Summary
אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology, immunohistochemical,
Abstract
מערכת העצבים enteric היא רשת עצומה של תאי עצב וגליה לאורכו של מערכת העיכול ששולטת תפקודי תנועתיות מערכת העיכול. הליך לבידוד והתרבות של אוכלוסייה מעורבת של תאי עצב וגליה ממקלעת myenteric מתואר. יכולות להישמר בתרבויות העיקריות במשך 7 ימים, עם קשרים המתפתחים בין תאי עצב וגליה. רצועת השריר האורכי עם myenteric מקלעת המצורפת הוא נגזל השריר המעגלי הבסיסי של המעי גס והעכבר או נתון לעיכול אנזימטי. בתנאים סטריליים, האוכלוסייה העצבית וגליה המבודדת נשמרות בתוך צנטריפוגה הבאה גלולה ומצופית על coverslips. בתוך 24-48 שעות, תוצאה neurite מתרחשת ויכול להיות מזוהה על ידי תאי עצב סמני הפאן עצביים. לאחר יומיים בתרבות, פוטנציאל פעולת אש נוירונים בודד כפי שנצפה על ידי מחקרי מהדק תיקון. יתר על כן, גליה enteric יכולה להיות גם identifמטען חבלה על ידי צביעת GFAP. רשת של נוירונים וגליה בפרד קרוב יוצרת בתוך 5 - 7 ימים. נוירונים מעיים יכולים להיות פרטני וישירות נחקרו באמצעות שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה, electrophysiology, הדמיה סידן, ותא בודד PCR. יתר על כן, ניתן לבצע הליך זה בבעלי חיים מהונדסים גנטי. מתודולוגיה זו היא פשוטה לביצוע ולא יקר. באופן כללי, פרוטוקול זה חושף את המרכיבים של מערכת העצבים enteric באופן מניפולציות בקלות, כך שאנו עשויים לגלות טובים יותר את הפונקציונליות של ENS במדינות נורמליות ומחלה.
Introduction
מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצומה של עצבים וגליה שפועלת לכל האורך של מערכת העיכול (GI). ENS פונקציונלי שולט בכל ההיבטים של מערכת העיכול, כולל תנועת מעיים, קליטה / הפרשת נוזלים, תחושה של גירויים, וכו '(לסקירה ראה 1). הוא מכיל מעל 500 מיליון נוירונים, יותר מאשר נמצא בחוט השדרה, והוא מכיל בכל כיתת מוליך עצבי במוח. יתר על כן, ENS הוא ייחודי בכך שהוא יכול לתפקד רפלקסיבי ללא קלט ממערכת העצבים המרכזית 2. הבנה של ENS היא קריטית, לא רק כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי הרגיל שלו, אבל כדי להבין את מעורבותה במגוון רחב של neuropathies אשר יכולה להיות מולדים (מחלת הירשפרונג של), שנרכשה (Chagas), משנית למחלת הברית (gastroparesis הסוכרתי), תרופה המושרה (תסמונת מעי אופיואידים), או עקב פציעה (ileus לאחר ניתוח) 1. בנוסף לכך, תאי עצב מעיים יכולים להיות מחדשservoir לזיהום נגיפי (אבעבועות רוח זוסטר) 3. בגלל דמיונה למוח ואת הרמות הגבוהות של סרוטונין במעיים, לעתים קרובות יש תרופות שנועדו לטיפול בליקויים במערכת עצבים מרכזיים תופעות לוואי בלתי רצויות על ENS 2. זה גם ראוי לציין כי neuropathies רבים כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון מראה שינויים תאיים דומים בתאי העצב, הרבה לפני ההופעה שלהם בתאי עצב מרכזיים המעיים, מה שהופך ENS מודל נגיש ללמוד פתוגנזה של מחלות אלו 4. לכן, הבנה מעמיקה של ENS היא הכרח בהבנת מצבי מחלה ומניעה / ניבוי תופעות לוואי תרופתי.
הנוירונים של ENS נחקרו באופן מסורתי בחזיר באמצעות הכנות wholemount 5-7 או נוירונים בתרבית 8. למרות הקלות שבה ניתן ללמוד נוירונים בחיה הגדולה הזה, מודל זה יש מגבלות רבות, כוללחוסר של זנים מהונדסים גנטי, חוסר של חומרים כימיים ספציפיים למין זה, ואת העלות הגבוהה הקשורה עם ההזמנה ודיור נושאים אלה. יש ההתפתחות של מודל מערכת עצבים enteric עכברי את היתרון הייחודי של דפיקה שונות מתוך מערכות, מגוון רחב של שיטות אחרות שהוקמו, שניתן להשתמש בשילוב עם טכניקת תרבית התאים, ואת היכולת לספק אימות למודל חזיר גינאה .
ENS מורכב משלושה plexi הפועלים אורך של מערכת העיכול: myenteric מקלעת החיצונית (בין השריר האורכי וחוזר) האחראית בעיקר לפעולות הנפיחה של המעיים, כמו גם plexi submucosal והרירי, ( מצא מתחת ובתוך הרירית, בהתאמה), אשר במידה רבה שולטת בקליטה / הפרשת נוזלים וזיהוי של גירויים 1. שיטה זו מתחילה בבידוד של הכנת מקלעת שרירים / myenteric האורך (LMMP) על ידי קילוףאת השכבה החיצונית של השרירים מערכת העיכול. כך יצמצם את הזיהום באופן דרמטי בנושאים שעולים כאשר השכבה הרירית מעורבת בבידוד. כתוצאה מכך, תהליך זה הוא אידיאלי ללימוד שליטה העצבית של תנועתיות ולא פעולות הפרשה של ENS.
השיטה שהוצגה כאן תוצאות בתרבות מעורבת של תאי עצב וגליה מעיים. לפחות שני סוגים שונים של תאי עצב מבוססים על תצפיות בהווה ואלקטרו immunocytochemical קודמות 9. הנוכחות של גליה היא יתרון מאוד, כפי שהם לא רק סוג תא חשוב ללמוד בזכות עצמם, אבל הם תורמים להישרדות של תאי עצב enteric 10 ולשמור על ביטוי הקולטן מולדת על פני התא העצבי 11. יתר על כן, ליקויים של גליה enteric עלולים להוביל למצבים חריגים במערכת העיכול מחלות תנועתיות, טבע 12 'נוירו gliopathies'. לכן, תרבות ENS מוצגת כאן Results בכמה סוגי תאים כי הם בשלים לחקירה.
היתרונות למתודולוגיה זו הם להקל על בידוד, דרישות כלי זולות, וזמן קצר כדי ללמוד את הטכניקה על ידי אנשי מעבדה מנוסים. מגבלות המתודולוגיה כוללות תשואה נמוכה כוללת של תאים מרקמות כרכים גבוהים והרחקה של נוירונים ENS מplexi הרירי וsubmucosal. הליך זה יהיה יתרון מאוד לחוקרים המתמחים באלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, תא בודד PCR, ושיטות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול בבעלי החיים ופרוצדורות היו בהתאם ובאושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת וירג'יניה.
1. הכנת coverslips הזכוכית פולי-D-ליזין וLaminin מצופה סטריליים ב24 גם צלחות
- כל הנהלים לשלב 1 מבוצעים בתנאים סטריליים; מתחת למכסת מנוע, ועם חומרים כימיים סטריליים. coverslips זכוכית והמים deionized כפולים (DDH 2 O) צריכים להיות מעוקרים מראש. הכנת צלחות ניתן לעשות עד שבועיים לפני בידוד תא עצב.
- מתחת למכסה המנוע, להשתמש במלקחיים סטריליים למקום coverslips זכוכית autoclaved ב12 בארות של צלחת 24 באר.
- הכן את מניית פולי-D-ליזין מבעוד מועד. הוסף 50 מ"ל של ddH2O סטרילי עד 5 פולי-D-ליזין מ"ג. וורטקס וחנות ב3 aliquots מ"ל ב -20 ° C. הפשירי aliquots לפני השימוש.
- לריכוז סופי של מניית פולי-D-ליזין 1 מ"ל לכל 25 ס"מ 2: 80 פיפטה μlמניית של פולי-D-ליזין על גבי כל כוס coverslip (2 2 ס"מ). תנו פתרון להתפשר על 10 דקות.
- הסר ואקום באמצעות פולי-D-ליזין ולשטוף coverslips 3x עם סטרילי DDH 2 O.
- לאפשר צלחות להתייבש במשך לפחות שעה 2 מתחת למכסת המנוע.
- צלחות עשויות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או - 20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לציפוי laminin.
- הכן את מניית laminin מבעוד מועד. הפשירי laminin על קרח ולשמור על קרח בעת השימוש. לדלל את ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל; לשים לב לריכוז הרבה, כל מגרש יהיה שונה. בהתאם לריכוז רב, כ 20 מיליליטר DDH 2 O יתווסף לכל בקבוקון של laminin. Aliquot (5 מ"ל) ולאחסן ב -80 ° C. הפשירי aliquots על קרח לפני השימוש.
- coverslips מעיל עם 5 מיקרוגרם / 2 ס"מ; laminin μl פיפטה 200 מניות laminin על כל coverslip.
- דגירה פתרון laminin על coverslips במשך שעה 1.
- לשאוב פתרון laminin שנותר ולשטוף coverslips פעם אחת עםDDH 2 O. הימנע מגירוד פני השטח של coverslips.
- צלחות לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
2. הכנה מראש של Neuron פתרונות בידוד
- הכן את פתרון קרבס (מ"מ: 118 NaCl, KCl 4.6, 1.3 אא 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 11 גלוקוז, ו2.5 CaCl 2). מקום 13.79 גרם NaCl (FW 58.44), 0.686 גרם KCl (FW 74.55), 0.312 גרם לאא 2 PO 4 (FW 120), .289 גרם MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 גר 'NaHCO 3 (FW 84.01), גרם גלוקוז 3.96 (FW 180.2), ו0.555 גרם CaCl 2 (FW 111) ב2 ליטר DDH 2 0. לצנן עד 4 ° C.
- הכן לשטוף תקשורת (F12 תקשורת עם 10% עוברי שור בסרום (FBS) ואנטיביוטיקה / antimycotic): לבקבוק 500 מ"ל של F12 תקשורת, להוסיף 50 מ"ל FBS ו5 מ"ל של נוזל אנטיביוטי 100x / antimycotic (Gibco).
- הכן תקשורת נוירון enteric (Neurobasal מדיה עם B-27, L-גלוטמין,, Neurotr 2 מ"מ 1% FBS 10 ng / ml, גליה נגזרפקטור ophic (GDNF), ונוזלי 100x אנטיביוטיקה / antimycotic). כדי להפוך את מניית GDNF, להוסיף 1 מיליליטר ddH2O לGDNF מיקרוגרם 10 ולהקפיא בחזרה ב50 aliquots μl, חנות ב -80 ° C. לבקבוקון 50 מ"ל של תקשורת נוירון השלם, לשלב 47.5 מ"ל Neurobasal מדיה, 50 מניות 1 מיליליטר B-27 (50x), 500 FBS μl, 500 μl 200 מ"מ L-גלוטמין (Gibco) μl GDNF ו500 אנטיביוטי / μl נוזלי 100x antimycotic. תקשורת נעשית בקבוצות קטנות 50 מ"ל על מנת להבטיח טריות GDNF וכדי למנוע זיהום של כמויות גדולות של תערובת תקשורת סלולארי יקרה זה.
3. קציר הכנת מקלעת שריר / Myenteric אורכית (LMMP) מעכברים
- אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה צריכה להיות במקום לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. עכברים וובסטר שוויצרי למבוגרים במשקל מעל 25 גרם (בדרך כלל מעל 8 שבועות של גיל) הם שוכנו בקבוצות של 6 לפני ניסויים. רקמות משני עכברים המשמשות לבידוד של נוירונים enteric ileal וגליה ושלושה עכברים משמשיםבידוד של תאי מעי הגס.
- הכן את אזור ניתוח. אסוף את המספריים קטנים כירורגיות, מלקחיים זווית, צמר גפן, שלוש כוסות זכוכית 200 מ"ל, ומוט זכוכית / פלסטיק (מכחול). ודא כי כל הציוד נשטפים ביסודיות ושטף לפני השימוש כדי למזער את הזיהום. צעד זה יכול להתבצע ביום שלפני הניסוי.
- הנח פתרון קרבס על קרח ואת הבועה עם carbogen (חמצן 95%, 5% CO 2) במשך לפחות 30 דקות כדי לייצב את רמת החומציות.
- הפעל ציוד שונים וכימיקלים חמים לייצב בטמפרטורות רצויות; אמבט מים חום (ים) עד 37 מעלות צלזיוס צנטריפוגות מגניבה, עד 4 מעלות צלזיוס, מקום הפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) וטריפסין 0.5% באמבט מים (37 מעלות צלזיוס ). תקשורת נוירון השלמה ומדיה לשטוף צריכה להישאר בקירור.
- קרח קר מקום 150 מ"ל בעבע קרבס בשלוש כוסות זכוכית 200 מ"ל שכותרתו 'מלוכלכת', 'נקי', ו 'LMMP'. כוס בועה שכותרתו 'LMMP' עם carbogen.
- בעקבות אישור מועדת אתיקה, להרדים מ 'ouse על ידי נקע בצוואר רחם או במשותף מחנק 2.
- מקם את העכבר בrecumbence הגבי על פני השטח, עור נקי כירורגית עם EtOH 70%, ולהרים את עור בטן באמצעות מלקחיים. בעזרת מספריים, חלל בטן פתוח ולחשוף את איברי עיכול פנימיים.
- הסר את האורך של מערכת העיכול על ידי הרמת חלק של מעי ומגלה לפדרו. חיתוך באמצעות לפדר עם מספריים כדי להסיר בעדינות ולפענח מעי ומעי גס, נזהר שלא למשוך לפדר מהמעי / המעי הגס.
- לאחר באורך המלא של מעי נפרם, הסר את המעי על ידי חיתוך דרך המעי הדיסטלי ולקיבת פרוקסימלי לcecum. הערה: הליך זה יכול גם להתבצע עם רקמת המעי הגס על ידי הסרת המעי הגס דיסטלי לcecum להפרוקסימלי ל פי הטבעת.
- רקמות ניתן לחלוקה נוספת בין מעי גס הפרוקסימלי ודיסטלי, וjejenum, ומעי. שאר הליך זה יתייחס לבידוד של המעי; לאהוא התהליך זהה לבידודה של LMMP מעי גס. הנח את כל המעי במכל זכוכית עם הקרח הקר קרבס מסומן 'מלוכלך'.
- ליצור כלי לניקוי המעי; בוטה מחט גדולה 20 G באמצעות אבן הגשה ולצרף אותו למזרק גדול (10 מ"ל) המכיל קרח קר קרבס.
- יש לנקות את צואה מהמעי על ידי חתך המעי לשלוש או יותר חתיכות גדולות. הסר סעיף ileal מהכוס ומניח את המחט הקהה לסוף פיסת ileal.
- בעדינות תריץ את קרבס דרך סעיף הבטן עד שכל החומר צואתי יוסר לתוך מיכל פסולת נפרד. הנח את הסעיף ניקה לתוך המכל של קרבס המסומן "נקי". חזור על פעולה עד כל המעי הוא ניקה.
- כדי להסיר LMMP, לחתוך את המעי למקטעים קטנים, כ 4 - 2 ס"מ. הנח קטע של מעי בפלסטיק או מוט זכוכית; מעי צריך להתאים מלבב, אבל לא יהיה רופף או מתוח (~ 2 מ"מ). בגין הסרת LMMP בעדינות על ידי הסרת פיסות לפדר עדיין לצרףאד לדרכים (GI) במערכת העיכול באמצעות מלקחיים. למנוע את מערכת העיכול ממסתובב סביב מוט בעדינות על ידי הצמיד לצינור המוט באמצעות האגודל.
- הפרד LMMP מהשריר מעגלי הבסיס; ראשון לשפשף בעדינות את הקצה של המלקחיים לאורך כל הקו שבו לפדר צורף, מלמעלה עד למטה של המגזר, בעדינות יוצר פער בשריר האורכי. ואז בעדינות להקניט אחד את השריר האורכי באמצעות מקלון צמר גפן רטוב עם קרבס.
- מתחיל בחלק העליון של הפער בשריר האורכי ולהקניט מרחק באמצעות שבץ האופקי הקל תוך הפעלת לחץ קל מאוד עד שהשריר האורכי רק מתחיל להיפרד מהשריר המעגלי; לעשות את זה לאורך כל הרצועה לאורך נקודת החיבור לפדר.
- ואז בעדינות מתחיל לעקוף את צינור העיכול; נע מלמעלה למטה ובחזרה כמו השריר האורכי מופרד לאט מהשריר המעגלי כל הדרך סביב הצינור. כאשר שלם,LMMP יבוא ממני באופן טבעי את השארית של צינור העיכול.
- מניחים הרצועה דקה כתוצאה של שריר האורכי בכוס המסומנת "LMMP '. חזור על פעולה עבור כל המגזרים.
- לאחר שכל הרצועות של LMMP כבר נאספו מעכבר אחד, חזור על תהליך עבור כל עכברים אחרים בשימוש. יש לשטוף היטב את הכוסות 'מלוכלכות' ו 'נקיות' לפני השימוש חוזר.
- יש לשטוף את LMMP 3x להסיר זיהום ביולוגי. מלא שלושה 2 מ"ל אפנדורף צינורות עם הקרח הקר קרבס. מניחים את רצועות LMMP בצינור הספין הראשון במשך 30 שניות ב356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C. מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ולהעביר את רצועות LMMP לצינור מלא נקי קרבס הבא. חזור על תהליך זה עבור כל צינור הנותר.
4. תקציר LMMP
- הכן את פתרון עיכול על ידי הצבת 13 מ"ג collagenase סוג 2 ו 3 מ"ג BSA בcarbogen-בעבע פתרון 10 מ"ל קרבס.
- מגזרי מקום LMMP השטוף לפתרון עיכול וscis שימושsors כדי לגזור LMMP לחתיכות קטנות.
- תקציר LMMP למשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם שייקר בזמן שמבעבע בעדינות עם carbogen.
- לאחר העיכול יושלם, לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ל8 דקות ב 356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C.
- מכאן ולהבא צריכים לעשות את כל ההליכים בתנאים סטריליים במכסת מנוע תרבית תאים! כל חומרים כימיים ומכלי צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש.
- במהלך צנטריפוגה, להכין פתרון טריפסין 0.05% על ידי הצבת 1 מ"ל חימם טריפסין 0.25% ו 4 מ"ל חימם HBSS לתוך צינור תא 50 מיליליטר סטרילי תרבות.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. לא להשתמש בשואב אבק, זה כנראה יהיה למצוץ את התא גלולה עקב מהירויות נמוכות צנטריפוגה. מוציא בזהירות את התא גלולה והמקום לתוך צינור נקי עם 5 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.05%.
- לעכל את התאים בתמיסת טריפסין 0.05% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם הרעד במשך 7 דקות. לא תעלה על 7 ק"מn טיפול טריפסין מוחלט או נוירונים יאבדו.
- לנטרל טריפסין עם 10 מ"ל של תקשורת לשטוף קרה אחרי 7 דקות של הטיפול בטריפסין.
- צנטריפוגה תאים ל8 דקות ב 356 x גרם. להסיר ולסלק תקשורת.
- במהלך צנטריפוגה, לאזן את קטע של רשת Nitex עיקור על גבי תא צינור 15 מ"ל סטרילי תרבות.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. בעדינות תערובת תאי resuspend ידי triturating ב3 תקשורת נוירון שלמה מ"ל. הימנע מיצירת בועות אוויר בשלב זה וכל הצעדים העתידיים שבו תערובת תא triturated. צריך לעשות את כל triturations בעדינות רבה. פתרון תא סינון דרך Nitex הרשת לתוך צינור 15 מיליליטר תרבית תאים הנקי.
- אופציונלי: צינור תרבית תאים שווי ומניח במיקסר חולה בקירור (או כל מיקסר המספק סיבוב) עם גלגול והטיה עדינים למשך 30 דקות. שלב זה הוא אופציונלי, אך מומלץ.
- אופציונלי: לאחר מיקסר חולה, להוסיף 2 תקשורת לשטוף קרה מ"ל לשטוף את התאים.
- לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה (8 דקות, 356 XG). להסיר ולהשליך supernatant.
- Resuspend תאים ב-1,200 תקשורת נוירון המלאה μl. Triturate תאים בעדינות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק 1 מ"ל. לא ליצור בועות אוויר. פיפטה לאט ובעדינות עד שרוב הגושים שבורים ותאים מושעים לנוזל.
- הוסף 750 μl של מדיה מלאה לכל אחת מהבארות המכילות 12 coverslip זכוכית מצופה מראש ולהוסיף 100 μl של פתרון תא triturated.
- דגירה נוירונים בתרבית תאי חממה ב 37 ° C עם 5% CO 2.
- שינוי מחצית התקשורת הסלולרי כל 2 ימים.
- הנוירונים הם מוכנים להקלטות אלקטרו לאחר 1 - 2 ימים בתרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מייד לאחר הבידוד של תאים שמקורם LMMP, נוירונים וסוגי תאים אחרים לא יהיה מוכן מאליו. חיים, ניתן לראות תאים עגולים של הפנוטיפ לא ברור, כמו גם שאריות רקמה מברי רקמה מתעכלים חלקי ורקמות חיבור. סחופה זה לא עניין ויוסרה במידה רבה עם שינוי התקשורת הראשונה ביומיים. אל תנסו לנקות את השקופיות לפני זה כמו התאים הבריאים, קיימא יוסרו גם כן.
אחרי יום אחד בתרבות, הנוירונים יתחילו להראות תוצאה neurite. זיהוי ספציפי של תאי עצב עדיין עשוי להיות לא ברור בשלב זה. סיפק את התאים הם חסיד מספיק כדי להעביר לתא ניסוי, הם יהיו מוכנים ללימוד אלקטרו לאחר יום אחד של התרבות. עם זאת, התאים הם חסיד יותר אחרי יומיים בתרבות ואידיאלי למחקרים לתפקד (electrophysiology, הדמיה סידן) מימים כ 5 - 2.
אף אוזן גרון "> תכונות מורפולוגיות של נוירון הפכו ברורה לאחר כשבוע בתרבות (איור 1). ניתן לזהות תכונות immunocyctochemical אידיאלית לאחר כעשרה ימים, כאשר נוירונים להציג תחזיות ארוכות ולגדול בכמעט 'ganglionic' כמו אופנה וביניהם גליה ( איור 2). מכתים זו מרמז זה עשוי להיות אפשרי כדי ללמוד את האינטראקציות הסינפטי של תאים אלה באמצעות מתודולוגיה זו.אחרי יום אחד בתרבות, נוירונים מוכרים על ידי סינוס que אינו או 'מאפיין', פוטנציאל הפעולה (איור 3). Electrophysiologically, הם יכולים להיות מסווגים באופן פונקציונלי לפחות לשני סוגים: נוירונים עצביים המכילים לאחר hyperpolarization והגדילו את היחסים הנוכחיים / צפיפות של נתרן ואשלגן ותאי עצב שאין להם לאחר hyperpolarization ומשמעותי פחות נתרן ואשלגן מוליכות (איור 4). n חיובי והשלילי Ahpeurons יופיע לתאם עם AH ונוירונים S ראו בעבודת פן הקודמת, בהתאמה. תאי עצב (נוירונים חיוביים Ahp אה) יש השלכות ארוכות מרובות שמקורם מכל רחבי גוף התא, ואילו נוירונים השליליים Ahp (S נוירונים) יש השלכה ארוכה אחד שבו ענפי פעמים רבות. זה, בשילוב עם קידוד immunocytochemical בתרשים 1, עולה כי אוכלוסייה עצבית היא מאוד הטרוגנית.
איור 1. אפיון immunohistochemical של נוירונים מעיים וגליה שבודדו מהשריר האורכי העכבר. מיקרוסקופיה Confocal חשף β-III-טובולין מכתים עצבי ספציפי (Abcam, ארנב, 1:1,000) בכל שריר האורכי הר ileal (א) הכנה מהעכבר. תאים מבודדים מLמקלעת ongitudinal שרירים / myenteric (LMMP) הכנות מכילות תאי עצב (B; β-III-טובולין, Abcam, ארנב, 1:1,000) שמכתימים באופן חיובי לcalbindin (ג) (Chemicon, ארנב, 1:1,000) וcalretinin (ד ') (Swant, ארנב, 1:2,000). תאי גליה (ה) היו דמיינו עם סמן GFAP גליה הספציפי (Chemicon, עכבר, 1:500). נוגדנים היו דמיינו באמצעות נוגדנים משני עיזים המתאימים Alexa 488 (בדיקות מולקולריות, ירוקים, 1:1,000) 0. גרעינים היו דמיינו באמצעות Hoescht 33342 (כחול, CG, 1 מיקרוגרם / מ"ל). לא מכתים נתפס כאשר נוגדן ראשוני הושמט (F). . שונה והודפס מחדש מסמית, TH, et al מורפיום מפחית רגישות Neuron מעיים באמצעות עיכוב של תעלות נתרן PLoS ONE, דוי:... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה <./ P>
איור 2. תאי עצב וגליה שבודדו מהשריר האורכי העכבר לגדול בסמיכות זה לזה. תמונות מיקרוסקופיה confocal מצביעות הנוירונים (ירוק,-III-טובולין β, Abcam, ארנב, 1:1,000) וגליה (אדום, GFAP, Chemicon, עכבר , 1:500) לגדול בקלות סמוכים זה לזה ויופיע לאינטראקציה במבחנה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. Electrophysiology של נוירונים בתרבית מעיים וגליה. במ"קמצב מהדק rrent, כל הנוירונים () מוצגים פוטנציאל פעולה על זריקה נוכחית. גליה אין לי (ב) פוטנציאל פעולה אבל אל תציג פוטנציאלי electrotonic גדולים בתגובה להזרקת זרם. פרוטוקולים בתחילת אלף לקוחות עם הזרקה נוכחית של -0.01 Na ולהגדיל ל 0.09 NA בעשרה צעדי 0.01 Na. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. נוירונים בתרבית ממעי העכבר הם אוכלוסייה הטרוגנית electrophysiologically. במצב הנוכחי מהדק, הזרקה נוכחית של 0.09 NA לתוצאות נוירונים בפוטנציאל פעולה. S הנוירונים (א '), באופן מיידי לחזור לF פוטנציאל הממברנה במנוחהollowing גירוי. סוג AH-הנוירונים (ב) להציג afterhyperpolarization (אח"פ) בעקבות גירוי שבו פוטנציאל הממברנה במנוחה יורד מתחת קו בסיס לפני שחוזר לאט לערך הראשוני. . שונה והודפס מחדש מסמית, TH, et al מורפיום מפחית רגישות Neuron מעיים באמצעות עיכוב של תעלות נתרן PLoS ONE, דוי:.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעלי חיים המשמשים
פרוטוקול זה כבר מותאם לעכברים וובסטר שוויצרי. עם זאת, שיטה זו היא להתאמה בקלות ליונקים אחרים בינוני וקטנים כגון חולדות ולזנים אחרים של עכברים. יש לנו לבצע בהצלחה בידודים ראשוניים עם C57 עכברים וקולטניים μ-אופיואידים לדפוק-outs. עם זאת, ייתכן גם שזנים אחרים של עכברים עשויים להיות בעייתיים עקב שינויים מורפולוגיים במערכת העיכול. יתרה מזאת, קיימים הבדלים בין זני עכבר ידועים (C57BL / 6 לעומת BALB / ג) במעגלים עצביים של הכנת LMMP 13, אשר יכול להשפיע על תמהיל כתוצאה מכך של תאי עצב בבידוד הסופי. בנוסף, גיל צריך להילקח בחשבון בעת שימוש בשיטה זו, כהפסדים עצביים הקשורות לגיל להתרחש במקלעת myenteric שהם ספציפיים לתאי עצב וגליה cholinergic המקבילה שלהם, וניתן לראות כבר בגיל 12 חודשי 14. לבסוף, כאשר פרוטוקול זה התאמה למפרט אחרES של בעלי חיים, יש לנקוט זהירות כדי להבטיח שמקלעת myenteric מגיעה משם עם שריר האורכי ולא נותר מחובר לשריר המעגלי.
רקמה משומשת
יכולים להיות מתורבתים נוירונים וגליה הן מהמעי והמעי הגס באמצעות פרוטוקול זה. בידודי ileal הם קלים יותר לביצוע בשל כמות גדולה יותר של רקמה זמינה ואת הקלות שבה השריר האורכי מפריד מהשריר העגול העבה. לפחות שני בעלי חיים יש צורך לכבוש 12 בארות של צלחת 24 גם עבור יישומים כגון electrophysiology או immunocytochemistry. הבידוד של חומר הגס הוא בעייתי יותר. השריר האורכי הגס העבה קשה יותר להיפרד מהשריר המעגלי. יתר על כן, השריר המעגלי הבסיסי הוא דק יותר במעי הגס, מה שהופך אותו רגיש יותר לדמעות. כמו כן, המעי הגס הוא קצר יותר באופן משמעותי מהמעי ולכן שלושה בעלי חיים, לכל הפחות, נדרשים לכבוש 12 welLS של צלחת 24 באר. גם על המעי והמעי הגס ניתן לקצור ומצופים בנפרד מאותה החיה, אבל בעלי חיים נוספים, או על השימוש של פחות שטח ציפוי תא יידרשו לבידוד המעי הגס.
משך הפעילות של תרבית תאים
קלטות אלקטרו מבוצעות בצורה אופטימלית בתאי עצב enteric / גליה מבודדות לאחר 2 עד 6 ימים בתרבות; בשלב זה תאים הם תנאים מעוגלים וגמישים, אידיאליים ליצירת חסימה כל תא. אחרי שבוע בתאי התרבות הפך שטוח יותר ומובחן יותר מבחינה חזותית כמו התאים לדבוק בצלחת. ניסויי immunocytochemical הם הטובים ביותר נעשים כאשר תאים מחוברים בתקיפות רבה יותר לצלחת, סביב 10 יום, על מנת למנוע אובדן תא במהלך שלבים לשטוף רבים. תאי מעי עכבר נשמרו בתרבות לתקופה של עד שלושה שבועות. דפוסים של קולט וביטוי הנוירוטרנסמיטר לאורך זמן עדיין לא למדו בתרבויות אלה. עם זאת, מחקרים קודמים על הישרדות עצביתוביוכימי / מורפולוגי בידול בבידודי נוירון enteric מסורתיים פן ניסיונות מצאו כי הנוירונים שרדו עד 15 ימים ולשמור עד שלושה שבועות 8, אשר טוען כי תאי עצב שמקורם ממקורות בעלי חיים אחרים יכולים לעשות את אותו הדבר ברמה גבוהה של מאפייני histochemical ומורפולוגי .
תשואת תא
התשואה הכוללת של תאים מטכניקה זו היא 12 בארות של צלחת 24 גם משני עכברים כאשר מבודדים מהמעי. זהו מספר נמוך יחסי של תאי עצב בהשוואה לנפח רקמה, כמו מקלעת myenteric מורכבת מפחות מ -1% של קיר הבטן כולה. חסרון אחד לשיטה זו הוא שכדי להגדיל את מספר התאים שהושגו, יש להגדיל את מספר בעלי החיים המשמשים. כאשר מספרים בבעלי החיים גדלו, הוא הציע שכמה מחברי מעבדה לשתף פעולה בשלב הראשון של הבידוד של LMMP. פעולה זו מפחיתה את כמות הזמן שהתאים נמצאים במדינה שיבשו לפני עמ 'הסופיlating והישרדות תא עלייה זו.
צפיפות תאים
כפי שנכתב, פרוטוקול זה משתמש בשתי חיות להניב בידוד ileal של מפגש תא בצפיפות נמוכה (~ 10 - 40% נמדדו לאחר יום אחד בתרבות). ציפוי תא בצפיפות נמוכה הוא אידיאלי במתודולוגיה זו כדי להפחית את הסיכון לזיהום בתרבות הסופית. זה גם שימושי כאשר electrophysiology תא הבודד מתבצע. מספר התא יכול להיות מוגבר על ידי שימוש בבעלי חיים נוספים או להקטין את שטח הציפוי הסופי, אבל הסיכון עולה זיהום. ליצא בעיה זו כאשר צפיפות תא גבוהה יותר נדרשות, בין אם גדל שטיפת מדרגות, או על השימוש המוגבר באנטיביוטיקה הוא הציע.
הטרוגניות סלולרי
נוירונים שנרכשו תוך שימוש בפרוטוקולים אלו מורכבים לפחות שתי אוכלוסיות שונות מבחינה תפקודיות, כפי שצוינו על ידי אפיון אלקטרו (איור 3). עם זאת, יש הרבה סוגים ידועים של נוירונים עם דפוסי קידוד neurochemical ספציפיים שנמצאו בפן הניסיונות של 15 ואותו הדבר הוא כנראה נכון של העכבר. ההטרוגניות התא הזה היא גם יתרון וגם חסרון למתודולוגיה זו. ההטרוגניות תא מועילה בעת ביצוע מחקרים התפקודיים תא בודד, התבוננות תאי תאי אינטראקציות או בimmunocytochemistry, בין יתר. ההטרוגניות סלולרי עשויה להיות מועילה במיוחד כאשר לומדים אינטראקציות נוירון / גליה בתרבות (איור 3). עם זאת, ההטרוגניות תא היא מכשול למתודולוגיות כגון immunoblotting, שבו שינויים בביטוי חלבונים, וכו ', לא יכולים להיות שנתרמו לכל סוג תא אחד או סוג תא עצב. בחינה של גליה תהיה פחות בעייתית כמו שרק שני תת מוצגים להתקיים בהכנת LMMP: גליה enteric 16 intraganglionic ותוך שרירית. סוגי תאים אחרים עשויים להיות נוכחים גם בתרבות זו, כגון תאי ביניים של Cajal או fibroblasts.
"> תאי ציפוי epבמתודולוגיה זו, תאים צופה בעשר בארות. מדי פעם, אחת או שתיים מהבארות הללו יתפתח זיהום ביום הראשון לאחר בידוד. במקרה זה, השקופיות מהבארות מזוהמות מבוטלות מייד וגם הוא שטפו עם אתנול 70% כדי להרוג את הזיהום שנותר. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי צלחת כל התאים המבודדים בפחות בארות או בצלחת אחת, וכתוצאה מכך, הסיכון לזיהום יגדל. שוב, כאשר את הסיכונים של עליית זיהום, צעדים לשטוף נוספים או שימוש באנטיביוטיקה מוגברת הוא הציע. הנוזל האנטיביוטי / antimycotic (Gibco) המשמש בפרוטוקול מורכב מAmphotericin B, סטרפטומיצין, ופניצילין. שילובים אנטיביוטיים אחרים או ריכוזים מוגברים יכולים לשמש גם כדי לייעל את ההפחתה של זיהום בעת ההכנה לשטוף ולהשלים תקשורת נוירון.
תאים הצמודות
תאים צופה עלcoverslips מצופה laminin ופולי-D-ליזין. Laminin חשוב בהישרדותם של תאי עצב וגליה מעיים, ומעודד את התוצאה neurite והתפתחות עצבית 17, ובתור שכזה, הוא נחשב חיוני לבידוד הזה. עם זאת, גורמי התקשרות חלופיים לפולי-D-ליזין, כגון ornithine או Matrigel, עלולים להישפט המועדפים.
לסיכום, זה מספק בידוד תרבות מעורבת של תאי עצב וגליה מתאימה למגוון רחב של טכניקות לימוד מעיים. מתודולוגיה זו היא קלה להורים, לא יקר, והזמן יעיל. תקוותנו הוא שמודל תא זה יתרום להבנה של פתולוגיות שונות הקשורים ENS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים גדולים קיימים.
Acknowledgments
המכון הלאומי לבריאות גרנט DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
