Summary
Vi visar ett protokoll cellkultur för direkta studier av neuronala och glia-komponenter i det enteriska nervsystemet. En neuron / glia blandad kultur på täckglas framställs från myenteric plexus av vuxen mus som ger möjlighet att undersöka enskilda neuron och glia funktion genom elektrofysiologi, immunhistokemisk,
Abstract
Den enteriska nervsystemet är ett stort nätverk av nervceller och glia kör längden av mag-tarmkanalen som funktionellt kontrollerar gastrointestinal motilitet. Ett förfarande för isolering och odling av en blandad population av neuroner och glia från plexus myentericus beskrivs. De primära kulturerna kan upprätthållas i över 7 dagar, med anslutningar utveckla bland neuroner och glia. Den längsgående muskeln remsa med den bifogade plexus myentericus avdrives från den underliggande cirkulära muskeln i musen ileum eller kolon och utsattes för enzymatisk spjälkning. Under sterila förhållanden, är den isolerade neuronala och gliaceller befolkning bevarade i pelleten efter centrifugering och stryks ut på täckglas. Inom 24-48 timmar, sker neuritutväxt och nervceller kan identifieras genom pan-neuronala markörer. Efter två dagar i kultur, isolerade nervceller brand aktionspotentialer observerades vid studier patch clamp. Vidare kan enterisk Glia också vara identified av GFAP-färgning. Ett nätverk av nervceller och glia i nära beröring bildar inom 5 - 7 dagar. Enteriska nervceller kan vara direkt och studeras med hjälp av metoder såsom immunohistokemi, elektrofysiologi, kalcium avbildning och encelliga PCR. Dessutom kan denna procedur utföras i genetiskt modifierade djur. Denna metod är enkel att utföra och billig. Sammantaget, exponerar detta protokoll komponenterna i enteriska nervsystemet i ett lätt manipuleras sätt så att vi får bättre upptäcka funktionerna i ENS i normala och sjukdomstillstånd.
Introduction
Den enteriska nervsystemet (ENS) är stort nätverk av nerver och glia som löper hela längden av den gastrointestinala (GI) området. Den ENS kontrollerar funktionellt alla aspekter av matsmältningen, inklusive peristaltiken, fluidabsorption / sekretion, känsla av stimuli, etc (för översikt se 1). Den innehåller över 500 miljoner nervceller, mer än som finns i ryggmärgen, och innehåller varje signalsubstans klass som finns i hjärnan. Vidare är ILE unikt genom att det kan fungera reflexmässigt utan input från det centrala nervsystemet 2. Förståelse av ENS är avgörande, inte bara för att förstå dess normala fysiologiska roll, men för att förstå sin delaktighet i olika neuropatier som kan vara medfödd (Hirschsprung sjukdom), förvärvade (Chagas), sekundärt till sjukdomstillstånd (diabetisk gastropares), drog -inducerad (opiater bowel syndrome), eller på grund av skada (postoperativ ileus) 1. Dessutom kan enteriska neuroner vara en reservoir för viral infektion (varicella zoster) 3. På grund av dess likheter med hjärnan och de höga nivåerna av serotonin i tarmen, mediciner syftar till att behandla centrala nervsystemet defekter har ofta oönskade biverkningar på ENS 2. Det är också värt att notera att många neuropatier, såsom Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom visar liknande cellförändringar i enteriska neuroner långt innan deras utseende i centrala neuroner, vilket gör ENS en tillgänglig modell för att studera patogenesen av dessa sjukdomar 4. Därför är en grundlig förståelse av ENS en nödvändighet för att förstå sjukdomstillstånd samt förebygga / förutse farmakologiska biverkningar.
De nervceller i ENS har traditionellt studerats i marsvin med wholemount preparat 5-7 eller odlade nervceller 8. Trots den lätthet med vilken nervceller kan studeras i detta stora djur, har denna modell många begränsningar, inklusiveAvsaknaden av genetiskt modifierade stammar, brist på reagens specifika för denna art, och de höga kostnaderna i samband med beställning och inhyser dessa ämnen. Utvecklingen av ett murint enteriska nervsystemet modell har den unika fördelen att olika knock out system, ett brett spektrum av andra etablerade metoder som kan användas i samband med cellodling tekniken, och förmågan att tillhandahålla en validering för marsvinsmodellen .
Den ENS består av tre plexi som kör längden av mag-tarmkanalen: den yttre myenteric plexus (mellan den längsgående och cirkulära muskler) som är huvudsakligen ansvarig för de peristaltiska åtgärder i tarmen, liksom submukosal och slemhinnor plexi, ( finns under och i slemhinnan, respektive) som till stor del styr fluidabsorption / sekretion och detektion av stimuli 1. Denna metod börjar med isolering av den längsgående muskeln / plexus myentericus (LMMP) framställning genom avskalningav det yttre muskelskiktet av mag-tarmkanalen. Detta skär drastiskt ned på föroreningar som uppstår när slemhinneskiktet är involverad i isoleringen. Som ett resultat, är denna process idealiskt för studier av neuronal kontroll av motilitet snarare än sekretoriska insatserna i ENS.
Den metod som presenteras här resulterar i en blandad kultur av enteriska neuroner och glia. Minst två olika typer av nervceller är närvarande baserat på tidigare elektrofysiologiska och immunocytokemisk observationer 9. Förekomsten av glia är mycket fördelaktig, eftersom de är inte bara en viktig celltyp för att studera i sin egen rätt, men de bidrar till överlevnaden av de enteriska neuroner 10 och bibehålla nativ receptor expression på neuronala cellytan 11. Vidare kan brister i enterisk glia leda till onormala gastrointestinala stater motilitet sjukdomstillstånd, myntade "neuro-gliopathies '12. Därför lade ENS kulturen här rESULTAT i flera celltyper som är mogna för utredning.
Fördelarna med denna metod är enkel isolering, billiga krav verktyg, och en kort tid att behärska tekniken av erfarna lab personal. Begränsningar med metoden inkluderar låg total cellutbyte från höga vävnad volymer och uteslutandet av ENS nervceller från slemhinnan och submukösa plexi. Detta förfarande kommer att vara mycket fördelaktigt att forskare som specialiserat sig på elektrofysiologi, immunohistokemi, single-cell PCR och andra metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djuromsorg och experimentella förfaranden var förenliga med och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Virginia Commonwealth University.
Ett. Framställning av Sterila Poly-D-lysin-och laminin-belagda täckglas av glas i 24-brunnsplattor
- Alla förfaranden för steg 1 utförs under sterila förhållanden, under en huv, och med sterila reagens. Täckglas och dubbelt avjoniserat vatten (DDH 2 O) bör steriliseras i förväg. Beredning av plattorna kan göras upp till två veckor innan neuron isolering.
- Under huven, använd steril pincett för att placera autoklaveras täckglas i 12 brunnar i en 24-brunnar.
- Förbered poly-D-lysin lager i förväg. Tillsätt 50 ml sterilt ddH2O till 5 mg poly-D-lysin. Vortex och förvara i 3 ml alikvoter vid -20 ° C. Tina alikvoter före användning.
- För en slutlig koncentration av 1 ml poly-D-lysin lager per 25 cm 2: pipett 80 ulav poly-D-lysin lager på toppen av varje täckglas (2 cm 2). Låt lösning nöja 10 min.
- Avlägsna poly-D-lysin med vakuum och skölj täckglas 3x med steril DDH 2 O.
- Låt plattorna torka i minst 2 timmar under huven.
- Plattorna kan förvaras vid 4 ° C eller - 20 ° C innan laminin beläggning.
- Förbered laminin lager förväg. Tina laminin på is och hålla på is under användning. Späd till en koncentration av 50 | ig / ml; uppmärksamma mycket koncentration, varje del kommer att vara annorlunda. Beroende på mycket koncentration, kommer ca 20 ml DDH 2 O läggas till varje injektionsflaska med laminin. Alikvot (5 ml) och förvara vid -80 ° C. Tina portioner på is före användning.
- Coat täckglas med 5 ng / cm 2 laminin, pipett 200 mikroliter av laminin lager på varje täckglas.
- Inkubera laminin lösningen på täckglas för 1 timme.
- Aspirera återstående laminin lösningen och skölj täckglas gång medDDH 2 O. Undvik att skrapa ytan av täckglas.
- Förvara plattorna vid 4 ° C i upp till två veckor.
2. Advance Beredning av Neuron Isolation Solutions
- Förbered Krebs lösning (i mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 11 glukos och 2,5 CaCl 2). Placera 13,79 g NaCl (FW 58,44), 0,686 g KCl (FW 74,55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO 4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO 3 (FW 84.01), 3,96 g glukos (FW 180,2), och 0,555 g CaCl2 (FW 111) i 2 L DDH 2 0. Chill till 4 ° C.
- Förbered skölj media (F12 medium med 10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika / antimykotika): Till en 500 ml flaska av F12-medium, tillsätt 50 ml FBS och 5 ml av antibiotika / Antimykotika 100x Liquid (Gibco).
- Förbered enteral neuron media (Neurobasal ett media med B-27, 2 mM L-glutamin, 1% FBS, 10 ng / ml, Glial Härledd Neurotrophic Factor (GDNF), och Antibiotikum / Antimykotika 100x vätska). För att göra GDNF lager, tillsätt 1 ml ddH2O till 10 mikrogram GDNF och frysa tillbaka i 50 pl portioner, förvara vid -80 ° C. För en 50 ml injektionsflaska av kompletta neuron media, kombinera 47,5 ml Neurobasal ett media, 1 ml B-27 (50x), 500 pl FBS, 500 ^ 200 mM L-glutamin (Gibco) 50 ^ GDNF stock, och 500 pl antibiotika / Antimykotika 100x Vätska. Media görs i små 50 ml partier att garantera färskhet GDNF och för att undvika kontaminering av stora mängder av denna dyra cell media blandningen.
Tre. Harvest Längsgående muskel / myenteric Plexus (LMMP) Framställning från möss
- Lämpliga nationella och institutionella etik bör vara på plats innan du utför djurförsök. Vuxen Swiss Webster-möss som väger över 25 g (typiskt över 8 veckors ålder) hålls i grupper om 6 före experimenten. Vävnader från två möss användes för isoleringen av ileal enteriska neuroner och glia och tre möss används förisolering av colonic celler.
- Förbered operationsområdet. Samla små kirurgiska saxar, vinklade pincett, bomullspinnar, tre 200 ml bägare glas och ett glas / plast stav (pensel). Se till att alla leveranser noggrant tvättas och sköljas före användning för att minimera kontaminering. Detta steg kan utföras dagen före experimentet.
- Placera Krebs lösning på is och bubbla med karbogen (95% syre, 5% CO2) under minst 30 minuter för stabilisering av pH.
- Slå på diverse utrustning och varma kemikalier stabiliseras på önskad temperatur, värme vattenbad (s) till 37 ° C, coola centrifug till 4 ° C, plats Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och 0,5% trypsin i vattenbad (37 ° C ). Kompletta neuron media och skölj media bör förbli kylskåp.
- Placera 150 ml iskall bubblade Krebs i tre 200 ml glasbägare märkta "smutsiga", "rena" och "LMMP". Bubble bägare märkt "LMMP 'med carbogen.
- Efter godkännande från etisk kommitté, euthanize mouse genom cervikal dislokation eller CO 2 kvävning.
- Placera musen i rygg VILA på kirurgisk yta, ren hud med 70% EtOH, och lyft buken huden med pincett. Med sax, öppna bukhålan och avslöja inre matsmältningsorgan.
- Ta längden av mag-tarmkanalen genom att lyfta en del av ileum och avslöja dess tarmkäx. Snip genom mesenterium med sax för att försiktigt ta bort och nysta ileum och kolon, är noga med att inte dra tarmkäxet från ileum / colon.
- Efter det att hela längden av tarmen är uppenbarad, avlägsna ileum genom att skära genom tarmen distalt om magen och proximalt om cekum Obs. Detta förfarande kan även utföras med kolonvävnad genom avlägsnande av kolon från distalt till blindtarmen till proximalt anus.
- Vävnader kan vidare delas mellan proximal och distal kolon och jejenum och ileum. Resten av detta förfarande kommer att hänvisa till isolering av ileum, than Proceduren är densamma för isolering av tjocktarmen LMMP. Placera hela ileum i en glasbehållare med iskall Krebs märkt "smutsiga".
- Skapa ett verktyg för att rengöra ileum, trubbig en stor 20 G nål med en ansökan sten och bifoga det till en stor spruta (10 ml) innehållande Krebs iskall.
- Rengör avföring från ileum genom sektionering ileum i tre eller flera stora bitar. Ta en ileal avsnitt från bägaren och placera den trubbiga nålen i slutet av en ileal pjäs.
- Försiktigt köra Krebs genom tarmen avsnitt tills all avföring tas bort i en separat avfallsbehållare. Placera den rengjorda delen i behållaren med Krebs märkt "ren". Upprepa tills hela ileum rengörs.
- För att ta bort LMMP, skär ileum i små segment, ungefär 2 - 4 cm. Placera ett segment av ileum på en plast eller glasstav, ileum bör passa väl men inte vara lös eller spänd (~ 2 mm). Börja avlägsnande av LMMP genom att försiktigt ta bort bitar av mesenterium bifoga ändåed till gastrointestinal (GI) tarmkanalen med hjälp av en tång. Förhindra mag-tarmkanalen från att rotera runt stången genom att försiktigt klämma fast röret på stången med tummen.
- Separera LMMP från underliggande cirkulära muskeln, först försiktigt gnugga kanten av tången längs hela linjen där tarmkäxet var fäst, från topp till botten av segmentet, försiktigt skapa en lucka i den längsgående muskeln. Sedan försiktigt retas bort den längsgående muskeln med en bomullspinne fuktad med Krebs.
- Börja på toppen av gapet i den längsgående muskeln och retas bort med den lättaste horisontella streck samtidigt som mycket lätt tryck tills den längsgående muskeln precis börjar att separera från den cirkulära muskeln, gör detta ner hela remsan längs mesenterium fästpunkt.
- Sedan försiktigt börja arbeta runt GI röret, flyttar från topp till botten och tillbaka som den längsgående muskeln långsamt separeras från den cirkulära muskeln hela vägen runt röret. När den är slutfördLMMP kommer naturligtvis lossna återstoden av GI röret.
- Placera den resulterande tunn remsa av längsgående muskler i bägaren märkt "LMMP". Upprepa för alla segment.
- Efter alla remsor av LMMP har samlats från en mus, upprepa proceduren för alla andra möss som används. Skölj "smutsiga" och "rena" bägare före återanvändning.
- Skölj LMMP 3x att avlägsna biologisk kontaminering. Fyll tre 2 ml Eppendorf-rör med iskall Krebs. Placera LMMP remsorna i det första röret och centrifugera i 30 s vid 356 x g i en centrifug kyld till 4 ° C. Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett och flytta LMMP remsorna till nästa ren Krebs fyllda röret. Upprepa denna procedur för varje återstående röret.
4. Digest LMMP
- Förbered matsmältningen lösning genom att placera 13 mg kollagenas typ 2 och 3 mg BSA i 10 ml carbogen-bubblade Krebs lösning.
- Placera segment av sköljda LMMP i matsmältningen lösning och SCI användningsorer att klippa LMMP i små bitar.
- Digest LMMP under 60 min vid 37 ° C i vattenbad med skakare under det att försiktigt bubblades med karbogen.
- Efter uppslutning är klar samlas cellerna genom centrifugering under 8 minuter vid 356 xg i centrifug kyld till 4 ° C.
- Från denna punkt framåt alla förfaranden bör ske under sterila förhållanden i en cellkultur huva! Alla reagenser och containrar skall steriliseras före användning.
- Under centrifugering, förbereda 0,05% trypsin lösning genom att placera 1 ml värmde 0,25% trypsin och 4 ml värmde HBSS i en steril 50 ml cellodling tub.
- Efter centrifugering, ta bort och kassera supernatanten. Använd inte ett vakuum, detta kommer troligen suga upp cellpelleten grund av låg centrifugering hastigheter. Ta försiktigt bort cellpelleten och plats i rena rör med 5 ml 0,05% trypsin lösning.
- Smälta celler i 0,05% trypsin-lösning i 37 ° C vattenbad med skakning under 7 min. Överskrid inte 7 kmn av total trypsinbehandling eller nervceller kommer att förgås.
- Neutralisera trypsin med 10 ml kall sköljning media efter 7 min av trypsinbehandling.
- Centrifugera cellerna under 8 minuter vid 356 x g.. Avlägsna och kassera media.
- Under centrifugeringen balansera en sektion av steriliserad Nitex mesh på toppen av en steril 15 ml cellkultur rör.
- Efter centrifugering, ta bort och kassera supernatanten. Försiktigt återsuspendera cellen blandningen genom finfördelning i 3 ml komplett neuron media. Undvika att skapa luftbubblor under detta steg, och alla framtida åtgärder som cellblandning finfördelas. Alla triturationerna bör ske mycket försiktigt. Filter cellösningen genom Nitex mesh i ren 15 ml cellodling tub.
- Valfritt: Cap cellkultur röret och plats i kylt Hula mixer (eller någon mixer som ger rotation) under försiktig rullning och lutning i 30 min. Detta steg är valfritt, men rekommenderas.
- Tillval: Efter Hula mixer, tillsätt 2 ml kall sköljning media att tvätta cellerna.
- Samla cellerna genom centrifugering (8 min, 356 xg). Avlägsna och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 1200 il komplett neuron media. Finfördela cellerna försiktigt med 1 ml spets plastpipetten. Genererar inte luftbubblor. Pipettera långsamt och försiktigt tills de flesta bitar bryts upp och cellerna är suspenderade i vätska.
- Lägg 750 pl komplett medium till var och en av 12 brunnar innehållande en pre-belagt glas täckglas och tillsätt 100 pl av den triturerades cellösningen.
- Inkubera neuroner i cellodling inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Ändra halvan av cellen media varje 2 dagar.
- Nervceller är redo för elektrofysiologiska inspelningar efter 1 - 2 dagar i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omedelbart efter isolering av LMMP-härledda celler, neuroner och andra celltyper kommer inte att vara direkt tydlig. Living, kan runda celler av otydlig fenotyp ses liksom vävnad detritus från ofullständigt nedbrutna vävnadsfragment och bindväv. Denna vrakgods är inte berör och kommer till stor del lösas med den första media förändringen i två dagar. Försök inte att rengöra glasen innan detta som de friska, livskraftiga celler kommer att tas bort också.
Efter en dag i kultur, kommer nervceller börja visa neuritutväxt. Specifik identifiering av neuroner kan fortfarande vara otydlig på denna tid. Förutsatt att cellerna är vidhäftande nog att överföra till en experimentell kammare, kommer de att vara redo för elektrofysiologisk undersökning efter en dag av kultur. Men cellerna är mer vidhäftande efter två dagar i kultur och perfekt för funktionsstudier (elektrofysiologi, kalcium avbildning) från ungefär dag 2 - 5.
ENT "> Morfologiska egenskaper hos neuron blir tydlig efter ungefär en vecka i kultur (Figur 1). Ideal immunocyctochemical funktioner kan identifieras efter cirka tio dagar, då nervceller visar långa prognoser och växa i en nästan" ganglionär "som mode varvat med glia ( Figur 2). Denna färgning antyder att det kan vara möjligt att studera de synaptiska interaktioner av dessa celler med hjälp av denna metod.Efter en dag i kultur, är nervceller identifieras genom sine que non eller "utmärkande drag", aktionspotentialen (Figur 3). Elektrofysiologiskt, kan de vara funktionellt delas in i minst två neuronala typer: neurons som innehåller en after-hyperpolarisation och ökade kortfristiga / densitet relationer av natrium och kalium och nervceller som inte har en efter-hyperpolarisation och betydligt mindre natrium och kalium konduktans (Figur 4). AHP positiva och negativa neurons tycks korrelera med AH och S nervceller sett i tidigare Guinea arbete, respektive. AHP positiva neuroner (AH nervceller) har flera långa utsprång ursprung från hela cellen kroppen, medan de AHP negativa neuroner (S nervceller) har en lång projektion som filialer många gånger. Detta, i kombination med de immunocytokemiska kodning i figur 1, visar att neuronala befolkningen är mycket heterogen.
Figur 1. Immunohistokemisk karakterisering av enteriska neuroner och glia isolerade från mus längsgående muskeln. Konfokalmikroskopi avslöjade neuronal-specifik β-III-tubulin (Abcam, kanin, 1:1,000) färgning i hela montera ileal längsgående muskel (A) beredning från musen. Celler isolerade från longitudinal muskel / myenteric plexus (LMMP) preparat innehåller neuroner (B, β-III-tubulin, Abcam, kanin, 1:1000) som färgas positivt för calbindin (C) (Chemicon, kanin, 1:1000) och calretinin (D) (Swant, kanin, 1:2000). Gliaceller (E) visualiserades med glia-specifik markör GFAP (Chemicon, mus, 1:500). Antikroppar visualiserades via lämplig get sekundär antikropp Alexa 488 (grönt, molekylära sonder, 1:1000) 0. Kärnor visualiserades med hjälp Hoescht 33342 (blå, CG, 1 | ig / ml). Ingen färgning sågs när primär antikropp utelämnades (F). . Modifierad och omtryckt från Smith, TH, et al Morfin Minskar Enterisk Neuron Retbarhet via hämning natriumkanalernas PLoS One, doi:... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) Klicka här för att visa en större bild <./ P>
Figur 2. Neuroner och glia isolerade från mus längsgående muskeln växa i nära anslutning till varandra. Konfokalmikroskopi bilderna anger neuroner (grönt, β-III-tubulin, Abcam, kanin, 1:1,000) och glia (röd, GFAP, Chemicon, mus , 1:500) lätt växa intill varandra och verkar interagera in vitro. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Elektrofysiologi av odlade enteriska neuroner och gliaceller. I current klämma läge, alla neuroner (A) visas aktionspotentialer på aktuell injektion. Glia (B) inte har aktionspotentialer men visa stora electrotonic potentialer som svar på aktuella injektion. Protokoll i A och B startar med en aktuell injektion av -0.01 nA och öka till 0,09 nA i elva 0.01 nA steg. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Nervceller odlade från musen ileum är en elektrofysiologiskt heterogen befolkning. I strömtång läge, en aktuell injektion av 0,09 nA till neuron leder aktionspotentialer. S neuroner (A), omedelbart återgå till vilomembranpotentialen ffter stimulering. AH-typ neuroner (B) visar en afterhyperpolarization (AHP) efter stimulering där vilomembranpotentialen understiger baslinjen innan sakta återvända till det ursprungliga värdet. . Modifierad och omtryckt från Smith, TH, et al Morfin Minskar Enterisk Neuron Retbarhet via hämning natriumkanalernas PLoS One, doi:.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Använda djur
Detta protokoll har optimerats för schweiziska Webster-möss. Emellertid är denna metod lätt att anpassa till andra små däggdjur, såsom råttor och till andra stammar av möss. Vi har framgångsrikt utfört preliminära isoleringar med C57 möss och μ-opioid receptor knock-outs. Det är emellertid också möjligt att andra stammar av möss kan vara problematisk på grund av morfologiska variationer i mag-tarmkanalen. Vidare finns det kända skillnader mellan musstammar (C57BL / 6 vs Balb / c) i den neuronala kretsarna hos LMMP preparatet 13, vilket kan påverka den resulterande blandningen av neuroner i den slutliga isoleringen. Dessutom bör ålder beaktas när man använder denna metod, eftersom åldersrelaterade neuronala förluster uppstår i myenteric plexus som är specifika för kolinerga neuroner och deras motsvarande glia, och kan ses så tidigt som 12 månaders ålder 14. Slutligen, när man anpassa detta protokoll till andra specificeradees av djur, bör man se till att myenteric plexus kommer undan med den längsgående muskeln istället för att vara ansluten till den cirkulära muskeln.
Vävnad som används
Neuroner och glia kan odlas både från ileum och kolon med detta protokoll. Ileal isoleringar är lättare att utföra på grund av en större mängd av tillgänglig vävnad och den lätthet med vilken den längsgående muskeln separerar från den tjocka cirkulära muskeln. Minst två djur behövs för att ockupera 12 brunnar i 24-brunnar för applikationer såsom elektrofysiologi eller immunocytokemi. Isoleringen av kolon material är mer problematisk. Den tjocka kolon längsgående muskler är svårare att separera från den cirkulära muskeln. Dessutom är den underliggande cirkulära muskeln tunnare i tjocktarmen, vilket gör det mer mottagliga för tårar. Dessutom, är kolon betydligt kortare än ileum så tre djur, åtminstone, är skyldiga att ockupera 12 wells av en 24-brunnars platta. Både ileum och kolon kan skördas och ströks separat från samma djur, men ytterligare djur eller användning av mindre cell plätering område kommer att krävas för kolon isolering.
Varaktighet för cellodling
Elektrofysiologiska inspelningar optimalt utförs i isolerade enteriska neuroner / glia efter 2 till 6 dagar i kultur, vid denna tidpunkt celler är rundade och smidig, idealiska förutsättningar för att göra en hel-cell tätning. Efter en vecka i kultur celler blir plattare och mer visuellt differentieras eftersom cellerna följer plattan. Immunocytokemiska experiment görs bäst när celler mer stadigt fäst vid plattan, runt dag 10, för att förhindra cell förlust under flera tvättsteg. Mus enteriska celler har hållits i odling under upp till tre veckor. Mönster av receptor och signalsubstansen uttryck över tiden har ännu inte studerats i dessa kulturer. Men tidigare studier på neuronal överlevnadoch biokemiska / morfologisk differentiering i traditionella enteriska marsvin neuron isoleringar har funnit att nervceller överlevde upp till 15 dagar och upprätthålla en hög grad av histokemiska och morfologiska egenskaper upp till tre veckor 8, vilket antyder att nervceller härrör från andra djur källor kan göra samma sak .
Cell Utbyte
Det totala utbytet av celler från denna teknik är 12 brunnar i en 24-brunnar från två möss vid isolering från ileum. Detta är ett relativt lågt antal av neuroner jämfört med vävnad volym, eftersom plexus myentericus består av mindre än 1% av den totala tarmväggen. En nackdel med denna metod är att för att öka antalet erhållna cellerna, måste man öka antalet använda djur. När antalet djur ökar, föreslås det att flera lab medlemmar samarbetar i det första steget av isolering av LMMP. Detta minskar den tid cellerna är i ett stört tillstånd innan slutligt plerande och detta ökar cellöverlevnad.
Cell Densitet
Som skrivet, använder detta protokoll två djur för att ge en ileal isolering av låg densitet cell sammanflödet (-10 - 40% mätt efter en dag i kultur). Low-density cell bordläggningen är perfekt i denna metod för att minska risken för föroreningar i den slutliga kulturen. Det är också användbart när enda cell elektrofysiologi utförs. Cell antal kan ökas genom att använda fler djur eller minskar den slutliga bordläggningen området, men risken för kontaminering ökar. Kvitta detta problem när högre celltätheter krävs, antingen ökad tvätta steg eller den ökade användningen av antibiotika föreslås.
Cell Heterogen
Nervceller som förvärvats med hjälp av dessa protokoll består av minst två funktionellt distinkta populationer, vilket framgår av elektrofysiologisk karakterisering (Figur 3). Men det finns många kända typer av nervceller med särskilda neurokemiska kodning mönster som finns i marsvin 15 och detsamma gäller troligen för musen. Denna cell heterogenitet är både en fördel och nackdel för denna metod. Cell heterogenitet är fördelaktigt när man utför encelliga funktionella studier, observation av cell-cell-interaktioner eller i immunocytokemi, bland andra. Cell heterogenitet kan vara särskilt fördelaktigt när man studerar neuron / Glia interaktioner i kultur (Figur 3). Dock är cell heterogenitet ett hinder för metoder såsom immunblotting, där förändringar i proteinuttryck, etc., inte kan bidragit till någon celltyp eller neuron typ. Granskning av glia blir mindre problematiskt eftersom endast två subtyper har bevisats i LMMP preparatet: intraganglionic och intramuskulär entero glia 16. Andra celltyper kan också vara närvarande i denna kultur, såsom interstitiella celler av Cajal eller fibroblaster.
EP "> plätering cellerI denna metod, celler på platta i tolv brunnar. Ibland kommer en eller två av dessa brunnar utveckla förorening i den första dagen efter isolering. Om detta inträffar, är bilderna från den förorenade brunnarna omgående kasseras och väl sköljs med 70% etanol för att döda den återstående föroreningen. Detta protokoll kan modifieras för att platta alla de isolerade cellerna i färre brunnar eller i en enda skålen, och som ett resultat, kommer risken för förorening ökar. Återigen, när risken för kontamination ökar, extra steg tvätta eller ökad antibiotikaanvändning föreslås. Antibiotikumet / antimykotiska vätska (Gibco) användes i protokollet består av amfotericin B, streptomycin och penicillin. Andra antibiotika kombinationer eller ökade koncentrationer kan användas för att optimera reduktionen av förorening medan du förbereder skölj och fyll neuron media.
Fästa celler
Celler stryks påtäckglas belagda med laminin och poly-D-lysin. Laminin är viktigt för överlevnaden av enteriska neuroner och gliaceller, och uppmuntrar neuritutväxt och neuronal utveckling 17, och som sådan anses nödvändig för denna isolering. Däremot kan alternativa kvarstad faktorer till poly-D-lysin, såsom ornitin eller Matrigel, prövas och returresa.
Sammanfattningsvis ger denna isolering en blandad kultur av enteriska neuroner och glia är lämplig för ett brett spektrum av studieteknik. Denna metod är lätt att bemästra, billigt och tidseffektivt. Det är vår förhoppning att denna cell modell kommer att bidra till förståelsen av olika patologier associerade med ENS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att inga större konkurrerande intressen finns.
Acknowledgments
National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
