Abstract
Det enteriske nervesystem er et stort netværk af neuroner og glia kører længden af mavetarmkanalen, der funktionelt kontrollerer gastrointestinal motilitet. En fremgangsmåde til isolering og dyrkning af en blandet population af neuroner og glia fra plexus myentericus beskrives. De primære kulturer kan opretholdes i over 7 dage, med forbindelser udvikler blandt neuroner og glia. Den langsgående muskel strimmel med vedlagte plexus myentericus strippes fra den underliggende cirkulære muskel af musen ileum eller colon og underkastet enzymatisk fordøjelse. Under sterile forhold, er den isolerede neuronale og glia befolkning bevaret i pellet følgende centrifugering og belagt på dækglas. Inden for 24-48 timer, opstår neuritvækst og neuroner kan identificeres ved pan-neuronale markører. Efter to dage i kultur, som isolerede neuroner brand virkningspotentialer observeret af patch clamp-forsøg. Endvidere kan enteriske glia også være identifIED af GFAP-farvning. Et netværk af neuroner og glia i nært apposition danner inden for 5 - 7 dage. Enteriske neuroner kan være individuelt og umiddelbart studeret ved anvendelse af metoder såsom immunhistokemi, elektrofysiologi, calcium billedbehandling og encellede PCR. Endvidere kan denne procedure udføres i genetisk modificerede dyr. Denne metode er enkel at udføre og billig. Samlet denne protokol udsætter komponenterne i det enteriske nervesystem i en let manipuleres måde, så vi bedre kan opdage funktionaliteten af ENS i normale tilstande og sygdomstilstande.
Introduction
Det enteriske nervesystem (ENS) er store netværk af nerver og gliaceller, der løber hele længden af den gastrointestinale (GI) kanal. ENS funktionelt styrer alle aspekter af fordøjelsen, herunder peristaltikken, flydende absorption / sekretion, fornemmelse af stimuli osv. (til gennemgang se 1). Det indeholder over 500 millioner neuroner, mere end fundet i rygmarven, og indeholder hver neurotransmitter klasse findes i hjernen. Desuden ENS er enestående, fordi det kan fungere refleksivt uden input fra centralnervesystemet 2. Forståelse for ENS er afgørende, ikke kun for at forstå dens normale fysiologiske rolle, men for at forstå sit engagement i en række neuropatier, som kan være medfødt (Hirschsprungs sygdom), erhvervet (Chagas), sekundært til sygdomstilstande (diabetisk gastroparese), drug -induceret (Opioid tyktarm), eller på grund af skade (postoperativ ileus) 1.. Desuden kan enteriske neuroner være en reservoir mod virusinfektion (varicella zoster) 3.. På grund af dens ligheder til hjernen og de høje niveauer af serotonin i tarmen, ofte medicin rettet mod behandling af centralnervesystemet defekter har uønskede bivirkninger på ENS 2.. Det er også bemærkelsesværdigt, at mange neuropatier såsom Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom viser lignende cellulære ændringer i enteriske neuroner længe før deres udseende i centrale neuroner, hvilket gør ENS en tilgængelig model til at studere patogenesen af disse sygdomme 4. Derfor er en grundig forståelse af ENS er en nødvendighed i at forstå sygdomstilstande og forebygge / forudsige farmakologiske bivirkninger.
Neuronerne i ENS traditionelt har været undersøgt i marsvin hjælp wholemount præparater 5-7 eller dyrkede neuroner 8.. Trods den lethed, hvor neuroner kan studeres i denne store dyr, har denne model mange begrænsninger, herundermangel på genetisk modificerede stammer, manglende reagenser specifikke for denne art, og de høje omkostninger forbundet med at bestille og boliger disse fag. Udviklingen af en murin enteriske nervesystem model har den unikke fordel af forskellige knock out systemer, en bred vifte af andre etablerede metoder, som kan bruges i forbindelse med cellekultur teknik, og evnen til at give en validering for marsvin model .
ENS består af tre plexiglas, der kører længden af mavetarmkanalen: den ydre myentericus plexus (mellem den langsgående og cirkulær muskel), som primært er ansvarlig for de peristaltiske handlinger i tarmen, samt det submukøse og mucosale plexi, ( findes under og i slimhinden, henholdsvis) som stort set styrer væskeabsorption / sekretion og påvisning af stimuli 1.. Denne metode begynder med isolering af den langsgående muskel / myentericus plexus (LMMP) fremstilling ved skrælningdet ydre muskel lag af mavetarmkanalen. Dette dramatisk skærer ned på forurening problemer, der opstår, når slimhindelaget er involveret i isolation. Som en følge heraf, er denne proces ideel til undersøgelse af neuronale kontrol af motilitet snarere end sekretoriske handlinger ENS.
Fremgangsmåden præsenteres her resulterer i en blandet kultur af enteriske neuroner og glia. Mindst to forskellige typer af neuroner er til stede baseret på tidligere elektrofysiologiske og immuncytokemiske bemærkninger 9. Tilstedeværelsen af glia er meget fordelagtig, da de ikke kun er en vigtig celletype at studere i deres egen ret, men de bidrager til overlevelsen af de enteriske neuroner 10 og vedligeholde nativ receptor expression på den neuronale celleoverflade 11. Desuden kan mangler enterisk glia føre til unormale gastrointestinale motilitet sygdomstilstande, opfundet 'neuro-gliopathies' 12.. Derfor ENS kultur præsenteres her rESULTATER i flere celletyper, der er moden til undersøgelse.
De fordele ved denne metode er nem isolation, billigt værktøj krav og en kort tid at mestre teknikken af erfarne lab personale. Begrænsninger af den metode omfatter lav samlet celleudbytte af høje væv mængder og udelukkelse af ENS neuroner fra slimhinden og submucosa plexi. Denne procedure vil være yderst fordelagtigt at forskere med speciale i elektrofysiologi, immunhistokemi, enkelt-celle PCR og andre metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrepleje og eksperimentelle procedurer var i overensstemmelse med og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Virginia Commonwealth University.
1.. Fremstilling af sterile poly-D-lysin-og laminin-coatede dækglas i 24-brønds plader
- Alle procedurer for trin 1 udføres under sterile forhold under en emhætte, og med sterile reagenser. Dækglas og dobbelt deioniseret vand (ddH2O) bør steriliseres på forhånd. Fremstilling af plader kan gøres op til to uger før neuron isolation.
- Under hætten, sterile pincet til at placere autoklaverede dækglas i 12 brønde i en plade med 24 brønde.
- Forbered poly-D-lysin lager i forvejen. 50 ml sterilt ddH2O til 5 mg poly-D-lysin. Vortex og butik i 3 ml alikvoter ved -20 ° C. Tø alikvoter før brug.
- Til en slutkoncentration på 1 ml poly-D-lysin lager pr 25 cm 2: pipette 80 piaf poly-D-lysin lager på toppen af hver dækglas (2 cm2). Lad løsning nøjes med 10 min.
- Fjern poly-D-lysin anvendelse af vakuum og skyl dækglas 3x med steril Hedeselskabet 2 O.
- Lad pladerne tørre i mindst 2 timer under hætten.
- Pladerne kan opbevares ved 4 ° C eller - 20 ° C, før man går videre til laminin belægning.
- Forbered laminin lager i forvejen. Tø laminin på is og holde på is under brug. Fortyndes til en koncentration på 50 mg / ml, er opmærksomme på meget koncentration, hvert parti vil være anderledes. Afhængig parti koncentration, vil cirka 20 ml ddH2O føjes til hvert hætteglas laminin. Alikvot (5 ml) og opbevares ved -80 ° C. Tø alikvoter på is før anvendelse.
- Coat dækglas med 5 ug / cm 2 laminin, pipette 200 pi laminin bestand på hver dækglas.
- Inkuber laminin løsning på dækglas i 1 time.
- Aspirer resterende laminin opløsning og skylles dækglas gang medHedeselskabet 2 O. Undgå skrabning overflade af dækglas.
- Opbevar plader ved 4 ° C i op til to uger.
2.. Advance Fremstilling af Neuron Isolering Solutions
- Forbered Krebs-opløsning (i mM: 118 NaCl, 4,6 KCI, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 11 glucose og 2,5 CaCl2). Sted 13.79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCI (FW 74,55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g glucose (FW 180,2) og 0,555 g CaCl2 (FW 111) i 2 L Hedeselskabet 2 0. Chill til 4 ° C.
- Forbered skylning medier (F12 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotisk / antimykotikum): Til en 500 ml flaske af F12 medier, tilsættes 50 ml FBS og 5 ml antibiotisk / antimykotisk 100x Liquid (Gibco).
- Forbered enterisk neuron medier (Neurobasal Et medie med B-27, 2 mM L-glutamin, 1% FBS, 10 ng / ml, glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF), og Antibiotikum / antimykotisk 100x Liquid). For at gøre GDNF bestand, der tilsættes 1 ml ddH2O til 10 ug GDNF og fryse tilbage i 50 pi alikvoter, opbevares ved -80 ° C. For et 50 ml hætteglas af komplette neuron medier, kombinere 47.5 ml Neurobasal Et medie, 1 ml B-27 (50x), 500 pi FBS, 500 pi 200 mM L-glutamin (Gibco) 50 ul GDNF stock, og 500 pi antibiotisk / antimykotikum 100x Væske. Medier er lavet i små 50 ml portioner for at sikre friskhed af GDNF og at undgå forurening af store mængder af denne dyre celle medier blanding.
3.. Høst Longitudinal Muskel / plexus myentericus (LMMP) Fremstilling af mus
- Relevante nationale og institutionelle etik skal være på plads, før du udfører dyreforsøg. Voksen Swiss Webster mus vejer over 25 g (typisk over 8 ugers alderen) er opstaldet i grupper på 6 før eksperimenter. Væv fra to mus anvendes til isolering af tyndtarmen enteriske neuroner og glia og tre mus anvendes tilisolering af colon celler.
- Forbered kirurgiske område. Saml små kirurgiske saks, vinklede pincet, vatpinde, tre 200 ml Bægerglas, samt et glas / plastik stang (pensel). Sørg for at alle leverancer er grundigt vasket og skyllet før brug for at minimere forurening. Dette trin kan udføres dagen før forsøget.
- Placer Krebs-opløsning på is og boble med carbogen (95% oxygen, 5% CO 2) i mindst 30 minutter for at stabilisere pH-værdien.
- Tænd diverse udstyr og varme kemikalier at stabilisere sig på ønskede temperaturer, varme vandbad (r) til 37 ° C, afkøles centrifuge til 4 ° C, sted Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) og 0,5% trypsin i vandbad (37 ° C ). Komplet neuron medier og skyl medierne bør forblive nedkølet.
- Place 150 ml iskold boblede Krebs i tre 200 ml glasbægre mærket 'beskidt', 'rene' og 'LMMP ". Bubble bæger stemplet 'LMMP "med carbogen.
- Efter godkendelse fra etisk komité, aflive mOuse ved cervikal dislokation eller CO 2 kvælning.
- Placer musen i dorsal recumbence på kirurgisk overflade, ren hud med 70% EtOH, og løft abdominal huden ved hjælp af pincet. Ved hjælp af saks, åben bughulen og afslører indre fordøjelsesorganerne.
- Fjern længden af mavetarmkanalen ved at løfte en del af ileum og afslørende dens mesenterium. Snip gennem mesenterium med en saks til forsigtigt fjerne og optrævle ileum og tyktarm, og pas på ikke at trække mesenterium fra ileum / colon.
- Efter den fulde længde af tarmen er bragt i orden, fjerne ileum ved at skære gennem tarmen distalt for maven og proximalt til coecum Bemærk:. Denne fremgangsmåde kan også udføres med colonvæv ved at fjerne tyktarmen fra distalt for coecum til proximalt til anus.
- Væv kan yderligere opdeles mellem proksimal og distal colon og jejenum, og ileum. Resten af denne procedure vil henvise til isolering af ileum, tHan er den samme til isolering af tyktarmen LMMP. Placere hele ileum i en glasbeholder med iskold Krebs mærket "beskidt".
- Oprette et værktøj til at rense ileum, stumpe en stor 20 G nål ved hjælp af en arkivering sten og vedhæfte det til en stor sprøjte (10 ml) indeholdende iskold Krebs.
- Ren fecal sagen fra ileum ved at inddele ileum i tre eller flere store stykker. Fjern en ileal afsnit fra bæger, og placer stump nål ind i slutningen af en ileal stykke.
- Forsigtigt køre Krebs gennem tarmen afsnittet, indtil alle fækalier fjernes i en separat affaldscontainer. Placer den rensede afsnittet i beholderen med Krebs mærket "ren". Gentag indtil hele ileum renses.
- For at fjerne LMMP, skære ileum i små segmenter, ca 2 - 4 cm. Placer et segment af ileum på en plast eller glas Rod; ileum skal passe godt ind, men ikke være løs eller stram (~ 2 mm). Begynd fjernelse af LMMP ved forsigtigt at fjerne stumper af mesenterium stadig vedhæfteed til den gastrointestinale (GI) kanal ved hjælp af en pincet. Undgå mavetarmkanalen at rotere omkring stangen ved forsigtigt pinning røret til stangen ved hjælp af tommelfingeren.
- Adskil LMMP fra den underliggende ringmuskel, først forsigtigt gnide kanten af tang langs hele linjen, hvor mesenterium blev tilknyttet, fra top til bund af segmentet, forsigtigt skaber et hul i den langsgående muskel. Derefter forsigtigt drille væk langsgående muskler med en vatpind fugtet med Krebs.
- Begynd i toppen af hullet i den langsgående muskler og drille væk ved hjælp den letteste vandrette streg, mens anvendelse meget let tryk, indtil den langsgående muskler bare begynder at adskille fra ringmuskel, gøre dette ned hele stribe langs mesenterium fastgørelsespunkt.
- Derefter forsigtigt begynde at arbejde omkring GI rør, flytter fra top til bund og tilbage som den langsgående muskel langsomt er adskilt fra den cirkulære muskel hele vejen rundt om røret. Når fuldført,LMMP vil naturligvis komme ud resten af GI rør.
- Placer den resulterende tynde strimler af langsgående muskel i bægeret mærket "LMMP". Gentag for alle segmenter.
- Efter alle de strimler af LMMP blevet indsamlet fra en mus, skal du gentage proceduren for andre mus, der bruges. Skyl de »sorte« og »rene« bægre før genbrug.
- Skyl LMMP 3x at fjerne biologisk forurening. Fyld tre 2 ml Eppendorf-rør med iskold Krebs. Placer LMMP strimler i det første rør og spin for 30 sekunder ved 356 xg i en centrifuge afkølet til 4 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette og flyt LMMP strips til næste clean Krebs fyldt rør. Gentag denne procedure for hver af de resterende rør.
4.. Digest LMMP
- Forbered fordøjelsen opløsning ved at placere 13 mg kollagenase type 2 og 3 mg BSA i 10 ml carbogen-boblet Krebs-opløsning.
- Place segmenter af skylles LMMP i fordøjelsen løsning og bruge LAFsorer til at klippe LMMP i bittesmå stykker.
- Digest LMMP i 60 minutter ved 37 ° C i vandbad med shaker mens de forsigtigt med carbogen.
- Efter fordøjelse er færdig, samle celler ved centrifugering i 8 minutter ved 356 xg i centrifuge afkølet til 4 ° C.
- Fra dette punkt fremad alle procedurer bør ske under sterile forhold i en cellekultur hætte! Alle reagenser og containere skal steriliseres før brug.
- Under centrifugering, 0,05% trypsin opløsning fremstilles ved at anbringe 1 ml opvarmet 0,25% trypsin og 4 ml opvarmet HBSS i en steril 50 ml cellekultur rør.
- Efter centrifugering fjernes og kasseres supernatanten. Brug ikke et vakuum, og dette vil sandsynligvis suge op cellepelleten på grund af lave centrifugering hastigheder. Fjern forsigtigt cellepelleten og anbringes i ren rør med 5 ml 0,05% trypsin-opløsning.
- Fordøje celler i 0,05% trypsinopløsning i 37 ° C vandbad med omrystning i 7 min. Ikke overstiger 7 kmn af den samlede trypsinbehandling eller neuroner vil omkomme.
- Neutraliser trypsin med 10 ml kold skylning medier efter 7 min trypsin behandling.
- Centrifuger cellerne i 8 minutter ved 356 x g.. Fjern og kassér medier.
- Under centrifugering, balancere en sektion af steriliseret Nitex net på toppen af en steril 15 ml cellekultur rør.
- Efter centrifugering fjernes og kasseres supernatanten. Forsigtigt resuspender celleblandingen ved triturering i 3 ml komplet neuron medier. Undgå at skabe luftbobler i dette trin, og alle fremtidige skridt, hvor celleblanding findeles. Alle tritureringer skal gøres meget forsigtigt. Filter celle løsning gennem Nitex mesh til rent 15 ml cellekultur rør.
- Valgfrit: Cap cellekultur rør og plads i nedkølet Hula mixer (eller enhver mixer, der giver rotation) med blide rullende og vippe i 30 min. Dette trin er valgfrit, men anbefales.
- Valgfrit: Efter Hula mixer, 2 ml kold skylning medier tilføjer at vaske cellerne.
- Saml cellerne ved centrifugering (8 minutter, 356 xg). Fjern og kassér supernatanten.
- Resuspender cellerne i 1.200 pi komplette neuron medier. Tritureres celler forsigtigt med 1 ml plastik pipettespids. Må ikke generere luftbobler. Afpipettere langsomt og forsigtigt, indtil de fleste klumper er brudt op, og celler suspenderet i væske.
- Tilføj 750 ul komplette medier til hver af de 12 brønde indeholdende en præ-belagt dækglas og tilsættes 100 ul af triturerede celle løsning.
- Inkuber neuroner i cellekultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Skift halvdelen af cellemedierne hver 2 dage.
- Neuroner er klar til elektrofysiologiske optagelser efter 1. - 2 dage i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
