Abstract
Het enterische zenuwstelsel is een uitgebreid netwerk van neuronen en glia in de lengte van het maagdarmkanaal die functioneel controleert motiliteit. Een procedure voor het kweken van een gemengde populatie van neuronen en glia van de myenterische plexus beschreven. De primaire kweken kan worden gehandhaafd gedurende meer dan 7 dagen, met verbindingen te ontwikkelen tussen de neuronen en gliacellen. De longitudinale spier strip met de bijgevoegde myenterische plexus wordt uit de onderliggende kringspier van de muis ileum of colon en onderworpen aan enzymatische digestie. In steriele condities worden de geïsoleerde neuronale en glia bevolking conserven in de volgende pellet centrifugeren en uitgeplaat op dekglaasjes. Binnen 24-48 uur, neurietuitgroei optreedt en neuronen kunnen worden geïdentificeerd door pan-neuronale markers. Na twee dagen in cultuur, geïsoleerde neuronen vuren actiepotentialen zoals waargenomen door de patch clamp studies. Bovendien kan enterische glia ook identified door GFAP kleuring. Een netwerk van neuronen en glia in nauwe appositie vormt binnen 5-7 dagen. Enterische neuronen kan individueel zijn en direct bestudeerd met behulp van methoden zoals immunohistochemie, elektrofysiologie, calcium beeldvorming, en single-cell PCR. Bovendien kan deze procedure worden uitgevoerd in genetisch gemodificeerde dieren. Deze methode is eenvoudig uit te voeren en goedkoop. Kortom, dit protocol onthult de componenten van het enterische zenuwstelsel in een gemakkelijk gemanipuleerde wijze zodat wij beter de functionaliteit van de ENS in normale en ziektetoestanden ontdekken.
Introduction
Het enterische zenuwstelsel (ENS) is uitgebreid netwerk van zenuwen en glia die de volledige lengte van de gastro-intestinale (GI) stelsel loopt. De ENS controleert functioneel alle aspecten van de spijsvertering, zoals peristaltiek, vocht absorptie / secretie, gevoel van prikkels, enz. (voor een overzicht zie 1). Het bevat meer dan 500 miljoen neuronen, meer dan in het ruggenmerg, en bevat elke klasse neurotransmitter in de hersenen. Bovendien is de ENS uniek omdat het reflex kan functioneren zonder input van het centrale zenuwstelsel 2. Begrip van de ENS cruciaal, niet alleen de normale fysiologische rol te begrijpen, maar anderzijds aan een verscheidenheid van neuropathieën die aangeboren kan zijn (de ziekte van Hirschsprung), verworven (Chagas), secundair aan ziekten (diabetische gastroparese), te doorgronden geïnduceerde (Opioid bowel syndrome), of als gevolg van letsel (postoperatieve ileus) 1. Bovendien kan een enterische neuronen zijn reservoir voor virale infectie (varicella zoster) 3. Vanwege de overeenkomsten met de hersenen en de hoge niveaus van serotonine in de darm, medicijnen ter behandeling van centraal zenuwstelsel defecten vaak ongewenste neveneffecten op de ENS 2. Het is ook opmerkelijk dat veel neuropathieën zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson vertonen gelijkaardige cellulaire veranderingen in het enterische neuronen lang voordat de verschijning in centrale neuronen, waardoor de ENS een toegankelijke model voor de pathogenese van deze ziekten 4 bestuderen. Daarom is een grondig begrip van de ENS een noodzaak in het begrijpen van ziekten en het voorkomen / voorspellen farmacologische bijwerkingen.
De neuronen van de ENS oudsher bestudeerd in de cavia met wholemount voorbereidingen 5-7 of gekweekte neuronen 8. Ondanks het gemak waarmee neuronen worden bestudeerd in deze grote dieren, dit model heeft vele beperkingen waaronderontbreken van genetisch gemodificeerde stammen, gebrek aan reagentia species-specifiek, en de hoge kosten verbonden met bestellen en huisvesten deze onderwerpen. De ontwikkeling van een murine enterische zenuwstelsel model heeft het unieke voordeel van de verschillende knock-out-systemen, een breed scala van andere gevestigde methodologieën die kunnen worden gebruikt in combinatie met de celkweek technieken en de mogelijkheid om een validatie van het caviamodel .
De ENS bestaat uit drie plexi dat de lengte van het maagdarmkanaal uitvoeren: de buitenste myenterische plexus (tussen de langs kringspier) die voornamelijk verantwoordelijk zijn voor de peristaltische werking van de darm, en de submucosale en mucosale plexi, ( gevonden onder en in de mucosa, respectievelijk) die grotendeels beheerst fluïdumabsorptie / secretie en detectie van stimuli 1. Deze werkwijze begint met de isolatie van de longitudinale spier / myenterische plexus (LMMP) voorbereiding door pellende buitenste spierlaag van het maagdarmkanaal. Dit drastisch worden naar contaminatie die ontstaan wanneer de mucosale laag is betrokken bij de isolatie. Hierdoor is deze werkwijze geschikt voor de studie van neuronale controle motiliteit plaats secretoire acties van de ENS.
De hier gepresenteerde methode resulteert in een gemengde cultuur van enterische neuronen en gliacellen. Ten minste twee verschillende typen neuronen momenteel gebaseerd op eerdere waarnemingen elektrofysiologische en immunocytochemische 9. De aanwezigheid van glia is zeer voordelig, aangezien zij niet alleen een belangrijk celtype te bestuderen op zich, maar bijdragen tot het overleven van de enterische neuronen en 10 natuurlijke receptor expressie op het celoppervlak neuronale 11 handhaven. Bovendien kunnen tekortkomingen van enterische glia leiden tot abnormale maagdarmmotiliteit ziekte staten, bedacht 12 'neuro-gliopathies'. Daarom is de ENS cultuur hier gepresenteerde resultaten in verschillende celtypen die zijn rijp voor onderzoek.
De voordelen van deze methode zijn gemak van isolatie, goedkoop instrument eisen en kort de techniek beheersen door ervaren laboratoriumpersoneel. Beperkingen van de methodologie zijn lage algemene cel opbrengst van hoge volumes weefsel en de uitsluiting van ENS neuronen van mucosale en submucosale plexi. Deze procedure zal zeer voordelig zijn om wetenschappers gespecialiseerd in elektrofysiologie, immunohistochemie, eencellige PCR en andere methodieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
