Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Microplate Assay å vurdere Kjemiske Effekter på RBL-2H3 Mast Cell degranulation: Effekter av Triklosan uten bruk av et organisk løsemiddel

Published: November 1, 2013 doi: 10.3791/50671
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono
* These authors contributed equally

Summary

Mastcelle degranulering, frigjøring av allergiske mediatorer, er viktig ved allergi, astma, og parasitt forsvar. Her kan vi demonstrere teknikker en for å vurdere effekter av legemidler og giftstoffer på degranulation, metodikk nylig brukt til å stille den kraftige hemmende effekten av antibakterielt middel triklosan to.

Abstract

Mastceller spiller viktige roller i allergisk sykdom og immunforsvar mot parasitter. Når aktivert (for eksempel ved et allergen), de degranulate, en prosess som resulterer i exocytosis av allergiske meklere. Modulering av mast celle degranulation av narkotika og giftstoffer kan ha positive eller negative effekter på menneskers helse. Mastcelle funksjonen har blitt dissekert i detalj ved bruk av rotte-basofile leukemi mastceller (RBL-2H3), et allment akseptert modell av humane mukosale mastceller 3-5. Mastcelle granule komponent og den allergiske mediator β-hexosaminidase, som frigjøres lineært i tandem med histamin fra mastceller 6, kan enkelt og pålitelig måles gjennom omsetning med et Fluorogenic substrat, hvilket ga målbar fluorescensintensiteten i en mikroplate assay som er mottagelig for høy gjennomstrømming studier en. Opprinnelig publisert av Naal et al. Ett har vi bearbeidet degranulering denne analysen for screening of narkotika og giftstoffer og demonstrere bruken her.

Triklosan er et bredspektret antibakterielt middel som er til stede i mange forbrukerprodukter og har blitt funnet å være et terapeutisk hjelpemiddel i human allergisk hudsykdom 7-11, selv om mekanismen for denne virkning er ikke kjent. Her vi vise et assay for effekten av triklosan på mastcelle degranulering. Vi har nylig viste at triklosan sterkt påvirker mast celle funksjon to. I et forsøk på å unngå bruk av et organisk løsningsmiddel, er triclosan oppløst direkte i vandig buffer under oppvarmning og omrøring, og resulterende konsentrasjon er bekreftet ved hjelp av UV-vis spektrofotometri (ved hjelp ε 280 = 4200 l / M / cm) 12. Denne protokollen har potensiale til å bli brukt med en rekke kjemikalier for å bestemme deres virkninger på mastcelle degranulering, samt mer generelt, deres allergisk potensiale.

Introduction

Mast celler er svært kornete immun effektorceller som fungerer som viktige mediatorer i astma, allergier, parasitt forsvar og kreftutvikling 13-16. De bor i nesten alle vaskularisert vev 15, hvor de trygt lagre allergiske og inflammatoriske mediatorer i cytoplasma granulater før aktiveres for å degranulate. Degranulation er exocytosis av membran-bundet granulat, noe som resulterer i utgivelsen av farmakologisk aktive mediatorer som histamin, tryptase, og leukotriener 15. Denne prosessen resulterer i initiering av type I hypersensitivitetsreaksjoner som er kritiske i montering forsvar mot parasitter samt initiere allergiske, astmatiske, og kreftfremkallende svar 15.

Mastceller og basofile uttrykke FcεRI reseptorer, high-affinitet reseptorer for immunoglobulin E (IgE) 17. Eksponering for et allergen eller antigen forårsaker aggregering av flere IgE-bundet FcεRI reseptorer 17, og det er denne so-kalt "tverrbinding" av IgE-bundet Fc-reseptorer som initierer degranuleringsprosessen: en kaskade av hendelser tyrosinfosforylering, aktivering av fosfolipase C, effluks av kalsium fra interne lagre, og tilførsel av kalsium inn i cellen 18.. Denne kalsiuminnstrømningen er nødvendig for degranulering, og, videre, signaliserer granule fusjon med membranen før forårsaker granule exocytose 15.. Eksperimentelt kan en kalsium ionofor brukes til transport kalsium direkte over cellemembranen 19, som i det vesentlige omgår alle signaltransduksjon trinn før kalsiuminnstrømningen trinn 20, slik at for identifisering av en sti målet ved et toksisk middel som å være oppstrøms eller nedstrøms kalsium signalisering 20.

Degranulering kan måles raskt og effektivt ved å overvåke frigjøringen av β-hexosaminidase inn i celle supernatant, som frigjøres lineært fra granulene sammen histamin 6, men jegs mye lettere å detektere ved hjelp av et enkelt enzym-substrat reaksjon og en mikroplateleser til analysen den fluorescerende produkt. Denne mikroplate assay, som beskrevet i protokollen delen, er basert på en robust metode som opprinnelig ble utviklet av Naal et al. 1, som kvantifiserer spalting av Fluorogenic substrat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid ved β- hexosaminidase. Vi har endret analysen å teste effekter av legemidler og giftstoffer, med triklosan uthevet her. Denne metoden pålitelig kvantifiserer degranulation, er et billig alternativ til, for eksempel, flowcytometrisk-baserte metoder for påvisning 21, og har potensial til å låne seg pent til high-throughput screening av et bredt spekter av anti-allergi medisiner, samt immuntoksisk eller allergifremkallende kjemikalier. Dette siste punktet er særlig viktig i lys av 2007 National Research Council rapporten "Toxicity Testing i det 21. århundre: En visjon og en Strategy "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), som tar til orde for utvikling av high-throughput toksikologi tester som utnytter cellekultur for å redusere kostbare bruk av tradisjonelle forsøksdyr som mus. Den degranulering protokoll utviklet av Naal et al. Ett og modifisert av oss 2, benytter de RBL-2H3-cellelinjen, som er en godt akseptert modell homologt til human mukosale mastceller eller basofiler 3-5. (Metoder for dyrking RBL-2H3 celler er beskrevet i Hutchinson et al. 22). Denne analysen kan sannsynligvis tilpasses enhver vedlagte mast celletype.

Triklosan (TCS) er et bredspektret antimikrobiell som har vært brukt i mer enn 30 år i sykehus, personlig pleie, og forbruksvarer 23,24. Virkningsmekanismen for TCS sin antimikrobielle egenskaper er hemming av fettsyrer biosyntese, sannsynligvis ved å hemme enoyl-acylcarrier protein reduktase 25,26. Det er funnet over hele verden i et bredt spekter av forbrukerprodukter som dusjsåpe, håndkrem, tannkrem, munnvann, og i hånden såper ved konsentrasjoner opp til 0,3% eller 10 mm 24. Utbredt bruk av TCS har resultert i påvisbare nivåer hos mennesker 27-29 og i elver og bekker 30. En studie gjort av Allmyr et al. 27. demonstrert at TCS og dets metabolitter er til stede i både plasma og melk fra ammende mødre. Viktigere er TCS lett absorberes inn i huden 31-37. Queckenberg et al. 37. funnet ~ 10% absorpsjon av en ~ 70 mm TCS krem i menneskelig hud innen 12 timer, noe som resulterer i betydelig konsentrasjon i huden, hvor mastceller bor.

TCS har vist seg klinisk for å behandle human allergisk hudsykdom 7-11, men mekanismen ved hvilken TCS lindrer allergiske hudsykdommer har vært ukjent 38.. Ved hjelp av den fluorescerende microplate analysen detailed i denne videoen, vi nylig demonstrert at TCS, ved konsentrasjoner så lavt som 2 mikrometer, betydelig demper mast celle funksjon og degranulation, som gir en mulig forklaring på disse kliniske data to. I tillegg til å gi en forklaring på disse kliniske data, våre funn i Palmer et al. 2 tyder på at TCS mål signalmolekyler nedstrøms av kalsium tilstrømningen. På grunn av viktigheten av kalsium signalering i mange immunologiske og andre biologiske prosesser, kan TCS potensielt ha negative effekter på et stort utvalg av biologiske prosesser som er nødvendige. Faktisk viste Udoji et al. 39 som TCS undertrykker menneskets naturlige killer celle lytisk aktivitet, en annen viktig medfødte immunforsvar.

Utover sitt potensial som et terapeutisk hjelpemiddel i allergisk hudsykdom (eller omvendt, som en immunotoxicant), kan TCS også være en endokrin disruptor 40-49. Dermed en klar prosedyre på hvordan å forberede dette kjemikaliet i løsningen is av interesse for toksikologer. Fordi TCS er en liten hydrofob molekyl, dannes det organiske kjøretøyer ofte benyttes for å gjøre den mer løselig i vann. I de fleste toksisitetsstudier hvor TCS er blitt testet, har preparat det gjelder oppløsning i vann ved hjelp av et organisk oppløsningsmiddel slik som etanol, aceton eller olje 2,50,51. Imidlertid ofte disse løsemidler er biologisk aktive seg selv, og dermed komplisere tolkningen av test-kjemiske data 51. Faktisk, i henhold til Rufli et al. 52 og andre 53, anbefales det at testløsningene for akvatisk toksisitet eksperimenter blir fremstilt ved bruk av fysiske metoder enn kjemiske metoder, på grunn av potensialet av kjemiske oppløsningsmidler for å skape toksisitet gjenstander. Vi har tidligere vist at TCS oppløst i 0,24% etanol / vann (vol / vol) og sonikert i 30 min demper RBL mastcelle degranulering 2.. Etanol ved høyere konsentrasjoner enn 0,24% har vist seg å dempe mastcelle nedbrytningnulation 54,55-eksempler på de potensielt konfunderende effekter av organiske løsemidler på toksisitetsstudier.

Ikke bare er det viktig å vurdere effekten av løsningsmidler på organismen eller celler som brukes for å studere, men også at det er viktig å overvåke virkningen av et løsningsmiddel på prøven kjemisk selv. For eksempel Skaare et al. 51. fant at oppløsnings TCS i polyetylenglykol (som vanligvis finnes i tannpastaer og munnvann) svekket antibakterielle og antiplakkdannende effekt hos friske kvinnelige kvinner mens oppløsningen i oljer forårsaket en fullstendig tap av funksjon. Derfor er evnen av forskjellige oppløsningsmidler modulere toksisk middel og legemiddel, inkludert TCS, bør effektene anses i analysebuffer utforming. Bruk av oljer eller smakstilsetninger kan forstyrre effekten av TCS i ulike produkter 50,51.

I et forsøk på å eliminere behovet for å bruke organiske løsningsmidler, forbedres vi ved vår metode for oppløsning av TCS 2 ved å eliminere bruken av en organisk sollufte seg. I den foreliggende protokollen, oppløse vi TCS granulat direkte inn vandig buffer med varme (≤ 50 ° C), og deretter bekrefte konsentrasjonen av dette TCS lager av UV-Vis spektrofotometri. Disse forbedringene er mulig fordi TCS er oppløselig i vann opp til 40 um ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) og har vist seg å motstå nedbrytning ved oppvarming til 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Vi har også den ekstra fordelen av UV-Vis spektrofotometri, som TCS også er kjent for å sterkt absorbere på 280 nm 58 med en jeksel ekstinksjonskoeffisient av 4200 L / mol / cm 12.

Denne protokollen er en enkel, men effektiv måte for å oppløse TCS granuler inn i en buffer uten hjelp av et organisk oppløsningsmiddel, blant annet lav kostnad og hurtig verifiseringkonsentrasjon, og beskriver en kraftig fluorescerende mikroplate analysen for å overvåke kjemiske effekter på mast celle degranulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Legg merke til at alle buffer oppskrifter er inkludert i en tabell ved enden av protokollen tekst.

DAG 1:

En. Utarbeidelse av celler

  1. Planlegg ut 96-brønners plate oppsett ordningen, sentrering stikkprøvene på bordet for å unngå kanteffekter. Tildel tre replikater for hver konsentrasjon undersøkt, TCS (± degranulering av stimulerende antigen eller ionofor), samt triplicates for spontan frigjøring (nei degranulering sentralstimulerende), maksimum frigjøring (0,2% Triton X-100 [TX] vaskemiddel lysis), samt brønner reservert for bakgrunnen prøver (som vil inneholde celler). For hver replikere eksperimentell dag, velger en ny randomisert utformingen av TCS prøven konsentrasjoner.
  2. Varm RBL media (oppskriften gitt i tabellen) og trypsin i 37 ° C vannbad.
  3. Sjekk RBL celler i T-25 kolbe (2-4 dager siden siste passering og mindre enn 3-4 måneder siden de ble tint) for generelle tegn på god groth: riktig pH indikeres av fargen på media, og mangel på skydekket. Plasser kolbe under et lysmikroskop for å bekrefte at kolben er fri for forurensning, og at cellene vises sunn, riktig konfluent, og for det meste festet. Legg merke til at cellene bør sjekkes for mycoplasma forurensning omtrent hver sjette uke 22..
Behandling Triplicates
Stimulert, 0 mikrometer TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Stimulert, 0,001 mikrometer TCS F6, G6, H6
Stimulert, 0,1 mikrometer TCS A4, B4, C4
Stimulert, 1 mikrometer TCS A6, B6, C6
Stimulert, 5 mikrometer TCS F5, G5, H5
Stimulert, 10 mikrometer TCS A3, B3, C3
Stimulert, 15 mikrometer TCS A5, B5, C5
Stimulert, 20 mikrometer TCS F7, G7, H7
Stimulert, pluss høyeste [TCS] F3, G3, H3
Spontan, (inkluderer mocks) Ingen TCS A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, No TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Ingen Cells, bakgrunn, pluss høyeste [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

Figur 1
Klikk her for å se større bilde .

  1. Ta RBL celle kolben inn i sterile vev kultur (TC) hette. Cellene er festet til botnen av kolben. Arbeide under TC hette og ved bruk av standard steril teknikk, fjerner alle medier fra kolbe med steril pipette; cellene forbli festet til bunnen av kolben. Deretter skylle kolben med 2 ml trypsin, og deretter kaste denne vask.
  2. Legg nøyaktig 2 ml trypsin for å dekke bunnen av kolben. Sett i 37 ° C inkubator i 5 min for å tillate cellene å løsne fra bunnen av kolben.
  3. Etter 5 min, treffer ved siden av kolben med en åpen hånd for å løsne cellene. Umiddelbart, tilsett 18 ml RBL media for å vaske cellene av kolben og å slukke trypsin. Umiddelbart ta celle-media-trypsin blanding ut av kolben og overføres til en ny, sterilt 50 ml rør (det samlede volum i dette rør er nå 20 ml).
  4. Etter blanding forsiktig, men grundig, fjernes 50 ul celle-suspensjon fra dette røret, og overføre til et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør, som er en prøve som skal telles. Ta denne prøven, så vel som 50 ml0; røret som inneholder celle-media-trypsin blanding ut av TC hette til den stasjonære.
  5. Spinn 50 ml tube i sentrifuge (med passende balanse) for 8 min ved 500 xg; denne styrken pellets celler effektivt.
  6. I løpet av spin tid, telle cellene i prøven som ble isolert før spinning. For å gjøre dette, må du først legge til 50 pl trypan blått fargestoff til 50 ul av celler i 1,5 ml tube, og forsiktig, men grundig pipette opp og ned 5x å blande. Umiddelbart overføre 10 mL av denne blandingen til glass hematocytometer, og telle cellene i rutenettet området etter produsentens instruksjoner. Telle minst 100 celler for rimelige statistiske resultater.
  7. Tilbake i TC hette, fjern supernatanten fra celler som ble spunnet ned.
  8. Lokk på cellen røret, og flick pellet på bunnen av røret for å løsne cellene.
  9. Legg mediet til cellene trypsinisert og man oppnådde en tetthet på 0,5 x 10 6 celler / ml, basert på celletallet. Bland godt, men forsiktig, for å holde cellene suspendert under platekledning prosedyren. Ved hjelp av en Pipetman, sette 100 ul celler / brønn i en 96-brønns plate (flat, sort bunn), langs platen mal arket. Randomize hvordan cellene er lagt til brønner for å unngå systematiske feil, og bland etter hvert sett av tre brønner er lagt til. Pass på å ikke sette celler i brønnene merket for bakgrunnen prøver.
  10. Når alle cellene er blitt overført, Sett platen lokket på plate, og overføre til inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2) over natten. Rydd opp etter standard steril teknikk.

DAG 2:

2. Utarbeidelse av Triklosan

  1. Ved hjelp av en gradert sylinder, måler 250 ml Tyrodes buffer (oppskriften gitt i tabellen) i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe som er merket "TCS-buffer." Add rørestav. Bruk glass, rør bar, termometer beregnet for bruk med TCS bare.
  2. Også på denne tiden, måler 250ml Tyrodes i et eget 500 ml erlenmeyerkolbe, merket "kontroll buffer." Bruk glass, røre bar, termometer som ikke er utpekt for TCS. Legg røre bar.
  3. Vei opp 0,0022 g av TCS granulat og overføre til "TCS-buffer" kolbe (som inneholder 250 ml Tyrodes Buffer). For å effektivt overføre granulat til erlenmeyerkolbe, bruke 10 ml fra de målte 250 ml Tyrodes å vaske av veie båt, gjør at alle TCS er overført.
  4. Place "TCS-buffer" kolbe på en kombinasjon kokeplate / magnetiske oppsikt plate, og sett den til å røre ved en manageably høy hastighet. Når godt blandet, vil dette TCS lager nominelt være 30 mikrometer (faktiske konsentrasjon vil bli beregnet etter oppvarming). (Gjør alt blande i et avtrekksskap.)
    1. Også på dette tidspunktet, plassere "kontroll buffer" kolbe (inneholder ingen TCS) på en annen kombinasjon kokeplate / magnetiske oppsikt plate, og sett den til å røre på et tilsvarende hastighet.
  5. Slå på UV / Vis lampe å varme opp lampen for senere bruk.
  6. Varm opp "TCS-buffer"-løsning til 50 ° C under omrøring. En gang opp til temperatur, tid i 90 min. I løpet av 90 min, fortsette å overvåke 50 ° C temperatur og passende rørehastigheten ofte.
    1. Samtidig varmes den "kontrollbuffer"-løsning (som er like 250 ml ren Tyrodes buffer) til 50 ° C med kontinuerlig omrøring. Ved å nå 50 ° C, tid for 90 min, i løpet av hvilken tid temperaturen (som holdes ved 50 ° C) og omrøring blir både overvåket.
  7. På slutten av 90 min, ta begge Erlenmeyerkolber av de varme platene og overføring til stasjonære.
  8. Bruke bølgelengde scan funksjonen på en UV / Vis spektrofotometer, blank maskinen på 1 ml oppvarmet "kontroll buffer" løsning før skanning 1 ml oppvarmet "TCS-buffer"-løsning. Sjekk formen av spekteret, end rekord Absorbance verdi på 280 nm. For å bestemme konsentrasjonen, bruk Beer-Lambert-ligningen (A 280 = 280. ε ℓ c) ved hjelp av en ε 280 på 4200 l / mol / cm 12 og ℓ av 1 cm.
  9. Etter fastsettelse av TCS konsentrasjon, tilsett 0,249 g bovint serumalbumin (BSA) til de resterende 249 ml av den "TCS-buffer"-løsning, og bland godt.
    1. Samtidig, tilsett 0,249 g BSA til de resterende 249 ml av "kontroll buffer"-løsning, og bland godt.

DAG 2:

3. Antigen-stimulert degranulation analysen hjelp RBL-2H3 Cells

  1. Før du starter, må du kontrollere pH i alle buffere som brukes, og sikre at de er klare og ikke regn: dette inkluderer Tyrodes buffer, natriumacetatbuffer, og glysin karbonatbuffer (oppskrifter gitt i tabell).
  2. Varm RBL media og trypsin i 37 ° C vannbad.
  3. Lag BT (1 mg / ml0; BSA i Tyrodes buffer): 0,05 g BSA + 50 ml Tyrodes Buffer (X2). Sett i 37 ° C vannbad.
  4. Kontroller 0,2% Triton X-100: 3,136 ml av BT + 64 pl av 10% Triton X-100 (sluttkonsentrasjon av Triton X-100 er 0,2%). Bland godt ved å vende, men ikke vortex. Sett i 37 ° C vannbad.
  5. Starte utarbeidelsen av TCS og oppvarmet Tyrodes buffer (trinn "2" ovenfor). Merk: Ikke start neste trinn (IgE eksponering) til "TCS-buffer" og "kontroll buffer" løsninger nå 50 ° C og rør for den første 70 min av 90 min varme / røring tid.
  6. Når begge løsninger er blitt omrørt ved 50 ° C i 70 minutter, utgjør 0,1 ug / ml anti-DNP IgE mus (Sigma) i RBL medier for prøvebrønner for å være sensitivisert (100 ul / brønn). IgE lager bør ikke være eldre enn 30 dager ved oppbevaring ved 4 ° C, registrere hvor gammel aksjen er. Flick å blande, men ikke vortex IgE.
  7. Under en TC hette,Tilsett 0,6 mL IgE lager (lager er 1 mg / ml) til 6 ml RBL medier i et 50 ml rør. I en annen 50 ml rør, tilsett 6 ml ren RBL media bare (som er beregnet for nonsensitized prøver).
  8. Dumpe alle medier fra 96-brønners plate (som var forberedt på dag 1) i vasken, og bringe platen under TC panseret.
  9. Tilfeldig tilsett 100 mL media / IgE blandingen til brønner som bør stimuleres (48 brønner totalt). Denne blandingen er ikke ment for "spontan", "TX" og "Bakgrunn" prøver.
  10. Tilfeldig tilsett 100 mL vanlig RBL media bare å "TX", "spontane" og "Bakgrunn" brønner.
  11. Sett plate lokk på plate, og deretter flytte plate med 5% CO 2/37 ° C inkubator for en hr.
  12. I løpet av en time inkubasjon, følger du trinn 03.13 til 03.24.
  13. På den stasjonære, forberede antigen fortynninger. Legg 0,53 mL av 1,6 mg / dl buljong DNP-BSA + 850 mL & #160; BT for å få en antigen-konsentrasjon på 1 pg / ml. Vortex og invertere denne aksjen å blande.
  14. Når "TCS-buffer" og "kontroll buffer" har blitt varmet opp og deretter rørt i 90 min ved 50 ° C, fortsette med resten av forberedelsene til TCS-protokollen (gå til trinn 2.6 - 2.8.1). Etter at BSA er oppløst i begge løsninger, fortsetter nedenfor.
  15. Begynne å forberede de eksponering buffere, med ± Ag, ± TCS. Først fra 249 ml prøve av "TCS-buffer"-løsning (som allerede er blitt oppvarmet og omrørt i 90 min), overføres 50 ml til et nytt 50 ml konisk rør. Fjern 20 ul av dette 50 ml alikvoter og erstatte det med 20 pl av 1 pg / ml antigen fremstilt tidligere for et antigen endelig konsentrasjon på 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex og invertere.
    1. Etiketten dette "Tube 1, High TCS / + Ag / + BT." Den brukes for fortynninger og høyeste TCS konsentrasjon eksponering.
    2. Fra 249 ml prøve av "kontroll buffer"-løsning, 50 ml overføre til et nytt 50 ml rør. Fjern 20 ul av denne nye 50-ml aliquot og erstatte med 20 pl av 1 pg / ml antigen fremstilt tidligere for et antigen endelig konsentrasjon på 0,0004 ug / ml DNP-BSA. Vortex og invertere.
      1. Etiketten dette "Tube 2, No TCS / + Ag / + BT". Brukes for TCS fortynninger og 0 mikrometer TCS konsentrasjon eksponering.
    3. Nå tar ut 50 ml av "TCS-buffer"-løsning og satt inn i en annen 50-ml tube. Fjern 20 pl fra denne nye 50-ml mengde og erstatte den med 20fil vanlig BT. Vortex og invertere. Ingen antigen blir tilsatt.
      1. Merke dette "Tube 3, High TCS / Nei Ag / + BT." Dette brukes for bakgrunnen.
    4. Overfør 50 ml av "kontroll buffer"-løsning til en annen 50 ml-rør. Ta ut 20 pl fra denne ne w 50-ml mengde og erstatte den med 20fil vanlig BT. Vortex og invertere. (Ingen Ag er lagt til.)
      1. Merke dette "Tube 4, No TCS / Nei Ag / + BT." Dette brukes for bakgrunn og spontane prøver.
    BSA TCS Antigen
    Tube 1 Sjekk markere High [] Sjekk markere
    Tube 2 Sjekk markere NO Sjekk markere
    Tube 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> High [] NO
    Rør 4 Sjekk markere NO NO
    1. Beregne og registrere volumer for fortynninger etter bestemme konsentrasjonen av "TCS-buffer" lager. Samlet volum for hver fortynning konsentrasjon bør være 1 ml og bør være fremstilt i et sterilt mikrosentrifugerør. Bruk kalibrert P2 og P1000 Pipetman.
    Konsentrasjon Høy Triklosan + Tyrodes + BSA 0,0004 mg / ml Ag
    (Tube en ovenfra)     		Oppvarmet BT 0,0004 mg / ml Ag
    (Tube 2 ovenfra)
    20 pM
    10 mikrometer
    5 mikrometer
    1 pM
    0,1 mikrometer
    0,001 mikrometer
    0 mikrometer (øverst på plate) ----------------------- 500 ul pluss ytterligere 500 ul
    0 mikrometer (nederst på plate) ----------------------- 500 ul pluss ytterligere 500 ul
    1. Etter 1-hr IgE inkubasjon, ta platen ut av inkubatoren og kaste alle medier i vasken. (Merk: Hvis test kjemikalier er kjent for å være mer giftig enn forbrukerprodukt TCS, kan farlig avfall være nødvendig.)
    2. Ved hjelp av en Combitip, tilfeldig vaske celler i 96-brønners plate med BSA-Tyrodes Buffer (200ul / brønn). Slipp vaskebuffer på sidene av brønnene, i stedet for direkte på de sammenheftede cellene, for å unngå å forstyrre de sammenheftede cellene. Gjenta prosessen en gang til.
    3. For å fremstille behandlinger for anvendelse, Vortex og invertere fortynninger rett før tilsetning til platen.
    4. Fra og med den øverste delen av platen: Tilfeldig legge triplicates av 200 ul hver av antigen løsninger (med riktige konsentrasjoner av TCS) til tilsvarende brønner. Fortsett til bunnen av tallerkenen. Legg til "kontroll buffer" løsning pluss Ag (fra "Tube 2" ovenfor) til alle "spotter" på tallerkenen.
    5. Tilsett 200 ul av hensiktsmessige løsninger på tilsvarende brønner:
      1. Tilsett 200 ul av 0,2% Triton X-100 "TX"-utpekte brønnene.
      2. Deretter legger 200 ul Tube tre til tre brønner merket "Background (Bkgd)-Høyeste TCS" på tallerkenen.
      3. Til slutt, tilsett 200 mLAV RØR 4-6 brønnene merket "Spontaneous."
    6. Inkuber platen i 1 time i 37 ° C / 5% CO2.
    7. I løpet av en time inkubasjon: Få to bøtter med is (en for "gamle" plate i kuvøse og en for ny plate). Tine 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glukosaminid (4-MU) ved romtemperatur i opp til 40 min, og tatt folie fordi det er lysfølsom.
      1. Når 4-MU lager er tint, utgjør 4-MU fungerende løsning: 150 ul lager + 14,85 ml kaldt acetatbuffer (oppskrift gitt i tabell); vortex og invertere. Hold i 50 ml sentrifugerør, innpakket i folie, og på is inntil bruk.
      2. Ved hjelp Combitip, tilfeldig tilsett 100 mL kald 4-MU arbeider løsning i bunnen av hver brønn av en NY Grenier svart 96-brønners plate (på isen bøtte nr. 2). Starte først ved å tilsette arbeidsløsningen tilfeldig innenfor toppen av platen, tilfeldig innenfor bunnen av platen, tilfeldig innenfor Triton X-100 brønnerog til slutt tilfeldig innenfor bakgrunn brønner.
      3. Kom deg ut ny boks av P200 tips for neste trinn.
    8. Ved slutten av 1-t inkubering sette celle plate fra inkubatoren på is bøtte # 1, pipette supernatant opp og ned fire-5x (forsiktig, for ikke å innføre bobler), som går rundt brønnen for god blanding, men ikke berører cellene mens det blandes . Systematisk, ta ut 25 ul prøve fra hver brønn og sted inn i det nye plate med underlaget (samme bestilling av prøver, som opprinnelig planlagt ut). Pipette opp og ned for å blande prøven grundig når du er i ny brønn, uten å innføre bobler.
    9. Inkuber i 30 min ved 37 ° C / 5% CO 2.
    10. Etter 30 min inkubasjon tilfeldig tilsett 200 pl kald glycin-karbonat-buffer per brønn (ved hjelp Combitip) for å fylle brønnene opp til 325 pl totalvolum. (Kontroller dette tillegg til Triton X-100 prøver sist, for å unngå Triton X-100 smitte). Se etter bobler før lesing plate (rote med rent P10 pipettete tips til pop noen bobler).
    11. Kjør plate i fluorescens plateavleseren (gå til punkt 4).

    DAG 2:

    4. Fluorescent plateavleseren Instruksjoner og dataanalyse

    1. Åpne Gen5 program, og åpne eksperiment delen.
    2. Slå på plateavleseren og mellomlagsplate (øvre venstre hjørne er A1).
    3. Protokoll Arrow Prosedyre Arrow Les å sette egendefinerte målinger. Ikke legg noe om prøvene, gjentak, etc., for å samle rå fluorescens data fra hver brønn.
    4. Under "Les" velg "fluorescens", "Endpoint", "Normal", "Gain 40", "Excitation 360/40", "Emission 460/40," Optics stilling: Top 50%. Topp optisk forskyvning: 7mm. Ingen shake, ingen forsinkelse, ingen kinetikk, ingen skjerm godt, temperatur: kuvøse av.
    5. Velg flat svart bunn, 96-brønners plate (Grenier 96 brønner, Flat bunn).
    6. Avtale med platen layout: Protokoll Arrow plate layout. Sett opp prøver uten indikerer gjentar, fortynninger, osv.
    7. Tallerken Arrow lese.
    8. Lagre fil: Klikk på "Excel"-knappen, som vil eksportere data fil til Excel. Gjør dette for plate layout og matrise. Lagre filen på datamaskinen og på en USB-stasjon.
    9. I Excel, trekker den gjennomsnittlige bakgrunnsstoff fra hver prøve, inkludert Triton X-100 brønner.
    10. Beregn relative% degranulation ved å dele hver verdi (allerede å ha hatt bakgrunn trukket fra) med gjennomsnittlig Triton X-100 verdi, og deretter multiplisere med 100 for å gjøre det til en prosentandel.
    11. Gjennomsnittlig alle triplicates, og beregne standardavvik. Graf data i Excel som middelverdier ± standardavvik. For statistisk testing, flytter nå til Prism programvare ved GraphPad.

    DAG 2:

    5. Ionophore stimulert degranulation analysen hjelp RBL-2H3 Cells

    1. Følg protokoll for "Forberedelse av celler" (§ 1, dag 1) og "Forberedelse av triklosan" (§ 2, Dag 2), som beskrevet ovenfor. Platen layout eksempel for ionophore stimulering er vist nedenfor.
    Behandling Triplicates
    Stimulert, 0 mikrometer TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
    Stimulert, 0,001 mikrometer TCS F6, G6, H6
    Stimulert, 0,01 mikrometer TCS F3, G3, H3
    Stimulert, 0,1 mikrometer TCS A4, B4, C4
    Stimulert, 1 mikrometer TCS A6, B6, C6
    Stimulert, 5 mikrometer [TCS F5, G5, H5
    Stimulert, 10 mikrometer TCS A3, B3, C3
    Stimulert, 15 mikrometer TCS A5, B5, C5
    Stimulert, 20 mikrometer TCS F7, G7, H7
    Spontan, med DMSO, ingen TCS (inkluderer mocks) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
    TX-100, med DMSO, ingen TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
    Ingen celler bakgrunn, med DMSO, pluss høyeste [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

    Figur 1 Klikk her for å se større bilde .

    1. Før du starter, må du kontrollere pH i alle buffere som brukes, og sikre at de er klare og ikke regn. Tyrodes, natriumacetatbuffer, og glycin-karbonat-buffer (oppskrifter gitt i tabellen).
    2. Tilbered en 50 ml konisk rør av BT ved tilsetning av 0,05 g BSA til 50 ml tyrodes buffer og ved omrøring for å blande godt. Inkuber i 37 ° C vannbad.
    3. Kontroller 0,2% Triton X-100 med 0,0032% DMSO (endelig kalsium ionofor kjøretøy konsentrasjon) ved å tilsette 96 ul av 10% Triton X-100 til 4,704 ml BT. Bland godt. Deretter tar ut 0.155 ul av denne løsningen og kast. Nå kan du legge tilbake i 0.155 ul av 100% DMSO.
    4. Tilbered en 5 mM stamløsning (2,5 mg / ml) av A23187 ionofor fra pulver ved å tilsette 400 ul av frisk 100% DMSO inn i hetteglasset ionofor og virvling å blande. En gang i løsning,overføre til en 1,5 ml konisk tube, ta opp innholdet og dagens dato og utløp (3 måneder fra forberedelse når lagret på riktig måte ved -20 ° C).
      1. Alternativt, hvis du bruker en frossen lager i dag, tine på is, og sjekk at 5 mM A23187 ionophore er godt blandet og klart. Vortex, flick, og invertere denne aksjen før bruk. Registreringsdato for utarbeidelse og Lot # av dette A23187.
    5. Når "TCS-buffer" og "kontroll buffer" har blitt varmet og rørt i 90 min, fortsetter resten av forberedelsene til TCS-protokollen (gå til trinn 2.6-2.8.1). Etter at BSA er godt blandet inn i begge løsningene, fortsetter du med de gjenværende protokollen trinn.
    6. Fra 249 ml prøve av "TCS-buffer" løsning, overføre 50 ml til en ny 50 ml konisk tube. Fjern 1,8 mL av 50 ml mengde og tilsett 1,8 mL av 5 mM ionophore lager. Vortex 3x for 8 sek og invertere 3x. Endelig ionophore konsentrasjon er en80 nM. Legg merke til at denne konsentrasjon av A23187 vil variere avhengig av lager potens, og en A23187 ionofor doserespons anbefales å identifisere en konsentrasjon av A23187 som utløser en degranulering nivå på omtrent 20% maksimal frigjøring, som har blitt identifisert som et noncytotoxic til RBL-2H3 celler ved cytotoksisitet assay (se 2).
      1. Etiketten dette "Tube 1, High TCS / + ionophore / + BT." Brukes til fortynninger og høyeste TCS konsentrasjon eksponering.
    7. Fra 249 ml prøve av "kontroll buffer"-løsning, 50 ml overføre til et nytt 50 ml konisk rør. Ta ut 1,8 mL av 50 ml mengde og legge tilbake i 1,8 mL av 5 mM ionophore lager. Vortex 3x for 8 sek og invertere 3x. Endelig ionophore konsentrasjonen er 180 nM.
      1. Etiketten dette "Tube 2, No TCS / + ionophore / + BT." Dette brukes for fortynninger og 0 mikrometer TCS konsentrasjoner.
    8. Fra 249 til ml prøve av R 20, TCS-buffer "løsning, overføre 50 ml til en ny 50 ml konisk tube. Ta ut 1,8 pl av den nye 50 ml mengde og tilsett 1,8 ul av 100% DMSO. Vortex 3x for 8 sek og invertere 3x, ingen ionophore er lagt til.
      1. Etiketten dette "Tube 3, High TCS / No ionophore / + BT / + DMSO"; brukes til bakgrunnen.
    9. Fra 249 ml prøve av "kontroll buffer"-løsning, 50 ml overføre til et nytt 50 ml konisk rør. Ta ut 1,8 mL fra den nye 50 ml mengde og tilsett 1,8 mL av 100% DMSO. Vortex 3x for 8 sek og invertere 3x. Ingen ionophore er lagt til.
      1. Etiketten dette "Tube 4, No TCS / No ionophore / + BT / + DMSO"; brukes for spontane utslipp prøver.
    BSA TCS Ionophore Tilsatt 100% DMSO
    Tube 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> High [] Sjekk markere NO
    Tube 2 Sjekk markere NO Sjekk markere NO
    Tube 3 Sjekk markere High [] NO Sjekk markere
    Rør 4 Sjekk markere NO NO Eck mark "fo: content-width =" 0,1 i "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/>
    1. Beregne og registrere volumer for fortynninger etter bestemme konsentrasjonen av "TCS-buffer" lager. Bruk kalibrert P2 og P1000 Pipetman. Samlet volum for hver fortynning konsentrasjon bør være 1 ml, og bør være fremstilt i et sterilt mikrosentrifugerør:
    <td>
    Konsentrasjon Høy Triklosan + Tyrodes + BSA 180 nM A23187 (Tube en ovenfra) Oppvarmet BT 180 nM A23187 (Tube 2 ovenfra)
    20 pM
    15 mikrometer
    10 mikrometer
    5 mikrometer
    1 pM
    0,1 mikrometer
    0,001 mikrometer
    0 mikrometer (øverst på plate) ---------------------------------- 500 ul pluss ytterligere 500 ul
    0 mikrometer (nederst på plate) ---------------------------------- 500 ul pluss ytterligere 500 ul
    1. Ta cellene belagt går ut av inkubatoren, og tomme media i vasken. Ved hjelp av en Combitip, tilfeldig vaske celler i 96-brønns plate med BT (200 ul / brønn). Gjenta vask en gang til.
    2. For å fremstille behandlinger for anvendelse, Vortex og invertere fortynninger rett før tilsetning til platen. Fra og med den øverste delen av platen: Tilfeldig legge triplicates av 200 ul hver av riktig konsentrasjon av TCS til corresponding godt. Fortsett til bunnen av tallerkenen. Legg til "kontroll buffer" løsning pluss A23187 (fra "Tube 2" ovenfor) til alle "spotter" på tallerkenen.
    3. Tilsett 200 ul av hensiktsmessige løsninger på tilsvarende brønner:
      1. Tilsett 200 ul av 0,2% Triton X-100 "TX"-utpekte brønnene.
      2. Deretter legger 200 ul Tube tre til tre brønner merket "Background (Bkgd)-Høyeste TCS" på tallerkenen.
      3. Til slutt legger 200 ul Tube fire til seks brønner merket "Spontan".
    4. Inkuber platen i 1 time i 37 ° C / 5% CO2.
    5. I løpet av en time inkubasjon: Få to bøtter med is (en for "gamle" plate i kuvøse og en for ny plate). Tine 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-beta-D-glukosaminid (4-MU) ved romtemperatur i opp til 40 min, og tatt folie fordi det er lysfølsom.
      1. Når 4-MU lager er tint, utgjør 4-MU arbeider solutipå: 150 ul stam + 14,85 ml kald acetatbuffer (oppskriften gitt i tabellen), vortex og invertere. Hold i 50 ml sentrifugerør, innpakket i folie, og på is inntil bruk.
      2. Ved hjelp Combitip, tilfeldig tilsett 100 mL kald 4-MU arbeidsløsning inn i selve bunnen av hver brønn av en NY Grenier sort 96-brønners plate (på is bøtte nr. 2): starte først ved tilsetning av arbeidsoppløsningen tilfeldig innenfor toppen av plate, tilfeldig innenfor bunnen av platen, tilfeldig innenfor Triton X-100 brønner, og endelig tilfeldig innenfor bakgrunns brønner.
      3. Kom deg ut ny boks av P200 tips for neste trinn.
    6. Ved slutten av 1-t inkubering sette celle plate fra inkubatoren på is bøtte # 1, pipette supernatant opp og ned fire-5x (forsiktig, for ikke å innføre bobler), som går rundt brønnen for god blanding, men ikke berører cellene mens det blandes . Systematisk, ta ut 25 ul prøve fra hver brønn og sted inn i det nye plate med underlaget (samme bestilling av SAmples, som opprinnelig planlagt ut). Pipette opp og ned for å blande prøven grundig når du er i ny brønn, uten å innføre bobler.
    7. Inkuber i 30 min ved 37 ° C / 5% CO 2.
    8. Etter 30 min inkubasjon tilfeldig tilsett 200 ul kald glycin-karbonat-buffer per brønn (ved hjelp Combitip) for å fylle brønnene opp til 325 pl totalvolum (gjøre dette tillegg til Triton X-100 prøver varer, for å unngå Triton X-100 smitte). Se etter bobler før lesing plate (rote med rent P10 pipette tips til pop noen bobler).
    9. Kjør plate i fluorescens plateavleseren (Følg alle trinnene i kapittel 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved oppvarming til 50 ° C i 90 min, produserer UV-vis Absorpsjonsspekteret for TCS en sterk, glatt kurve mellom ~ 260 og 300 nm, med en topp ved 280 nm, som vist på figur 1. UV-Vis-spektrofotometri er derfor et viktig verktøy som kan benyttes til å beregne konsentrasjonen, siden den publiserte molar absorpsjonskoeffisient ved 280 nm er 4200 l / mol / cm 12. Vi har funnet at TCS ikke faller ut av oppløsningen i løpet av den tidsramme av hele eksperimentet degranulering, som følge av 50 ° C varme (data ikke vist).

Etter å ha brukt denne oppvarming metode for å oppløse TCS direkte inn vandig buffer, undersøkte vi effekten av TCS på mast celle degranulation med en fluorescens-basert analysen som ble optimalisert fra Naal et al. 1 Denne analysen registrerer nivået av β-hexosaminidase løslatt fra mast celler etter en times inkubasjon ved å oppdage en Fluorogenic substrat produkt. Enten stimulert til degranulate av DNP-BSA-antigen (Figur 2) eller kalsium-ionofor A23187 (figur 3), kan man tydelig se at TCS forårsaker en signifikant dose-responsive hemming av frigjøring av β-hexosaminidase (dvs. degranulering).

Figur 2 representerer resultater oppnådd for IgE-sensibiliserte RBL-celler, som ble inkubert i 1 time i "TCS-buffer" eller "kontroll buffer," og utsettes for et DNP-BSA-antigen dose på 0,0004 mg / ml. Denne konsentrasjon av DNP-BSA fremkalte en gjennomsnittlig absolutt degranulering respons på 22,5% ± 0.1 (gjennomsnitt ± standardavvik) ved fravær av TCS. Statistisk signifikant hemming av degranulation begynte på 5 mikrometer, hvor degranulation nivåer var 0,79 ganger ± 0,05 (gjennomsnitt ± SD) av 0 mikrometer TCS kontroll nivåer. Da TCS-konsentrasjonen øker, er det en større dempende effekt av TCS, viser en sterk doseresponsforhold. TCS, på 20 mikrometer, almost opphever fullstendig den degranulation respons, til nivåer omtrent lik spontan degranulation (der ingen antigen er tilstede). Generelt, viser denne figur sterk hemming av multivalent antigen-stimulert mastcelle degranulering på grunn av konsentrasjons-verifisert TCS, uten anvendelse av organiske løsningsmidler.

I figur 3, ble kalsium ionophore A23187 brukes som en måte for å undersøke mekanismene for TCS-indusert demping av degranulering i RBL-mastceller. A23187 blir brukt som et alternativ stimulerende fordi den går utenom FcεRI tverrbinding og andre signaleringshendelser oppstrøms av kalsiuminnstrømningen, men likevel forårsaker degranulering. RBL-mast-celler ble inkubert i 1 time i "TCS-buffer" eller "kontroll buffer," som inneholder en kalsium-ionofor dose på 180 nM. I fravær av TCS, fremkalte denne konsentrasjon av A23187 en gjennomsnittlig absolutt degranulering respons på 25,1% ± 4,7 (middelverdi ± standardavvik). Hemming av degranulation varfunnet med så lite som 1 mikrometer TCS (0.63 ± 0.11 [gjennomsnittlig ± SD]). Da TCS konsentrasjonen øker, øker også graden av hemming: ved 5 uM, 0,21 ± 0,04-ganger av de 0 uM TCS kontrollnivåer ved 10 uM, 0,09 ± 0,05, ved 15 uM, 0,077 ± 0,006, og på 20 uM , 0.09 ± 0.02 (middel ± SD). Faktisk, fra 5 uM og høyere konsentrasjoner av TCS, ble nivåene av A23187-indusert degranulering funnet å være i nærheten av nivået for spontan kontroll (hvor ingen A23187 er til stede i det hele tatt). Totalt, figur 3, i kombinasjon med figur 2, indikerer at de molekylære hendelser som målrettes av TCS er sannsynlige nedstrøms kalsiuminnstrømningen.

Figur 1
Figur 1:. Representant TCS UV-Vis Absorpsjonsspekteret TCS har en robust ertk ved 280 nm, noe som gir enkel bestemmelse av en 280, samt gjør at evnen til å bruke den molare ekstinksjonskoeffisient på 4200 l / mol / cm 12 for å bestemme den virkelige konsentrasjonen av TCS oppløst i tyrodes buffer. Den gule linjen viser topp på 280 nm. I dette eksemplet er absorbansen verdi på 280 nm 0,11876, noe som indikerer en TCS konsentrasjon av 28.28 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2
Figur 2:. Et representativt degranulation respons av IgE-sensibiliserte RBL mastceller utsatt for 0,0004 mg / ml DNP-BSA antigen og TCS (0-20 mm) En spontan frigjøring verdi (ingen antigen til stede) er avbildet som referanse. Verdiene representerer bety7; standardavvik på triplikate prøver. Som presentert, ble data normalisert til kontroll (0 mikrometer TCS), og signifikante forskjeller ble bestemt i Prism programvare med en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukey sin post hoc test (sammenligninger gjort til 0,001 mikrometer TCS gjennomsnittlig svartid). Betydning er representert ved *** p <0,001. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
Figur 3:. En representativ degranulering reaksjon av RBL-mast-celler stimulert med 180 nM kalsium ionophore A23187 i nærvær av TCS (0-20 uM) En spontan frigjøring prøve (ingen ionofor til stede) er avbildet som referanse. Verdier er middelverdier ± standardavvik av triplikate prøver. Som presented, er data normalisert til kontroll (0 mikrometer TCS), og signifikante forskjeller ble bestemt i Prism programvare med en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukey sin post hoc test (sammenligninger gjort til 0,001 mikrometer TCS gjennomsnittlig svartid). Betydning er representert ved *** p <0,001; ** p <0,01. Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I 2004 utviklet Naal et al. En en mast celle biosensor for høy gjennomstrømming testing av degranulation. Det er en robust analyse som vi har tilpasset for våre TCS studier og detaljert i denne videoen. Før Naal et al. Ett assay hadde mastcelle degranulering blitt rutinemessig vurdert via β-hexosaminidase 59-61, men disse tidlige metoder benyttes Fluorimetre hvori én prøve ble avlest på en gang. Viktigere, Naal et al. etablert direkte samsvar mellom deres mer high-throughput fremgangsmåte for å utnytte en mikroplateavleser og den tidligere metode hvor prøver ble lest ett-at-en-gang i et fluorometer. I sum, Naal et al. Ett kraftig forbedret hastighet, kraft, enkelhet og pålitelighet av analysen ved å tilpasse det til en high-throughput mikroplate plattform, så vel som ved å innlemme flere endringer i arbeidsflyten. Her har vi ytterligere tilpasset denne analysen for en studie av forskjellige undersøkte kjemikalier, spesielt, her, Den allestedsnærværende stoffet TCS. Videoen inneholder informasjon om fremgangsmåten i denne svært nyttige analysen. I tillegg har vi også utviklet et organisk-løsemiddelfri metode for å bruke TCS i vandig buffer, og vi viser en enkel, rimelig prosedyre for å verifisere TCS konsentrasjon. Disse metodene bør være nyttig for den tilsynelatende voksende feltet av triklosan toksikologi. I denne diskusjonen, detalj vi flere hensyn for å bruke denne degranulation analyse for å teste andre kjemikalier også.

TCS fremstilt direkte i vandig buffer uten hjelp av organiske oppløsningsmidler, ble konsentrasjonen verifisert ved UV-Vis-spektrofotometri (figur 1), og deretter virkningen av TCS (<30 pM) ble undersøkt på mastcelle degranulering (figur 2 og 3) , ved hjelp av et fluorescens-mikroplate-analyse for å påvise tilstedeværelse av β-hexosaminidase, et surrogat markør for degranulering. Vi har funnet at TCS er i stand til å signifikant dempe frigjøring av β-hexosaminidase fra RBL mastceller når det er oppløst i en lav konsentrasjon av etanol (0,24% vol / vol) 2 eller, som vist her, direkte inn i vandig buffer. Av foregående organisk oppløsningsmiddel, ser vi egentlig mer uttalt demping i antigen-indusert degranulering som sammenlignet våre studier hvor TCS ble oppløst i 0,24% etanol (vol / vol). For eksempel, her vi har demonstrert en> 50% reduksjon i antigen-indusert degranulering (0,46-ganger ± 0,07), som er mye større enn ~ 25% reduksjon vi rapportert for 10 uM TCS oppløst i 0,24% etanol (0,76-fold ± 0.02) 2. I samme ånd, bestemt vi for A23187-stimulerte celler som, etter fem mikrometer, hemmer TCS degranulation til spontane utslipp nivåer, denne effekten ble ikke vist til 10 mikrometer TCS i vår tidligere, etanol-bruk, studere to. Det er to mulige årsaker til dette avviket: enten en 0,24% etanol kjøretøy 2 demper TCS evne til å hemme aktiv mast cell degranulation, eller TCS vi brukte var mindre konsentrert enn forventet (siden konsentrasjoner ikke ble verifisert av UV-Vis spectrophotometry i forrige undersøkelse 2). Angående den molekylære mål for TCS 's inhibering av mastcelle degranulering, er det sannsynlig oppstår et eller annet sted i signaltransduksjon kaskade på nedstrømssiden av kalsiuminnstrømningen 2.. Vi brukte kalsium ionophore A23187 som en degranulation stimulerende å omgå tidlige signalering hendelser, og TCS er hemmende effekt vedvarte, noe som indikerer at målet for TCS hemming i degranulation banen, ikke sannsynlig ligger oppstrøms av kalsium tilstrømningen. Vi har tidligere vist at membran ruffling av disse celler er også undertrykkes på grunn av TCS behandling, noe som tyder på muligheten for en felles vei mål 2.

Tidligere studier har funnet Absorpsjonsspekteret av TCS har en maksimal topp ved 280 nm og en molar absorpsjonskoeffisient ble evaluert til å være 4200 l / mol / cm ved denne wavelenGTH (ved pH-verdier under den pK a) 12. Det har vist seg at oppvarming av TCS ikke fører til termisk nedbrytning 57, og en annen studie har vist lykkes i å løse TCS i vann mens de blir oppvarmet til 50 ° C uten hjelp av et organisk oppløsningsmiddel 56. Når en ny kjemisk test anvendes, dets løselighet i den vandige buffer, selvfølgelig, følges omhyggelig vurderes. Man har også funnet at, ved oppvarming av TCS, er formen på den spektrale avlesning upåvirket hvorvidt det er oppvarmet til 40-90 min (data ikke vist): denne antyder en mangel på degradering av TCS ved oppvarming i en lengre periode tid. Vær imidlertid oppmerksom på at TCS oppløsningen større på 90 min enn 40 min. Vi har også bekreftet at TCS ikke faller ut av oppløsningen for varigheten av eksperimentet degranulering (data ikke vist).

Den DNP-BSA-antigen og kalsium-ionofor konsentrasjonene benyttet i denne studien ble valgt på grunnlag av antigen-og ionofor-dose-respons-analyser, etd ble valgt for å fremkalle degranulation moderate nivåer for de representative figurene 2 og 3. Et eksempel på et antigen dose respons-analysen kan sees i figur 1A i vårt tidligere arbeid 2.. Ved fastsettelse av antigen eller ionophore konsentrasjonen som skal brukes i eksperimentet, er det viktig å være klar over at sentralstimulerende dose-respons forsøk må gjøres med jevne mellomrom, vanligvis minst annenhver måned, siden RBL-2H3 celler noen ganger fungere trinnløst. Konsentrasjonen som gir den ønskede andelen degranulering kan variere avhengig av alderen av cellene og på antigenet / ionofor preparat. Også, som vi har sett med uorganisk arsenite 22, kan absolutt degranulation prosenter (nivåer av antigen som brukes) påvirker nivåene av toxicant effekter på RBL degranulation, så toxicant dose-respons bør gjøres på flere forskjellige antigen / ionophore konsentrasjoner. Det er også viktig å vurdere den endelige concentration av DMSO kjøretøyet når stimulerer degranulering med ionofor, siden degranulering påvirkes av DMSO 62. Vi har funnet DMSO konsentrasjonene benyttet i denne protokoll har ikke betydning degranulering, bakgrunn opplesninger, eller 0,2% Triton X-100-verdier 2..

I tillegg til den multivalent antigen DNP-BSA, og kalsium-ionofor A23187, det finnes flere andre metoder for RBL-2H3 stimulering. En av disse metodene er stimulering via eksponering for compound 48/80 sammen med quercetin 63.. En annen er tverrbinding av IgE-reseptorer bundet med et anti-IgE IgG, som vi tidligere testet sammen med TCS eksponering 2. Mange andre metoder for stimulering eksisterer, og hver av disse metodene tar for et annet aspekt av mekanistisk mastcelle degranulering. Denne plateavleseren Analysen kan tilpasses for bruk med flere av disse alternative stimulatorer, ytterligere utvide sin nytte.

Dette degranulation protokollen har potensial til å brukes med et bredt utvalg av chemicals. I en undersøkelse av en hvilken som helst kjemisk test ved hjelp av denne analyse må kontrollene kjøres til de følgende: (1) Effekten av testen kjemisk på bakgrunn (ingen celler) avlesninger, (2) virkningen av den kjemiske på spontan degranulering (batterier uten IgE , ingen antigen, ingen ionofor), (3) virkning av den kjemiske på Triton-X-100 verdier av lyserte celler (uten antigen, ingen ionofor). Disse testene kan lett innarbeides i Plateoppsettet. Tidligere har vi funnet TCS påvirker ingen av disse tre parametrene to. I tillegg bør testene kjøres for å fastslå at testen kjemikaliet ikke forstyrre β-hexosaminidase enzym / substrat reaksjonen seg ​​i en celle-free forberedelse, som beskrevet i figur S1 i vedlegg A supplerende data delen av Palmer et al. 2 Vi fant ut at TCS ikke forstyrrer evnen til β-hexosaminidase for å spalte Fluorogenic substrat 4-MU to. Effekter av løsemidler som brukes må også vurderesi alle disse kontrollforsøk. For eksempel vi bekreftet at DMSO, oppløsningsmidlet for den ionofor, har ingen virkning på Triton-X-100 fluorescens nivåer (data ikke vist). Vi ser også at vi valgte all plast som brukes i denne studien for ikke inneholder det endokrine disruptor bisfenol A, dessverre, men all plast som er på markedet trolig ikke inneholder noen hormonforstyrrende aktivitet, noe som potensielt kan forvirre data 64 år.

I tilfelle at feilsøking er nødvendig, bør flere mulige aspekter av denne protokollen bli anmeldt. For eksempel kan det være slik at (1) den spontane frigjøring nivået er for høyt (større enn ~ 7% av lysis-verdier), (2) en dose-respons med enten stimulerende og / eller kjemisk test ikke observeres, eller (3) TCS-konsentrasjonen i løsningen er for lav (lavere enn 20 uM). I det første tilfellet, kan en høy spontan nivå være en indikasjon av cellene i kultur blir for lang eller blir forurenset med mykoplasma; således, Prøv disse eksperimentene med RBL-2H3 celler som har vært i kultur mellom 2-20 uker, og jevnlig teste for mycoplasma. Hvis et sentralstimulerende dose respons ikke følges, kan det oppløste sentralstimulerende konsentrasjonen være for lavt, og bestandene bør gjenskapt. Som et eksempel, kalsium ionofor typisk er gitt som en tynn film, som skal rekonstitueres med DMSO som krever nøye oppmerksomhet og mye virvling. I tillegg kan en ny ionophore aksje med en annen lot-nummer har en annen styrke bare på grunn av mye til lot variasjon, og derfor er en degranulation dose respons anbefales med hver nyinnkjøpte ionophore lager. Det er også verdt å merke seg at en tilsynelatende mangel på effekt med en gitt test kjemisk kan være en indikasjon på at dette stoffet kan kreve en lengre inkubasjonstid for å ha en effekt. Hvis du ikke oppnår en høy TCS avkastning i løsning, sjekk at temperaturen har holdt seg konstant (50 ° C ± 5) mens granulater, oppløses i buffer. Than termometer aldri skal berøre bunnen av kolben, en stilling som vil resultere i en overestimate av temperaturen av løsningen. Sørg også for at det er konstant kraftig omrøring, og at 90 min nedtellingen ikke er startet før temperaturen har først nådd 50 ° C.

Tabell for feilsøking.

Problem

Potensiell Reason

Oppløsning

TCS lager er fast bestemt på å være <20 mikrometer

Ikke-ensartet oppvarming av løsningen

Påse at termometeret er plassert slik at det er suspendert i løsning og er ikke berøre bunnen av kolben.

Omrøring er ikke tilstrekkelig sterk

Økning magnetisk omrøring på røre-plate for å oppnå et nivå av røring som er sterk uten å forårsake løsningen til å hoppe ut av kolben. Sørg for at en passe stor magnetisk oppsikt bar blir brukt.

Problemer med spektrofotometer

Tillate riktig oppvarming av UV-lampe (vanligvis 10 min), eller erstatte pære hvis det er nødvendig.

Spontan degranulation nivåene er for høye (> ~ 7%)

Celler har fått unormale genetiske mutasjoner på grunn av for mye tid på kultur

Utføre eksperimenter med en ny celle tine.

Cellene er døende på grunn av mekanisk klipping

Når du legger til buffer eller behandlinger heftende celler, være forsiktig for ikke å forstyrre cellene, ved å legge disse volumene nøye til sidene av mikrobrønnene. Øve Combitip.

IgE / DNP-BSA ikke medfører utslipp av beta-hexosaminidase enn spontane utslipp nivåer

IgE er eldre enn 30 dager, eller har vært utsatt for fryse tine

Bruk en ny, riktig lagret porsjon av IgE.

DNP-BSA har ikke blitt ordentlig blandet

Sørg for å nøye legge det lille volumet av DNP-BSA til konisk tube og to virvle grundig.

A23187 ionophore ikke medfører utslipp av beta-hexosaminidase enn spontane utslipp nivåer

A23187 aksjen har ikke vært riktig rekonstituert

Produktet kommer som en "tynn film", og må rekonstitueres med omsorg og mye risting. Transfer rekonstituert lager til en ny 1,5-ml tube for lagring.

A23187 aksjen har ikke blitt riktig lagret

Aksjer er lysfølsom. Etter rekonstituering Parafilm toppen, og butikken innpakket i folie ved -20 ° C. Hvis det er et spørsmål om lagring av en aksje, kaste og begynne tester med en ny aksje.

180 nM av A23187 ionofor ikke fremkallersamme grad av relativ degranulering respons, som som finnes i en tidligere assay

Lot-til-lot variasjon av A23187 ionophore

Utfør en dose respons eksperiment for hvert nytt parti med ionophore. Det anbefales også at aksjer fra samme parti testes som følge av potensiell variasjon i tilberedning prosessen.

Som i enhver toksikologi / farmakologi eksperiment, må testen kjemisk ikke være åpenlyst giftige ved de testede konsentrasjoner. Det anbefales å bruke metoder som test for både apoptose og nekrose, enten individuelt eller kombinert (for eksempel med clonogenic-analyser), så vel som tester for generell skade på plasmamembranen (slik som laktatdehydrogenase lekkasje). TCS, ved konsentrasjoner som er vist i denne studien, er ikke cytotoksisk til RBL-2H3 celler to. En spesielt merke til bekymring med ionophore studiene er at ionophore pluss ionophore kjøretøy(Sannsynlig DMSO), pluss test kjemisk, pluss eventuelle organiske løsningsmidler som benyttes, være et potensielt cytotoksiske brygg, som må være omhyggelig kontrollert, slik det gjøres i Palmer et al. 2.

Vår protokoll for fremstilling av TCS-løsninger uten bruk av et organisk oppløsningsmiddel vil være nyttig for videre toksikologisk testing av denne allestedsnærværende kjemiske, uten forstyrrelser av løsemiddel gjenstander, en særlig viktig faktor i akvatiske toksikologi. Metodene også tillate verifisering av konsentrasjonen av TCS i løsning og kvantifisering av effektene som kjemikalier, for eksempel TCS, har på mast celle degranulation. Denne protokollen kan brukes for å vurdere virkningene av en rekke forskjellige kjemikalier på mastcelle degranulering, slik som antatt endokrin forstyrrende kjemikalier 55, og kan potensielt bli skalert opp for high throughput screening. Dessuten kan andre mast celletyper bli brukt i denne undersøkelse i det videre arbeidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

LMW og RHK støttes av UMaine Graduate School of Biomedical Science and Engineering (GSBSE); RHK ble også støttet av Maine Agricultural & Forest Experiment Station. Ytterligere finansiering ble gitt av National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), Maine Agricultural & Forest Experiment Station (Grant Number ME08004-10, JAG), University of Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) , og en Forskning Starter Grant i farmakologi / toksikologi fra PhRMA foundation (JAG). Vi takker legene. David Holowka og Barbara Baird for antigenet og celler. Vi er takknemlige til Hina Hashmi, Alejandro Velez, og Andrew Abovian for hjelp med utstyr og bestillinger. Dette er Maine Agricultural & Forest Experiment Station publikasjon nummer 3311.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RBL-2H3 Cells

 ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

 Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

 Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

 Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

 Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

 Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

 Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

 Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

 J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

 VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

 Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

 J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

 Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

 Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

 EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

 Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

 Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

 Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

 Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

 VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

 Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

 Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

 VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

 VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

 VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

 VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

 VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

 Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

 BioTek

Module S

Hematocytometer

 Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

 VWR

97042-634

Centrifuge

 Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

 VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

 The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

 ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

 VWR

Range: P2-P1000

Balance

 Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

 Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

 Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

 Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Acetate Buffer, pH 4.4

 Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

 Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

 26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

 135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

 Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
Plastic material used:

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

 VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

 VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

 VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

 VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

 VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

 Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

 Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

 N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

 Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

 Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861 (1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937 (2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

Tags

Immunologi mast celle basofilrelatert degranulation RBL-2H3 triklosan irgasan antibakteriell β-hexosaminidase allergi astma miljøgifter ionophore antigen fluorescens microplate UV-Vis
En Microplate Assay å vurdere Kjemiske Effekter på RBL-2H3 Mast Cell degranulation: Effekter av Triklosan uten bruk av et organisk løsemiddel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H.,… More

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter