og en mikropladelæser til assay fluorescerende produkt. Denne mikroplade assay som beskrevet i protokollen afsnit er baseret på en robust metode oprindeligt blev udviklet af NAAL et al. 1, som kvantificerer spaltning af det fluorogene substrat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide ved β- hexosaminidase. Vi har ændret analysen til test effekter af lægemidler og giftstoffer, med triclosan fremhævet her. Denne metode pålideligt kvantificerer degranulering, er et billigt alternativ til, for eksempel flow-cytometrisk-baserede detekteringsmetoder 21, og har potentiale til at egner sig pænt til high-throughput screening af en lang række anti-allergi medicin, samt immuntoksiske eller allergifremkaldende kemikalier. Dette sidste punkt er især vigtigt i lyset af 2007-National Research Council rapport "toksicitetstestning i det 21. århundrede: en vision og en Strattegi "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), der går ind for udviklingen af højt gennemløb toksikologiske tests, der anvender cellekultur at reducere bekostelig brug af traditionelle forsøgsdyr såsom mus. Degranuleringen protokol udviklet af NAAL et al. 1 og modificeret af os 2, udnytter RBL-2H3-cellelinien, som er et godt accepteret model homolog til humane slimhinde mastceller eller basofiler 3-5. (Fremgangsmåder til dyrkning RBL-2H3 celler er beskrevet i Hutchinson et al. 22). Dette assay kan sandsynligvis tilpasses enhver vedlagte mast celletype.

Triclosan (TCS) er et bredspektret antimikrobielt der har været brugt i mere end 30 år på hospitaler, personlig pleje, og forbrugsgoder 23,24. Virkningsmekanismen for FKS s antimikrobielle kendetegn er hæmning af fedtsyrer biosyntesen, sandsynligvis ved at hæmme enoyl-acylbærerprotein reduktase 25,26. Det findes i hele verden i en bred vifte af forbrugerprodukter såsom shower gel, hånd lotion, tandpasta, mundskyl, og håndsæber i koncentrationer op til 0,3% eller 10 mM 24.. Udbredt brug af FKS har resulteret i påviselige niveauer i mennesker 27-29 samt i floder og vandløb 30. En undersøgelse udført af Allmyr et al. 27. påvist, at TCS og dets metabolitter er til stede i både plasma og mælk fra ammende mødre. Vigtigst er TCS let absorberes i huden 31-37. Queckenberg et al. 37. fundet ~ 10% absorption af en ~ 70 mM TCS fløde i menneskers hud inden 12 timer, hvilket resulterer i betydelig koncentration i huden, hvor mastceller bor.

FKS har vist klinisk at styre human allergisk hudsygdom 7-11, men den mekanisme, hvormed TCS lindrer allergiske hudsygdomme har været ukendt 38. Anvendelse af fluorescerende mikroplade assay detailed i denne video, vi for nylig påvist, at FKS, ved koncentrationer så lave som 2 uM, væsentligt dæmper mast celle funktion og degranulering, som udgør en potentiel forklaring på disse kliniske data 2. Ud over at give en forklaring på disse kliniske data. Vores resultater i Palmer et al 2 tyder på, at TCS mål signalmolekyler nedstrøms for calciumindløb. På grund af vigtigheden af ​​calcium signalering i mange immunologiske og andre biologiske processer, kunne TCS potentielt have negative virkninger på en lang række af de nødvendige biologiske processer. Faktisk viste Udoji et al. 39. at FKS undertrykker menneskets naturlige dræberceller celle lytisk aktivitet, en anden vigtig medfødte immunforsvar.

Beyond sit potentiale som en terapeutisk hjælp i allergisk sygdom (eller omvendt, som immunotoxicant), kan FKS også være hormonforstyrrende 40-49. Således er en klar procedure om, hvordan man forbereder denne kemiske i opløsning is af interesse for toksikologer. Fordi TCS er en lille hydrofob molekyle anvendes organiske køretøjer ofte bruges til at gøre det mere opløseligt i vand. I de fleste toksicitetsundersøgelser hvor FKS er blevet testet, har forberedelse involveret opløsning i vand ved hjælp af et organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, acetone, eller olie 2,50,51. Men ofte gange disse opløsningsmidler er biologisk aktive selv, og derved komplicerer fortolkningen af teststoffet data 51.. Faktisk. Ifølge Rufli m.fl. 52 og andre 53, anbefales det at afprøve løsninger på akvatiske toksicitet eksperimenter fremstilles ved hjælp af fysiske metoder løbet kemiske metoder, på grund af muligheden af kemiske opløsningsmidler til at skabe toksicitet artefakter. Vi har tidligere vist, at FKS opløst i 0,24% ethanol / vand (vol / vol) og sonikeret i 30 min dæmper RBL mastcelledegranulering 2. Ethanol ved højere koncentrationer end 0,24% har vist sig at dæmpe mastcelle nedbrydningennulation 54,55-eksempler på de potentielt forstyrrende virkninger af organiske opløsningsmidler på toksicitetsundersøgelser.

Ikke alene er det vigtigt at overveje effekten af ​​opløsningsmidler på organisme eller celler, der anvendes for at studere, men også det er vigtigt at overvåge effekten af ​​et opløsningsmiddel på testkemikaliet selv. For eksempel Skaare et al. 51 syntes at opløse FKS i polyethylenglycol (almindeligvis findes i tandpasta og mundskyl) svækket anti-bakteriel og anti-plak effekter i raske kvindelige kvinder, mens opløsning i olier forårsagede en fuldstændig tab af funktion. Derfor, at evnen af ​​forskellige opløsningsmidler modulere giftstof og narkotika, herunder FKS, bør virkninger tages i betragtning i assay design. Anvendelse af olier eller smagsstoffer kan forstyrre virkningen af FKS i forskellige produkter 50,51.

I et forsøg på at eliminere behovet for at anvende organiske opløsningsmidler, forbedrede vi ved vores metode til opløsning af TCS 2 ved at eliminere brugen af en organisk sollufte. I den nuværende protokol, opløses vi FKS granulat direkte i vandig buffer med varme (≤ 50 ° C), og derefter kontrollere koncentrationen af ​​dette TCS lager ved UV-Vis spektrofotometri. Disse forbedringer er mulige, fordi TCS er opløseligt i vand op til 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ), og har vist sig at modstå nedbrydning, når det opvarmes til 50 ° C ( http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Vi har også den ekstra fordel af UV-Vis spektrofotometri, som TCS også er kendt for at kraftigt absorberer ved 280 nm 58 med en molær ekstinktionskoefficient på 4.200 L / mol / cm 12.

Denne protokol giver en enkel, men effektiv måde at opløse FKS granulat i en buffer uden hjælp af et organisk opløsningsmiddel, herunder lave omkostninger og hurtig kontrolkoncentration, beskriver og en kraftig fluorescerende mikroplade assay til overvågning kemiske virkninger på mastcelledegranulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk at alle buffer opskrifter indgår i en tabel i slutningen af protokollens tekst.

Dag 1:

1.. Fremstilling af celler

  1. Planlægge ud 96-brønds plade setup ordningen centrering prøver på layoutet for at undgå kantvirkninger. Allocate tre gentagelser for hver FKS koncentration testet (± degranulering stimulans af antigen eller ionophor), samt triplikater for spontan frigivelse (ingen degranulering stimulerende), maksimal frigivelse (0,2% Triton X-100 [TX] vaskemiddel lysis), samt brønde forbeholdt baggrundsprøve (som vil indeholde nogen celler). For hver gentagelse eksperimentel dag vælge en ny randomiseret layout af FKS prøvernes koncentrationer.
  2. Varm RBL medier (opskrift tilvejebragt i tabellen) og trypsin i 37 ° C vandbad.
  3. Tjek RBL celler i T-25 kolbe (2-4 dage siden sidste passage og mindre end 3-4 måneder, da de blev optøet) for generelle tegn på god helbredeth: rette pH markeret med farve af medier, og manglende uklarhed. Kolben anbringes under et lysmikroskop for at bekræfte, at kolben er fri for forurening og at cellerne synes sund, korrekt sammenflydende, og for det meste fastgjort. Bemærk, at celler skal kontrolleres for forurening med mycoplasma cirka hver sjette uge 22..
Behandling Triplikater
Stimuleres, 0 uM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Stimuleres, 0.001 uM TCS F6, G6, H6
Stimuleres, 0,1 uM TCS A4, B4, C4
Stimuleres, 1 uM TCS A6, B6, C6
Stimuleres, 5 uM TCS F5, G5 H5
Stimuleres, 10 uM TCS A3, B3, C3
Stimuleres, 15 uM TCS A5, B5, C5
Stimuleres, 20 uM TCS F7, G7, H7
Stimuleres, plus højeste [TCS] F3, G3, H3
Spontan, No TCS (omfatter håner) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, nr. TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Ingen Celler, baggrund, plus højeste [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

Figur 1
Klik her for at se større billede .

  1. Tag RBL celle kolben til sterile vævskultur (TC) hætte. Cellerne er knyttet til botTom af kolben. Arbejde under TC hætte og ved hjælp af standard steril teknik Fjern alle medier fra kolbe med steril pipette, cellerne forbliver fastgjort til bunden af ​​kolben. Dernæst skylles kolben med 2 ml trypsin, så kassere denne vask.
  2. Tilføj nøjagtigt 2 ml trypsin at dække bunden af ​​kolben. Sat i 37 ° C inkubator i 5 minutter for at tillade cellerne at løsne sig fra bunden af ​​kolben.
  3. Efter 5 minutter, ramte siden af ​​kolben med en åben håndflade at løsne cellerne. Straks, tilsættes 18 ml RBL medier for at vaske cellerne fra kolben og at slukke trypsin. Umiddelbart tager celle-media-trypsin blanding af kolben og overføre til en ny, steril 50 ml rør (det samlede volumen i denne tube er nu 20 ml).
  4. Efter blanding forsigtigt, men grundigt, fjernes 50 pi cellesuspension fra dette rør, og overføres til en 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør, hvilket er en prøve, der skal tælles. Tag denne prøve, samt 50 ml0, rør indeholdende celle-media-trypsin blanding ud af TC hood til stationære.
  5. Spin 50 ml rør i centrifuge (med passende balance) i 8 min ved 500 xg, denne kraft pellets celler effektivt.
  6. Under spin tid tæl cellerne i prøven, der blev isoleret før spinding. For at gøre dette, skal du først tilsættes 50 ul trypan blåt farvestof til 50 pi celler i 1,5 ml rør og forsigtigt, men grundigt pipettér op og ned 5x at blande. Straks, overføres 10 ul af denne blanding til glasset hematocytometer og tælle celler i gitteret området efter fabrikantens anvisninger. Grev mindst 100 celler til fornuftige statistiske resultater.
  7. Tilbage i TC hætte, fjerne supernatant fra celler, der blev spundet ned.
  8. Cap celle røret, og svirp pellet i bunden af ​​røret for at løsne cellerne.
  9. Tilføj medier til trypsinerede celler til opnåelse af en densitet på 0,5 x 10 6 celler / ml, baseret på celletallet. Bland godt, men forsigtigt, for at holde celler suspenderet under klædningen procedure. En Pipetman, satte 100 ul celler / brønd i en plade med 96 brønde (flad, sort bund), efter pladen skabelon ark. Tilfældig hvordan celler tilsættes til brøndene for at undgå systematiske fejl og blandes efter hvert sæt af tre brønde tilsættes. Vær sikker på ikke at sætte celler i brøndene mærket til baggrunden prøver.
  10. Når alle celler er blevet overført, skal du placere pladen låget på pladen, og overførsel til inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2) natten over. Ryd op efter standard steril teknik.

DAG 2:

2.. Fremstilling af Triclosan

  1. Anvendelse af et måleglas, foranstaltning 250 ml Tyrodes buffer (opskrift tilvejebragt i tabel) i en 500 ml Erlenmeyer kolbe mærket "TCS-puffer." Add omrører. Brug glasvarer, røre bar, termometer, der er udpeget til brug med TCS alene.
  2. Også på dette tidspunkt, foranstaltning 250ml Tyrodes i en separat 500 ml Erlenmeyerkolbe, mærket "kontrol buffer." Use glasvarer, røre bar, termometer, som IKKE er udpeget til FKS. Tilføj røre baren.
  3. Afvejes 0,0022 g FKS granulat og overføre til "TCS-buffer" kolbe (som indeholder 250 ml Tyrodes Buffer). For effektivt overføre granulat til Erlenmeyerkolbe bruge 10 ml af de målte 250 ml Tyrodes at vaske veje båd, at sikre alle FKS er blevet overført.
  4. Place "TCS-buffer" kolbe på en kombination kogeplade / magnetomrører, og sæt den til at røre ved en manageably høj hastighed. Når godt blandet, vil dette TCS bestand nominelt være 30 uM (faktiske koncentration vil blive beregnet efter opvarmning). (Har alle blanding i et stinkskab.)
    1. Også på dette tidspunkt, skal du placere "kontrol buffer" kolbe (der ikke indeholder TCS) på en anden kombination kogeplade / magnetomrører, og sæt den til at røre ved en lignende hastighed.
  5. Tænd UV / Vis lampe til at varme op lampen til senere brug.
  6. Varm "TCS-buffer"-løsning til 50 ° C under konstant omrøring. Når op til temperatur, tid til 90 min. Under 90 min, fortsat overvåge 50 ° C temperatur og passende omrøringshastighed hyppigt.
    1. Samtidig opvarmes "kontrol buffer" opløsning (som er blot 250 ml almindelig Tyrodes buffer) til 50 ° C under kontinuerlig omrøring. Efter at have nået 50 ° C, tid til 90 minutter, i hvilket tidsrum temperaturen (holde ved 50 ° C) og omrøring er begge overvåges.
  7. Ved slutningen af ​​90 min, tage begge erlenmeyerkolber off kogeplader og overførsel til stationære.
  8. Brug af bølgelængde scanning på et UV / Vis spektrofotometer, blank maskinen på 1 ml af opvarmede "kontrol buffer" løsning før scanning 1 ml opvarmet "TCS-buffer" løsning. Kontrollér formen af ​​spektret, end rekord Absorbans værdi ved 280 nm. At bestemme koncentrationen, skal du bruge Beer-Lambert ligning (A 280 = ε 280 ℓ c) ved hjælp af en ε 280 4200 L / mol / cm 12 og ℓ på 1 cm.
  9. Efter bestemmelse af TCS koncentration, tilsættes 0,249 g bovint serumalbumin (BSA) til den resterende 249 ml af "TCS-buffer" løsning, og bland godt.
    1. Samtidig tilsættes 0,249 g BSA til den resterende 249 ml "kontrol buffer" løsning, og bland godt.

DAG 2:

3.. Antigenstimuleret Degranulering Assay Brug RBL-2H3 celler

  1. Før du starter, skal du kontrollere pH alle buffere, der anvendes, og sikre, at de er klare og ikke uklar: Dette omfatter Tyrodes buffer, natriumacetatbuffer, og glycin carbonat buffer (opskrifter findes i tabellen).
  2. Varm RBL medier og trypsin i 37 ° C vandbad.
  3. Gør BT (1 mg / ml0, BSA i Tyrode buffer): 0,05 g BSA + 50 ml Tyrode buffer (X2). Sat i 37 ° C vandbad.
  4. Gør 0,2% Triton X-100: 3,136 ml BT + 64 pi 10% Triton X-100 (slutkoncentration af Triton X-100 er 0,2%). Bland godt ved at vende, men ikke vortex. Sat i 37 ° C vandbad.
  5. Start forberedelse af FKS og opvarmede Tyrodes buffer (trin "2" ovenfor) Bemærk:. Ikke starte det næste skridt (IgE eksponering), indtil "TCS-buffer" og "kontrol buffer"-løsninger nå op på 50 ° C og omrøres i den første 70 min af 90 min varme / omrøring tid.
  6. Når begge opløsninger er blevet omrørt ved 50 ° C i 70 min, udgør 0,1 ug / ml anti-DNP muse IgE (Sigma) i RBL medier til prøvebrønde at blive sensibiliseret (100 ul / brønd). IgE materiel, bør ikke være ældre end 30 dage, når de opbevares ved 4 ° C, registrere, hvor gammel bestanden er. Svirp for at blande, men ikke vortex IgE.
  7. Under en TC hætte,tilføje 0,6 ul IgE lager (bestand er 1 mg / ml) til 6 ml RBL medier i et 50 ml rør. I en anden 50 ml rør, tilsættes 6 ml af glatte RBL medier kun (som er beregnet til nonsensitized prøver).
  8. Dumpe alle medier fra 96-brønds plade (som blev fremstillet på dag 1) i vasken, og bringe pladen under TC hætte.
  9. Tilfældigt tilføje 100 ul media / IgE blanding til brønde, der bør fremmes (48 brønde i alt). Denne blanding er ikke beregnet til "spontan", "TX" og "baggrundsviden" prøver.
  10. Tilfældigt tilføje 100 ul plain RBL medier kun til "TX", "spontan" og "baggrundsviden" brønde.
  11. Sæt plade låg på plade, og derefter flytte pladen i 5% CO 2/37 ° C inkubator i 1 time.
  12. I løbet af 1 times inkubation følge trin 3,13-3,24.
  13. På benchtop, forberede antigen fortyndinger. Tilføj 0,53 pi 1,6 mg / ml stamopløsning DNP-BSA + 850 pi & #160, BT at få et antigen koncentration på 1 ug / ml. Vortex og vend denne bestand for at blande.
  14. Once "TCS-buffer" og "kontrol buffer" er blevet opvarmet og derefter omrøres i 90 minutter ved 50 ° C, fortsætte med resten af ​​forberedelserne til TCS-protokollen (gå til trin 2.6 - 2.8.1). Efter BSA opløses i begge opløsninger, fortsætte nedenfor.
  15. Påbegynde forberedelsen af ​​eksponering buffere med ± Ag, ± TCS. Først fra 249 ml prøve af "FKS-puffer" opløsning (der allerede er opvarmet og omrørt i 90 minutter), overføres 50 ml til en ny 50 ml konisk rør. Fjerne 20 ul af denne 50 ml prøve og erstatte det med 20 ul af 1 ug / ml antigen forberedt tidligere for en endelig antigen koncentration på 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex og vend.
    1. Label denne "Tube 1, High TCS / + Ag / + BT." Det bruges til fortyndinger og højeste TCS koncentration eksponering.
    2. Fra 249 ml prøve af "kontrol puffer" opløsning, overføres 50 ml til en ny 50 ml rør. Fjerne 20 ul af denne nye 50-ml prøve og erstatte med 20 ul af 1 ug / ml antigen forberedt tidligere for en endelig antigen koncentration på 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex og vend.
      1. Label denne "Tube 2, No TCS / + Ag / + BT". Bruges til FKS fortyndinger og 0 uM TCS koncentration eksponering.
    3. Nu tage 50 ml "TCS-buffer" løsning og sat ind i en anden 50 ml rør. Fjern 20 ul af denne nye 50-ml prøve og erstatte det med 20 ul plain BT. Vortex og vend. Intet antigen tilsættes.
      1. Mærk denne "Tube 3, High TCS / No Ag / + BT." Dette bruges til baggrund.
    4. Overfør 50 ml af "kontrol buffer" løsning til en anden 50 ml rør. Tag 20 ul af dette ne w 50 ml alikvot og erstatte det med 20 ul plain BT. Vortex og vend. (Ingen Ag tilsættes.)
      1. Mærk denne "Tube 4, No TCS / Nej Ag / + BT." Dette bruges til baggrund og spontane prøver.
    BSA TCS Antigen
    Tube 1 Afkrydsning Høj [] Afkrydsning
    Rør 2 Afkrydsning NO Afkrydsning
    Tube 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Høj [] NO
    Tube 4 Afkrydsning NO NO
    1. Beregn og registrere mængder for fortyndinger efter bestemmelse af koncentrationen af ​​"TCS-buffer" lager. Samlet volumen for hver fortynding koncentration bør være 1 ml og bør være forberedt i et sterilt mikrocentrifugerør. Bruge kalibreret P2 og P1000 Pipetman.
    Koncentration High Triclosan + Tyrodes + BSA 0,0004 mg / ml Ag
    (Glas 1 fra oven)     		Opvarmet BT 0,0004 ug / ml Ag
    (Tube 2 fra oven)
    20 uM
    10 uM
    5 uM
    1 uM
    0,1 uM
    0,001 pM
    0 uM (toppen af ​​pladen) ----------------------- 500 pi plus en anden 500 pi
    0 uM (bunden af ​​pladen) ----------------------- 500 pi plus en anden 500 pi
    1. Efter 1-hr IgE inkubation tage pladen ud af inkubatoren og kaste alle medier i vasken. (Bemærk: Hvis testkemikalier er kendt for at være mere toksisk end forbrugeren produkt FKS, kan farligt affald være nødvendig.)
    2. Ved hjælp af en Combitip, tilfældigt vaske celler i 96-brønds plade med BSA-Tyrode buffer (200gl / brønd). Slip vaskebufferen på siderne af brøndene, snarere end direkte på de vedhæftede celler, for at undgå at forstyrre de bundne celler. Gentag processen en gang til.
    3. At forberede behandlinger til anvendelse, vortex og vend fortyndinger lige før tilsætning til pladen.
    4. Startende med den øverste del af pladen: Tilfældigt tilføje triplikater af 200 pi hver af de antigen-løsninger (med korrekte koncentrationer af TCS) til de tilsvarende brønde. Fortsæt med at bunden af ​​pladen. Tilføj "kontrol buffer" løsning plus Ag (fra "Tube 2" ovenfor) til alle "spotter" på pladen.
    5. Tilføj 200 pi passende løsninger til tilsvarende brønde:
      1. Tilsæt 200 pi 0,2% Triton X-100 i "TX"-udpegede brønde.
      2. Dernæst tilsættes 200 pi Tube 3 til 3 brønde mærket "Baggrund (bgrd)-Højeste FKS" på pladen.
      3. Endelig tilsættes 200 ulaf Tube 4 til 6 brønde mærket "Spontan".
    6. Inkubér pladen i 1 time i 37 ° C / 5% CO2.
    7. I løbet af 1 times inkubation: Få to spande is (en for "gamle" plade i inkubator og en for ny plade). Tø 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-p-D-glucosaminide (4-MU) ved stuetemperatur i op til 40 minutter, holde i folien, da det er lysfølsomt.
      1. Når 4-MU bestand er optøet, udgør 4-MU brugsopløsning: 150 ul lager + 14,85 ml kold acetatbuffer (opskrift angivet i tabel), vortex og vend. Opbevares i 50 ml centrifugerør, indpakket i folie og på is indtil brug.
      2. Brug Combitip tilfældigt tilsættes 100 ul kold 4-MU brugsopløsning ind i selve bunden af ​​hver brønd i en ny Grenier sort 96-brønds plade (på isspand # 2). Start først ved tilsætning arbejdsopløsningen tilfældigt inden toppen af ​​pladen, tilfældigt inden bunden af ​​pladen, tilfældigt inden Triton X-100 brønde,og endelig tilfældigt indenfor baggrund brønde.
      3. Komme ud ny kasse med P200 tips til næste trin.
    8. Ved afslutningen af ​​1-times inkubation, sætte celle plade fra inkubatoren på is bucket # 1, pipette supernatanten op og ned 4-5x (forsigtigt, ikke indfører bobler), går rundt godt for god blanding, men rører ikke cellerne under blanding . Systematisk, tegne 25 ul prøve fra hver brønd og anbringes i den nye plade med substrat (samme bestilling af prøver, som oprindeligt planlagt ud). Pipetteres op og ned for at blande prøven grundigt, når ny brønd, uden at indføre bobler.
    9. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C / 5% CO2.
    10. Efter 30 minutters inkubation tilsættes tilfældigt 200 pi kold glycin-carbonatpuffer per brønd (med Combitip) for at udfylde huller op til 325 pi total. (Gør dette over Triton X-100 prøver sidst, for at undgå Triton X-100 spillover). Check for bobler, før læsning plade (poke med rent P10 pipettete tip til pop eventuelle bobler).
    11. Kør pladen i fluorescenspladelæser (gå til afsnit 4).

    DAG 2:

    4.. Fluorescerende pladelæser Instruktioner og Dataanalyse

    1. Åbn Gen5 program og åbent eksperiment sektion.
    2. Tænd pladelæser og sæt plade (øverste venstre hjørne er A1).
    3. Protokol Arrow Procedure Arrow Læs for at angive brugerdefinerede målinger. Må ikke tilføje noget om prøver replikater, osv., for at indsamle rå fluorescens data fra hver brønd.
    4. Under "Læs", vælg "fluorescens", "Endpoint", "Normal Speed", "Gain 40", "Excitation 360/40", "Emission 460/40," Optik position: Top 50%. Top optisk offset: 7mm.. Ingen shake, ingen forsinkelse, ingen kinetik, ingen monitor godt, temperatur: inkubator slukket.
    5. Vælg mat sort bund, 96-brønds plade (Grenier 96 brønde, flad bund).
    6. Deal med pladen layout: Protokol Arrow plade layout. Opsæt prøver uden angivelse gentagelser, fortyndinger mv
    7. Tallerken Arrow læse.
    8. Gem fil: Klik på "Excel" knappen, som vil eksportere data fil til Excel. Gør dette for pladelayout og matrix. Gem filen på computeren og på et USB-drev.
    9. I Excel, trække den gennemsnitlige baggrunden læsning fra hver prøve, herunder Triton X-100 brønde.
    10. Beregn relative% degranulering ved at dividere hver værdi (allerede have havde baggrund fratrukket) med den gennemsnitlige Triton X-100 værdi og derefter gange med 100 for at gøre det til en procentdel.
    11. Gennemsnitlig alt triplikater, og beregne standardafvigelse. Graph data i Excel som middelværdier ± standardafvigelse. For statistisk test, flyt nu Prism software ved GraphPad.

    DAG 2:

    5.. Ionofor Stimuleret Degranulering Assay Brug RBL-2H3 celler

    1. Følg protokol for "Forberedelse af celler" (§ 1, Dag 1) og "Forberedelse af triclosan" (§ 2, dag 2), som anvist ovenfor. Pladen layout eksempel for ionofor stimulation er vist nedenfor.
    Behandling Triplikater
    Stimuleres, 0 uM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
    Stimuleres, 0.001 uM TCS F6, G6, H6
    Stimuleres, 0,01 uM TCS F3, G3, H3
    Stimuleres, 0,1 uM TCS A4, B4, C4
    Stimuleres, 1 uM TCS A6, B6, C6
    Stimuleres, 5 uM [TCS F5, G5 H5
    Stimuleres, 10 uM TCS A3, B3, C3
    Stimuleres, 15 uM TCS A5, B5, C5
    Stimuleres, 20 uM TCS F7, G7, H7
    Spontan med DMSO, ingen TCS (omfatter håner) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
    TX-100, med DMSO, ingen TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
    Ingen celler baggrund, med DMSO plus højeste [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

    Figur 1 Klik her for at se større billede .

    1. Før du starter, skal du kontrollere pH alle buffere, der anvendes, og sikre, at de er klare og ikke uklar. Tyrode, natriumacetatbuffer, og glycin carbonatpuffer (opskrifter findes i tabellen).
    2. Forbered en 50 ml konisk rør BT ved tilsætning 0,05 g BSA til 50 ml Tyrodes puffer og ved hvirvelbehandling at blande godt. Inkuber i 37 ° C vandbad.
    3. Gør 0,2% Triton X-100 med 0,0032% DMSO (endelig calciumionophor køretøj koncentration) ved tilsætning 96 pi 10% Triton X-100 til 4,704 ml BT. Bland godt. Dernæst tager ud 0.155 ul af denne opløsning og kassér. Nu tilføje tilbage i 0,155 pi 100% DMSO.
    4. Der fremstilles en 5 mM stamopløsning (2,5 mg / ml) af A23187 ionofor fra pulver ved tilsætning 400 pi frisk 100% DMSO i ionoforen hætteglasset og vortex at blande. Når du er i opløsning,overføres til en 1,5 ml konisk rør, optage indhold, og dags dato og udløbsdato (3 måneder fra præparat, når der er gemt korrekt ved -20 ° C).
      1. Alternativt, hvis bruger en frossen bestand i dag, tø på is, og kontroller, at 5 mM A23187 ionophor er godt blandet og klar. Vortex, svirp, og vend denne bestand før brug. Record dato for forberedelse og Lot # af denne A23187.
    5. Once "TCS-buffer" og "kontrol buffer" er blevet opvarmet og omrørt i 90 min, fortsætter resten af ​​forberedelsen til TCS-protokollen (gå til trin 2.6-2.8.1). Efter BSA er godt blandet ind i begge løsninger, fortsætte med de resterende protokoltrin.
    6. Fra 249 ml prøve af "FKS-puffer" opløsning, overføres 50 ml til en ny 50 ml konisk rør. Fjern 1,8 ul af 50 ml prøve og tilsættes 1,8 pi 5 mM ionofor lager. Vortex 3x for 8 sek og vend 3x. Final ionophore koncentrationen er 180 Nm. Bemærk, at denne koncentration af A23187 vil variere afhængigt af lager potens, og en A23187 ionophor dosis-respons anbefales at identificere en koncentration af A23187, der fremkalder en degranulering niveau på omkring 20% ​​maksimal frigivelse, der er blevet identificeret som en ikke-cytotoksisk for RBL-2H3 celler ved cytotoksicitetsassay (se 2).
      1. Label denne "Tube 1, High TCS / + ionophor / + BT." Bruges til fortyndinger og højeste TCS koncentration eksponering.
    7. Fra 249 ml prøve af "kontrol puffer" opløsning, overføres 50 ml til en ny 50 ml konisk rør. Tag 1,8 ul af 50 ml prøve og tilføje tilbage i 1,8 pi 5 mM ionofor lager. Vortex 3x for 8 sek og vend 3x. Final ionophore koncentrationen er 180 nm.
      1. Label denne "Tube 2, No TCS / + ionophore / + BT." Dette bruges til fortyndinger og 0 uM TCS koncentrationer.
    8. Fra 249 ml prøve af R 20, TCS-buffer "løsning, overføres 50 ml til en ny 50 ml konisk rør. Tag 1,8 ul af nye 50 ml prøve og tilsættes 1,8 pi 100% DMSO. Vortex 3x for 8 sek og vend 3x, ingen ionoforen er tilføjet.
      1. Label denne "Tube 3, High TCS / No ionophor / + BT / + DMSO" bruges til baggrund.
    9. Fra 249 ml prøve af "kontrol puffer" opløsning, overføres 50 ml til en ny 50 ml konisk rør. Tag 1,8 gl fra de nye 50 ml prøve, og der tilsættes 1,8 pi 100% DMSO. Vortex 3x for 8 sek og vend 3x. Ingen ionophor tilsættes.
      1. Label denne "Tube 4, No TCS / No ionophor / + BT / + DMSO" bruges til spontan frigivelse prøver.
    BSA TCS Ionoforen Tilsat 100% DMSO
    Tube 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Høj [] Afkrydsning NO
    Rør 2 Afkrydsning NO Afkrydsning NO
    Tube 3 Afkrydsning Høj [] NO Afkrydsning
    Tube 4 Afkrydsning NO NO eck mark "fo: content-width =" .1 i "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/>
    1. Beregn og registrere mængder for fortyndinger efter bestemmelse af koncentrationen af ​​"TCS-buffer" lager. Bruge kalibreret P2 og P1000 Pipetman. Samlet volumen for hver fortynding koncentration bør være 1 ml, og bør være forberedt i et sterilt mikrocentrifugerør:
    <td>
    Koncentration Høj Triclosan + Tyrode + BSA +180 nM A23187 (Glas 1 fra oven) Opvarmet BT +180 nM A23187 (Tube 2 fra oven)
    20 uM
    15 uM
    10 uM
    5 uM
    1 uM
    0,1 uM
    0,001 pM
    0 uM (toppen af ​​pladen) ---------------------------------- 500 pi plus en anden 500 pi
    0 uM (bunden af ​​pladen) ---------------------------------- 500 pi plus en anden 500 pi
    1. Tag cellerne forgyldt går ud af kuvøsen, og tomme medier i vasken. Ved hjælp af en Combitip, tilfældigt vaske celler i 96-brønds plade med BT (200 gl / brønd). Gentag vask en anden gang.
    2. At forberede behandlinger til anvendelse, vortex og vend fortyndinger lige før tilsætning til pladen. Startende med den øverste del af pladen: Tilfældigt tilføje triplikater på 200 ul af hver af den korrekte koncentration af FKS til corresponde godt. Fortsæt med at bunden af ​​pladen. Tilføj "kontrol buffer" løsning plus A23187 (fra "Tube 2" ovenfor) til alle "spotter" på pladen.
    3. Tilføj 200 pi passende løsninger til tilsvarende brønde:
      1. Tilsæt 200 pi 0,2% Triton X-100 i "TX"-udpegede brønde.
      2. Dernæst tilsættes 200 pi Tube 3 til 3 brønde mærket "Baggrund (bgrd)-Højeste FKS" på pladen.
      3. Endelig tilsættes 200 ul Tube 4 til seks brønde mærket "Spontan".
    4. Inkubér pladen i 1 time i 37 ° C / 5% CO2.
    5. Under 1 times inkubation: Få to spande is (en for "gamle" plade i inkubator og en for ny plade). Tø 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-p-D-glucosaminide (4-MU) ved stuetemperatur i op til 40 minutter, holde i folien, da det er lysfølsomt.
      1. Når 4-MU bestand er optøet, udgør 4-MU arbejder solutipå: 150 pi lager + 14,85 ml kold acetatbuffer (opskrift givet i tabel), vortex og vend. Opbevares i 50 ml centrifugerør, indpakket i folie og på is indtil brug.
      2. Brug Combitip tilfældigt tilsættes 100 ul kold 4-MU brugsopløsning ind i selve bunden af ​​hver brønd i en ny Grenier sort 96-brønds plade (på isspand # 2): starter først ved at tilsætte arbejdsopløsningen tilfældigt inden for toppen af plade, tilfældigt inden bunden af ​​pladen, tilfældigt inden Triton X-100 brønde, og endelig tilfældigt indenfor baggrund brønde.
      3. Komme ud ny kasse med P200 tips til næste trin.
    6. Ved udgangen af ​​1.-timers inkubation sætte celle pladen fra inkubatoren på isspand # 1, pipette supernatant op og ned 4-5x (blidt, ikke indføre bobler), der går rundt i godt for god opblanding, men rører ikke celler, mens blande . Systematisk, tegne 25 ul prøve fra hver brønd og anbringes i den nye plade med substrat (samme ordning af samples, som oprindeligt planlagt ud). Pipetteres op og ned for at blande prøven grundigt, når ny brønd, uden at indføre bobler.
    7. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C / 5% CO2.
    8. Efter 30 min inkubation tilsættes tilfældigt 200 pi kold glycin-carbonatbuffer per brønd (ved hjælp Combitip) for at udfylde brønde op til 325 pi alt (gør dette over Triton X-100 prøver sidste, for at undgå Triton X-100 spillover). Check for bobler før læsning plade (poke med rent P10 pipette tip til pop eventuelle bobler).
    9. Kør pladen i fluorescenspladelæser (Følg alle trin i afsnit 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når det opvarmes til 50 ° C i 90 min, UV-Vis absorbansspektrum for FKS frembringer en stærk, jævn kurve mellem ~ 260 og 300 nm, med en top ved 280 nm, som vist i figur 1. UV-Vis spektrofotometri er derfor et vigtigt redskab, der kan anvendes til at beregne koncentrationen, da den offentliggjorte molære absorptionskoefficient ved 280 nm er 4,200 l / mol / cm 12. Vi har konstateret, at FKS ikke falder ud af opløsning i løbet af tidsrammen for hele degranulering eksperimentet, efter 50 ° C varme (data ikke vist).

Efter at bruge denne opvarmningsmetode at opløse FKS direkte i vandig puffer, undersøgte vi virkningen af FKS på mastcelledegranulering hjælp af en fluorescens-baseret assay, der blev optimeret fra NAAL et al. 1. Dette assay registrerer niveauet af β-hexosaminidase frigivet fra masten celler efter en times inkubation ved at registrere et fluorogent substrat produkt. Hvorvidt stimuleret til degranulate af DNP-BSA-antigen (fig. 2) eller calcium-A23187 (figur 3), kan man tydeligt se, at FKS forårsager en signifikant dosis-responsiv hæmning af frigivelsen af β-hexosaminidase (dvs. degranulering).

Figur 2 er repræsentativ for resultater opnået for IgE-sensibiliserede RBL-celler, som blev inkuberet i 1 time i "TCS-puffer" eller "kontrol puffer" og udsat for en DNP-BSA-antigen dosis på 0,0004 mg / ml. Denne koncentration af DNP-BSA fremkaldte en gennemsnitlig absolut degranulation respons på 22,5% ± 0,1 (gennemsnit ± standardafvigelse) i fravær af FKS. Statistisk signifikant hæmning af degranulering begyndte på 5 uM, hvor degranulering niveauer var 0,79 gange ± 0,05 (middel ± SD) af 0 pM TCS kontrolniveauer. Da FKS-koncentrationen stiger, er der en større dæmpende virkning af FKS, der viser en stærk dosis respons-forhold. TCS, ved 20 uM, almost helt ophæver den degranulering reaktion, til et niveau omtrent lig med spontan degranulering (hvor intet antigen er til stede). Samlet viser denne figur stærke hæmning af multivalent antigen-stimuleret mastcelledegranulering grund koncentration-verified FKS, uden brug af organiske opløsningsmidler.

I figur 3, blev kalcium A23187 bruges som en måde at undersøge mekanismen for FKS-induceret afdæmpning af degranulering i RBL mastceller. A23187 anvendes som et alternativ stimulerende fordi det omgår den FcsRl tværbinding og andre signaleringsbegivenheder opstrøms for calciumindløb, men stadig forårsager degranulering. RBL mastceller blev inkuberet i 1 time i "TCS-puffer" eller "kontrol puffer," indeholdende en calciumionophor dosis på 180 nM. I fravær af FKS, fremkaldte denne koncentration af A23187 en gennemsnitlig absolut degranulering respons på 25,1% ± 4,7 (middelværdi ± standardafvigelse). Inhibering af degranulering varfundet med så lidt som 1 um TCS (0,63 ± 0,11 [middel ± SD]). Da TCS koncentration stiger, så sværhedsgraden af ​​hæmning: ved 5 uM,-0.21 fold ± 0,04 af de 0 pM FKS kontrol niveauer ved 10 uM, 0,09 ± 0,05, ved 15 uM, 0,077 ± 0,006, og ved 20 pm , 0,09 ± 0,02 (middel ± SD). Faktisk, fra 5 uM og højere koncentrationer af FKS niveauer af A23187-induceret degranulering fundet at være nær niveauet af spontan kontrol (hvor ingen A23187 er til stede på alle). Samlet figur 3, i kombination med figur 2, viser, at de molekylære begivenheder, der retter af FKS er sandsynlige nedstrøms calciumindløb.

Figur 1
Figur 1:. Repræsentant TCS UV-Vis absorbansspektrum TCS har en robust ærtk ved 280 nm, tillader let bestemmelse af A280, samt giver mulighed for at bruge den molære ekstinktionskoefficient på 4.200 l / mol / cm 12 at bestemme den faktiske koncentration af FKS opløst i Tyrodes puffer. Den gule linje viser toppen ved 280 nm. I dette eksempel er absorbansen værdi på 280 nm 0,11876, hvilket indikerer en TCS koncentration på 28,28 uM. Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2:. Et repræsentativt degranulation respons af IgE-sensibiliserede RBL mastceller eksponeret for 0,0004 mg / ml DNP-BSA antigen og TCS (0-20 uM) En spontan release værdi (ingen antigen til stede) er afbildet som reference. Værdier repræsenterer betyde7, standardafvigelse af tredobbelte prøver. Som det fremgår, er data normaliseret til kontrol (0 uM TCS) og signifikante forskelle blev bestemt i Prism software med en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey s post-hoc test (sammenligninger til 0,001 uM TCS gennemsnitlige respons). Betydning er repræsenteret ved *** p <0,001. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3:. Et repræsentativt degranulering reaktion af RBL mast celler stimuleret med 180 nM A23187 calciumionophor i nærvær af FKS (0-20 uM) En spontan frigivelse prøve (ingen ionophor stede) er afbildet som reference. Værdier repræsenterer middel ± standardafvigelse af tredobbelte prøver. Som presented, er data normaliseret til kontrol (0 uM TCS) og signifikante forskelle blev bestemt i Prism software med en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey s post-hoc test (sammenligninger til 0,001 uM TCS gennemsnitlige respons). Betydning er repræsenteret ved *** p <0,001; ** p <0,01. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I 2004 udviklede NAAL et al. 1 a mast celle biosensor til high-throughput test af degranulering. Det er en robust analyse, som vi har tilpasset til vores FKS studier og udførligt beskrevet i denne video. Forud for NAAL et al. 1. assay havde mastcelledegranulering rutinemæssigt blevet vurderet via β-hexosaminidase 59-61, men disse tidlige metoder udnyttes fluorometre, hvor en prøve blev læst på et tidspunkt. Vigtigere er det, NAAL et al. etableret direkte overensstemmelse mellem deres mere high-throughput anvendes en mikropladeaflæser og den tidligere metode, hvor prøverne blev læst én på-en-tid i et fluorometer. I summen, i høj grad NAAL et al. 1. forbedret hastighed, kraft, enkelthed og pålidelighed af analysen ved at tilpasse den til en high-throughput mikroplade-platform, samt ved at indarbejde flere ændringer i arbejdsprocessen. Her har vi yderligere tilpasset dette assay til en undersøgelse af forskellige test kemikalier, navnlig, her, Den allestedsnærværende stof FKS. Den video beskriver de trin i denne meget nyttige assay. Derudover har vi også udviklet en organisk opløsningsmiddel-fri metode til at anvende FKS i vandig buffer, og vi viser en enkel, billig procedure til at kontrollere TCS koncentration. Disse metoder bør være en hjælp til den tilsyneladende voksende inden for triclosan toksikologi. I denne diskussion, detalje vi flere overvejelser for at bruge denne degranulation assay til at teste andre kemikalier som godt.

TCS blev fremstillet direkte i vandig puffer uden hjælp af organiske opløsningsmidler, blev koncentrationen kontrolleret ved UV-Vis spektrofotometri (figur 1), og derefter virkningen af FKS (<30 uM) blev undersøgt på mastcelledegranulering (fig. 2 og 3) ved hjælp af en fluorescens mikroplade-assay til påvisning af tilstedeværelsen af ​​β-hexosaminidase, en surrogatmarkør for degranulering. Vi har fundet, at TCS er i stand til markant dæmpe frigivelsen af ​​β-hexosaminidase fra RBL mastceller når de opløses i en lav koncentration af ethanol (0,24% vol / vol) 2 eller, som afbildet her, direkte i vandig buffer. Ved at afstå organisk opløsningsmiddel, vi faktisk ser mere udtalt dæmpning i antigen-induceret degranulering sammenlignet vores undersøgelser, hvor FKS blev opløst i 0,24% ethanol (vol / vol). For eksempel har vi her har påvist en> 50% reduktion i antigen-induceret degranulering (0,46-fold ± 0,07), som er meget større end ~ 25% reduktion vi rapporteret til 10 uM FKS opløst i 0,24% ethanol (0,76-fold ± 0,02) 2. I samme ånd, bestemmes vi for A23187-stimulerede celler, der ved 5 uM, TCS hæmmer degranulation til spontan frigivelse niveauer; denne effekt ikke blev påvist indtil 10 uM TCS i vores tidligere, ethanol-udnytte, studie 2. Der er to mulige årsager til denne uoverensstemmelse: enten en 0,24% ethanol køretøj 2 dæmper TCS evne til at hæmme aktiv mast cell degranulering eller TCS vi brugte var mindre koncentreret end forventet (siden koncentrationer ikke var kontrolleret af UV-Vis spektrofotometri i den tidligere undersøgelse 2). Vedrørende det molekylære mål for FKS inhibering af mastcelledegranulering, er det sandsynligt forekommer et sted i signaltransduktionskaskade nedstrøms for calciumindløb 2. Vi brugte calcium A23187 som et degranulation stimulans til at omgå tidlige signalering begivenheder og TCS er hæmmende virkning varet, hvilket indikerer, at målet for FKS hæmning i degranulation pathway ikke er sandsynligt placeret opstrøms for calciumindløb. Vi har tidligere vist, at membranen ruffling af disse celler også er undertrykt på grund af FKS behandling, hvilket antyder muligheden for en fælles vej målet 2.

Tidligere undersøgelser har fundet absorbansspektret FKS har en maksimal peak ved 280 nm, og en molær absorptionskoefficient blev vurderet til at være 4200 L / mol / cm på dette wavelenGTH (ved pH-værdier under pK a) 12. Det har vist sig, at opvarmning af FKS ikke fører til termisk nedbrydning 57, og en anden undersøgelse har vist succes at opløse FKS i vand, mens det opvarmes til 50 ° C uden hjælp af et organisk opløsningsmiddel 56. Når en ny test kemikalie anvendes, dets opløselighed i vandig buffer selvfølgelig skal overvejes nøje. Vi har også fundet, at når opvarmning TCS, formen af ​​den spektrale udlæsning er upåvirket hvorvidt det opvarmes i 40-90 minutter (data ikke vist): dette tyder på en mangel på nedbrydning af FKS når det opvarmes i en længere periode tid. Bemærk dog, at TCS opløsningen er større på 90 min end 40 min. Vi har også bekræftet, at FKS ikke falder ud af opløsning til varigheden af ​​degranulering eksperimentet (data ikke vist).

DNP-BSA antigen og calciumionophor koncentrationer anvendt i denne undersøgelse blev valgt på grundlag af antigen-og ionophor-dosis-respons analyser end blev udvalgt til at fremkalde moderate degranulering grænseværdier for de repræsentative figur 2 og 3. Et eksempel på et antigen dosis-respons-assay kan ses i figur 1A af vores tidligere arbejde 2.. Ved fastsættelsen af ​​antigen eller ionoforen koncentration skal bruges i dit eksperiment, er det vigtigt at være opmærksom på, at stimulerende dosis-respons forsøg skal gøres med jævne mellemrum, typisk mindst hver anden måned, da RBL-2H3 celler undertiden fungerer trinløst. Den koncentration, der giver den ønskede degranulering procentdel kan variere afhængigt af alder af cellerne og på antigenet / ionofor forberedelse. Også, som vi har set med uorganisk arsenite 22 kan absolut degranuleringen procenter (niveauer af antigen, der anvendes) påvirker niveauet af giftstoffet indvirkning på RBL degranulation, så giftstof dosis-respons bør gøres på flere forskellige antigen / ionoforen koncentrationer. Det er også vigtigt at overveje den endelige koncentration DMSO køretøjet, når stimulere degranulering med ionophor, da degranulering er påvirket af DMSO 62.. Vi har fundet DMSO koncentrationer anvendt i denne protokol påvirker ikke degranulation, baggrund aflæsninger, eller 0,2% Triton X-100 værdier 2.

Ud over det multivalente antigen DNP-BSA og calcium A23187, findes der flere andre metoder RBL-2H3 stimulation. En af disse metoder er stimulation via eksponering for sammensatte 48/80 sammen med quercetin 63.. En anden er tværbinding af IgE-bundne receptorer med et anti-IgE-IgG, som vi tidligere testet sammen med FKS eksponering 2. Mange andre stimuleringsmetoder findes, og hver af disse metoder vedrører en anden mekanistisk aspekt af mastcelledegranulering. Denne pladelæser assay kan tilpasses til anvendelse med mange af disse alternative stimulatorer, yderligere udvide sin nytte.

Denne degranulering protokol har potentialet til at blive anvendt med en bred vifte af chemicals. I en undersøgelse af eventuelle teststoffet ved hjælp af denne analyse skal der udføres kontrol for følgende: (1) virkningen af ​​teststoffet på baggrund (ingen celler) aflæsninger, (2) effekten af ​​kemikaliet på spontane degranulation (celler uden IgE , uden antigen, ingen ionophor), (3) virkningen af ​​kemikaliet på Triton-X-100 værdier af lyserede celler (intet antigen, ingen ionofor). Disse tests kan let arbejdes ind i pladen layout. Tidligere fandt vi TCS påvirker ingen af disse tre parametre 2. Derudover bør prøverne køres at fastslå, at teststoffet ikke interfererer med β-hexosaminidase enzym / substrat reaktion selv i et cellefrit præparat, som beskrevet i figur S1 af tillæg A supplerende datadelen Palmer et al. 2 Vi fandt, at FKS ikke interfererer med evnen af β-hexosaminidasens at spalte det fluorogene substrat 4-MU 2. Virkninger af alle brugte opløsningsmidler skal også tages i betragtningi alle disse kontrolforsøg. For eksempel, bekræftede vi, at DMSO, opløsningsmidlet for ionofor, har ingen virkning på Triton-X-100 prøve niveauer af fluorescens (data ikke vist). Vi kan også konstatere, at vi valgt alle plastmaterialer anvendt i denne undersøgelse for ikke indeholder hormonforstyrrende bisphenol A, desværre, selvom, alle plast på markedet i øjeblikket sandsynligvis gøre indeholde en vis hormonforstyrrende effekt, der potentielt kan forvirre data 64..

I tilfælde af at fejlfinding er nødvendig, bør flere potentielle aspekter af denne protokol revideres. For eksempel kan det være, at (1) spontan frigivelse niveauet er for højt (større end ~ 7% af lysis værdier), (2) en dosis-respons med enten stimulerende og / eller testkemikalie ikke overholdes, eller (3) TCS koncentrationen i opløsningen er for lav (lavere end 20 uM). I det første tilfælde kunne en høj spontan niveau være en indikation af cellerne er i kultur for længe eller bliver forurenet med mycoplasma, og derfor, Så prøv disse eksperimenter med RBL-2H3 celler, der har været i kultur mellem 2-20 uger, og regelmæssigt teste for mycoplasma. Hvis en stimulans dosis-respons ikke overholdes, kan det opløste stimulerende koncentrationen være for lav, og bestande bør genskabt. Som et eksempel, typisk calciumionophor er tilvejebragt som en tynd film, der skal rekonstitueres med DMSO, der kræver opmærksomhed og meget omhvirvling. Derudover kan en ny ionophore bestand med et andet lotnummer har en anden styrke simpelthen på grund af parti-til-parti variation og derfor er en degranulation dosis-respons anbefales med hvert nyindkøbt ionophore lager. Det er også værd at bemærke, at en tilsyneladende mangel på effekt med en given test kemikalie kunne være en indikation af, at kemikaliet kan kræve en længere inkubationstid for at have en effekt. Hvis du ikke er at opnå en høj TCS udbytte i opløsning, kontrollere, at temperaturen har været konstant (50 ° C ± 5), mens granulatet er i opløsning i buffer. Than termometer bør aldrig røre bunden af ​​kolben, en position, der ville resultere i en overvurdering af temperaturen af ​​opløsningen. Sørg også for, at der er konstant kraftig omrøring, og at 90 min nedtælling ikke er startet, før temperaturen først har nået 50 ° C.

Tabel til fejlfinding.

Problem

Potentiel Årsag

Opløsning

TCS bestand bestemt til at være <20 uM

Uensartet opvarmning af opløsningen

Sikre, at termometeret er placeret, så det er suspenderet i opløsningen, og ikke rører bunden af ​​kolben.

Omrøring er ikke tilstrækkelig kraftig

Forøg magnetomroering på stir-plade til at opnå et niveau af omrøring, som er kraftig uden at forårsage den løsning at springe ud af kolben. Sikre, at en passende størrelse magnetisk omrørerstav anvendes.

Problemer med spektrofotometer

Muliggøre korrekt warmup af UV-lampe (typisk 10 min), eller udskift pæren, hvis nødvendigt.

Spontane degranulering niveauet er for højt (> ~ 7%)

Celler har erhvervet unormal genetiske mutationer på grund af for megen tid i kultur

Udføre eksperimenter med en ny celle tø.

Celler dør på grund af mekanisk forskydning

Når du tilføjer buffer eller behandlinger adhærente celler, være forsigtig med ikke at forstyrre cellerne, ved at tilføje disse mængder omhyggeligt til siderne af mikrobrøndene. Øv bruge Combitip.

IgE / DNP-BSA ikke forårsager frigivelsen af ​​beta-hexosaminidasens løbet spontane frigivelse niveauer

IgE er ældre end 30 dage eller har været udsat for at fryse tø

Brug en ny, korrekt opbevaret portion af IgE.

DNP-BSA ikke er blevet korrekt blandet

Vær sikker på at tilsættes forsigtigt den lille mængde DNP-BSA til den koniske rør og to vortex grundigt.

A23187 ionophor ikke forårsager frigivelsen af ​​beta-hexosaminidasens løbet spontane frigivelse niveauer

A23187 materiel ikke er blevet korrekt rekonstitueret

Produktet kommer som en "tynd film", og skal rekonstitueres med omhu og meget vortexing. Overførsel rekonstitueret lager til en ny 1,5-ml rør til opbevaring.

A23187 bestand er ikke blevet korrekt opbevaret

Lagrene er lysfølsomt. Efter rekonstituering Parafilm toppen, og opbevar pakket i folie ved -20 ° C. Hvis der er et spørgsmål om opbevaring af en bestand, kasseres og begynde tests med en ny bestand.

180 nM A23187 ionophor fremkalder ikkedet samme niveau af relativ degranulering svar, som findes i en tidligere analyse

Lot-til-lot variation af A23187 ionophor

Udfør en dosis respons eksperiment for hvert nyt lot ionofor. Det anbefales også, at aktier fra samme parti skal testes, på grund af potentielle variabilitet i rekonstituering processen.

Som i enhver toksikologi / farmakologi eksperiment, må testkemikaliet ikke være åbenlyst toksiske ved de testede koncentrationer. Vi anbefaler anvendelse af fremgangsmåder, der tester for både apoptose og nekrose, enten enkeltvis eller kombineret (såsom med klonogene assays), samt tests for generel skade til plasmamembranen (såsom lactatdehydrogenase lækage). TCS ved koncentrationer er vist i denne undersøgelse, ikke er cytotoksisk for RBL-2H3 celler 2. En særlig bemærkning til bekymring med ionophoren undersøgelser er, at ionophor plus ionophore køretøj(Sandsynligvis DMSO), plus testkemikalie, plus eventuelle anvendte organiske opløsningsmidler, kan være en potentielt cytotoksisk bryg, som skal kontrolleres omhyggeligt, som det gøres i Palmer et al. 2

Vores protokol for at forberede FKS-løsninger uden brug af et organisk opløsningsmiddel, vil være nyttig for yderligere toksikologisk afprøvning af denne allestedsnærværende kemiske, uden indblanding fra opløsningsmidler artefakter, en særlig vigtig overvejelse i akvatisk toksikologi. Disse metoder tillader også kontrol af koncentrationen af FKS i opløsning og kvantificering af de effekter, kemikalier, såsom TCS, har på mastcelledegranulering. Denne protokol kan bruges til at vurdere virkningerne af en bred vifte af kemikalier på mastcelledegranulering, såsom mistanke hormonforstyrrende stoffer 55, og potentielt kan skaleres op til high throughput screening. Endvidere kan andre mast celletyper anvendes i dette assay i det fremtidige arbejde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

LMW og RHK understøttes af UMaine Graduate School of Biomedical Science and Engineering (GSBSE) RHK blev også støttet af Maine Agricultural & Forest Experiment Station. Yderligere finansiering blev leveret af National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), Maine Agricultural & Forest Experiment Station (Grant Number ME08004-10, JAG), University of Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1.008.498) og en Research Starter Grant i Farmakologi / toksikologi fra PhRMA Foundation (JAG). Vi takker Drs. David Holowka og Barbara Baird for antigenet og celler. Vi er taknemmelige for Hina Hashmi, Alejandro Velez, og Andrew Abovian om hjælp med udstyr og ordrer. Dette er Maine Agricultural & Forest Experiment Station publikation nummer 3311.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RBL-2H3 Cells

 ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

 Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

 Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

 Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

 Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

 Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

 Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

 Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

 J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

 VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

 Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

 J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

 Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

 Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

 EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

 Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

 Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

 Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

 Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

 VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

 Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

 Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

 VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

 VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

 VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

 VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

 VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

 Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

 BioTek

Module S

Hematocytometer

 Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

 VWR

97042-634

Centrifuge

 Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

 VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

 The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

 ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

 VWR

Range: P2-P1000

Balance

 Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

 Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

 Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

 Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Acetate Buffer, pH 4.4

 Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

 Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

 26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

 135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

 Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
Plastic material used:

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

 VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

 VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

 VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

 VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

 N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

 Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

 Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861 (1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937 (2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

Tags

Immunologi mast celle basofil degranulation RBL-2H3 triclosan Irgasan antibakterielle β-hexosaminidase allergi astma giftstoffer ionofor antigen fluorescens mikroplade UV-Vis
En Microplade Assay til vurdering af kemiske Virkninger på RBL-2H3 mastcelledegranulering: Effekter af Triclosan uden brug af et organisk opløsningsmiddel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H.,… More

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter