Summary
हम आंतों का तंत्रिका तंत्र के neuronal और glial घटकों का सीधा अध्ययन के लिए एक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. Coverslips पर एक न्यूरॉन / glia मिश्रित संस्कृति, immunohistochemical इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, द्वारा व्यक्तिगत न्यूरॉन और glia समारोह की जांच करने की क्षमता प्रदान वयस्क माउस का myenteric जाल से तैयार किया जाता है
Abstract
आंतों का तंत्रिका तंत्र कार्यात्मक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल गतिशीलता को नियंत्रित करता है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग की लंबाई चल न्यूरॉन्स और glia का एक विशाल नेटवर्क है. Myenteric जाल से न्यूरॉन्स और glia की एक मिश्रित आबादी के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है. प्राथमिक संस्कृतियों न्यूरॉन्स और glia के बीच विकासशील कनेक्शन के साथ, पर 7 दिनों के लिए रखा जा सकता है. संलग्न myenteric जाल के साथ अनुदैर्ध्य मांसपेशी पट्टी माउस लघ्वान्त्र या पेट का अंतर्निहित परिपत्र मांसपेशी से छीन लिया और enzymatic पाचन के अधीन है. बाँझ परिस्थितियों में अलग neuronal और glia आबादी गोली निम्नलिखित centrifugation के भीतर संरक्षित कर रहे हैं और coverslips पर चढ़ाया. 24-48 घंटे के भीतर, neurite परिणाम होता है और न्यूरॉन्स अखिल neuronal मार्कर से पहचाना जा सकता है. संस्कृति में दो दिनों के बाद, पृथक न्यूरॉन्स आग कार्रवाई की क्षमता के रूप में पैच दबाना अध्ययनों से मनाया. इसके अलावा, आंतों का glia भी identif हो सकता हैGFAP धुंधला द्वारा आइईडी. करीब समानाधिकरण में न्यूरॉन्स और glia का एक नेटवर्क 5 के भीतर रूपों - 7 दिन. आंत्र न्यूरॉन्स अलग - अलग हो सकता है और सीधे immunohistochemistry, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम इमेजिंग, और एकल कक्ष पीसीआर के रूप में तरीकों का उपयोग का अध्ययन कर सकते हैं. इसके अलावा, इस प्रक्रिया आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं में किया जा सकता है. इस पद्धति को प्रदर्शन करने के लिए सरल और सस्ता है. हम बेहतर सामान्य और रोग राज्यों में सत्ता की कार्यक्षमता का पता लग सकता है कि इतना कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक आसानी से छेड़छाड़ ढंग से आंतों का तंत्रिका तंत्र के घटकों को उजागर करता है.
Introduction
आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता) नसों और जठरांत्र (सैनिक) पथ की पूरी लंबाई चलाता है कि glia की विशाल नेटवर्क है. सत्ता कार्यात्मक क्रमाकुंचन, द्रव अवशोषण / स्राव, उत्तेजनाओं की अनुभूति होती है, आदि (समीक्षा के लिए 1 देखें) सहित पाचन के सभी पहलुओं को नियंत्रित करता है. यह रीढ़ की हड्डी में पाया और अधिक से अधिक 500 मिलियन से अधिक न्यूरॉन्स होते हैं, और मस्तिष्क में पाया हर न्यूरोट्रांसमीटर वर्ग में शामिल है. इसके अलावा, सत्ता यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को 2 से इनपुट के बिना reflexively कार्य कर सकते हैं कि आप में अनूठा है. सत्ता को समझना अपने सामान्य शारीरिक भूमिका को समझने के लिए, लेकिन (के Hirschsprung रोग) का अधिग्रहण (Chagas), रोग राज्यों (मधुमेह gastroparesis) को माध्यमिक, दवा जन्मजात हो सकता है जो न्यूरोपैथी की एक किस्म में अपनी भागीदारी को समझने के लिए न केवल महत्वपूर्ण है, प्रेरित (Opioid आंत्र सिंड्रोम), या चोट (पश्चात आन्त्रावरोध) 1 के कारण. इसके अलावा, आंतों का न्यूरॉन्स फिर से एक हो सकता हैवायरल संक्रमण (छोटी चेचक दाद) 3 के लिए servoir. क्योंकि मस्तिष्क और आंत में सेरोटोनिन के उच्च स्तर तक अपनी समानता का, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र दोष के इलाज के उद्देश्य से दवाओं अक्सर सत्ता 2 पर अवांछित साइड इफेक्ट है. यह अल्जाइमर रोग और पार्किंसंस रोग के रूप में कई न्यूरोपैथी सत्ता इन रोगों 4 के रोगजनन अध्ययन करने के लिए एक सुलभ मॉडल बनाने, केंद्रीय न्यूरॉन्स में अपनी उपस्थिति लंबे समय से पहले आंतों न्यूरॉन्स में इसी तरह सेलुलर परिवर्तन बताते हैं कि यह भी उल्लेखनीय है. इसलिए, सत्ता की एक पूरी तरह से समझ रोग राज्यों को समझने और औषधीय दुष्प्रभाव को रोकने / भविष्यवाणी में एक आवश्यकता है.
सत्ता के न्यूरॉन्स परंपरागत 05-07 अगस्त या सभ्य न्यूरॉन्स wholemount तैयारी का उपयोग गिनी पिग में अध्ययन किया गया है. न्यूरॉन्स इस बड़े जानवर में अध्ययन किया जा सकता है, जिस पर आसानी के बावजूद, इस मॉडल सहित कई सीमाएं हैंआनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों, इस प्रजाति के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों की कमी है, और इन विषयों के आदेश देने और आवास के साथ जुड़े उच्च लागत की कमी है. एक murine आंतों का तंत्रिका तंत्र मॉडल का विकास सिस्टम, सेल कल्चर तकनीक के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि अन्य की स्थापना के तरीके की एक विशाल सरणी, और गिनी पिग मॉडल के लिए एक मान्यता प्रदान करने की क्षमता के बाहर विभिन्न दस्तक का अनूठा लाभ है .
पेट की क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला कार्रवाई के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार है जो बाहरी myenteric जाल (अनुदैर्ध्य और परिपत्र मांसपेशी के बीच), और साथ ही submucosal और mucosal plexi, (: सत्ता जठरांत्र संबंधी मार्ग की लंबाई चलने वाले तीन plexi के शामिल है मोटे तौर पर तरल पदार्थ अवशोषण / स्राव और उत्तेजनाओं 1 का पता लगाने के जो नियंत्रण म्यूकोसा, क्रमशः) के तहत और भीतर पाया. इस विधि छीलने द्वारा अनुदैर्ध्य मांसपेशी / myenteric जाल (LMMP) तैयार करने के अलगाव के साथ शुरू होता हैसैनिक पथ के बाहरी मांसपेशी परत बंद. यह नाटकीय रूप से mucosal परत अलगाव में शामिल है उठता है कि जब संक्रमण के मुद्दों पर नीचे कटौती. नतीजतन, इस प्रक्रिया के बजाय सत्ता की स्रावी कार्रवाई से गतिशीलता के neuronal नियंत्रण के अध्ययन के लिए आदर्श है.
विधि यहाँ आंतों न्यूरॉन्स और glia की एक मिश्रित संस्कृति में परिणाम प्रस्तुत किए. न्यूरॉन्स के कम से कम दो अलग अलग प्रकार वर्तमान पिछले electrophysiological और immunocytochemical टिप्पणियों 9 पर आधारित हैं. glia की उपस्थिति वे अपने आप में अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कोशिका प्रकार नहीं कर रहे हैं, के रूप में बेहद फायदेमंद है, लेकिन वे आंतों न्यूरॉन्स 10 के अस्तित्व के लिए योगदान और neuronal कोशिका की सतह पर 11 देशी रिसेप्टर अभिव्यक्ति बनाए रखें. इसके अलावा, आंतों का glia की कमियों 'न्यूरो gliopathies' 12 गढ़ा असामान्य जठरांत्र गतिशीलता रोग राज्यों को जन्म दे सकती है. इसलिए, सत्ता संस्कृति यहाँ प्रस्तुत आरजांच के लिए परिपक्व हैं कि कई प्रकार की कोशिकाओं में esults.
इस पद्धति के फायदे अलगाव, सस्ता उपकरण आवश्यकताओं, और अनुभवी प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा तकनीक मास्टर करने के लिए एक कम समय में आसानी रहे. कार्यप्रणाली की सीमाएं कम समग्र सेल उच्च ऊतक संस्करणों से उपज और mucosal और submucosal plexi से सत्ता न्यूरॉन्स के बहिष्कार में शामिल हैं. यह प्रक्रिया इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, immunohistochemistry, एकल कोशिका पीसीआर, और अन्य तरीकों में विशेषज्ञता विद्वानों के लिए अत्यधिक लाभप्रद होगा.
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Protocol
सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के अनुसार थे और वर्जीनिया कॉमनवेल्थ विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी.
1. 24 अच्छी तरह प्लेटें में बाँझ पाली डी लाइसिन और laminin-लेपित गिलास coverslips की तैयारी
- चरण 1 के लिए सभी प्रक्रियाओं बाँझ परिस्थितियों में प्रदर्शन कर रहे हैं, एक हुड के नीचे, और बाँझ अभिकर्मकों के साथ. कांच coverslips और डबल विआयनीकृत पानी (DDH 2 हे) अग्रिम निष्फल होना चाहिए. प्लेटों की तैयारी न्यूरॉन अलगाव से पहले दो सप्ताह तक किया जा सकता है.
- हुड के तहत, एक 24 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं में autoclaved कांच coverslips जगह को बाँझ संदंश का उपयोग करें.
- समय से आगे पाली डी lysine स्टॉक तैयार. 5 मिलीग्राम पाली डी lysine को बाँझ ddH2O की 50 मिलीलीटर जोड़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर भंवर और 3 मिलीलीटर aliquots में दुकान उपयोग करने से पहले aliquots के पिघलना.
- पिपेट 80 μl: 25 2 सेमी प्रति 1 मिलीलीटर पाली डी lysine शेयर के अंतिम एकाग्रता के लिएप्रत्येक गिलास coverslip (2 सेमी 2) के शीर्ष पर पाली डी lysine शेयर की. समाधान 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करते हैं.
- पाली डी lysine का उपयोग कर वैक्यूम निकालें और बाँझ DDH 2 ओ के साथ 3x coverslips कुल्ला
- प्लेटों हुड के तहत कम से कम 2 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें.
- प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस या में संग्रहित किया जा सकता है - 20 डिग्री सेल्सियस laminin कोटिंग करने के लिए आगे बढ़ने से पहले.
- समय से आगे laminin स्टॉक तैयार. बर्फ पर laminin पिघलना और उपयोग के दौरान बर्फ पर रहते हैं. 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के लिए पतला, बहुत एकाग्रता पर ध्यान देना, प्रत्येक बहुत अलग हो जाएगा. बहुत एकाग्रता पर निर्भर करता है, लगभग 20 मिलीलीटर DDH 2 हे laminin की प्रत्येक शीशी में जोड़ दिया जाएगा. -80 पर विभाज्य (5 मिलीग्राम) और दुकान डिग्री सेल्सियस उपयोग करने से पहले बर्फ पर aliquots के पिघलना.
- 5 ग्राम / 2 सेमी laminin के साथ कोट coverslips, प्रत्येक coverslip पर laminin के शेयर की पिपेट 200 μl.
- 1 घंटे के लिए coverslips पर laminin समाधान सेते हैं.
- शेष laminin समाधान महाप्राण और के साथ एक बार coverslips कुल्लाDDH 2 ओ Coverslips के सतह scraping से बचें.
- दो सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्लेटें.
2. न्यूरॉन अलगाव समाधान की अग्रिम तैयारी
- (: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 2 4 पीओ, 1.2 4 MgSO, 25 3 NaHCO, 11 ग्लूकोज, और 2.5 2 CaCl नाह मिमी में) क्रेब्स समाधान तैयार है. जगह 13.79 छ NaCl (परिवार कल्याण 58.44), 0.686 ग्राम KCl (परिवार कल्याण 74.55), 0.312 ग्राम नाह 2 पीओ 4 (परिवार कल्याण 120), 0.289 ग्राम 4 MgSO (परिवार कल्याण 120.4), 4.20 ग्राम 3 NaHCO (परिवार कल्याण 84.01), 3.96 ग्राम ग्लूकोज (परिवार कल्याण 180.2), और 2 एल DDH 2 0 में 0.555 ग्राम 2 CaCl (परिवार कल्याण 111). 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा
- मीडिया (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और कवकनाशी / एंटीबायोटिक के साथ F12 के मीडिया) कुल्ला तैयार: F12 को मीडिया की एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए, 50 एमएल FBS और कवकनाशी / एंटीबायोटिक 100x तरल (Gibco) के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
- आंतों का न्यूरॉन मीडिया (Neurobasal बी 27 के साथ एक मीडिया, 2 मिमी एल glutamine, 1% FBS, 10 एनजी / एमएल, glial व्युत्पन्न Neurotr तैयारophic फैक्टर (GDNF), और कवकनाशी / एंटीबायोटिक 100x लिक्विड). GDNF स्टॉक बनाने के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस से कम 10 ग्राम GDNF के लिए 1 मिलीलीटर ddH2O जोड़ने के लिए और 50 μl aliquots, दुकान में वापस फ्रीज पूरा न्यूरॉन मीडिया के एक 50 मिलीलीटर शीशी के लिए, 47.5 मिलीलीटर Neurobasal एक मीडिया, 1 मिलीग्राम बी 27 (50x), 500 μl FBS, 500 μl 200 मिमी एल glutamine (Gibco) 50 μl GDNF के शेयर, और 500 μl एंटीबायोटिक / गठबंधन कवकनाशी 100x तरल. मीडिया GDNF की ताजगी सुनिश्चित करने के लिए है और यह महंगा सेल मीडिया मिश्रण की बड़ी मात्रा के संक्रमण से बचने के लिए छोटे 50 मिलीलीटर बैचों में किया जाता है.
3. चूहे से फसल अनुदैर्ध्य बलवान / myenteric जाल (LMMP) तैयार करना
- पशु प्रयोगों प्रदर्शन से पहले उपयुक्त राष्ट्रीय और संस्थागत नैतिकता जगह में होना चाहिए. 25 ग्राम (आमतौर पर उम्र के 8 सप्ताह से अधिक) से अधिक वजन वयस्क स्विस वेबस्टर चूहों पूर्व प्रयोगों से 6 के समूह में रखे जाते हैं. दो चूहों से ऊतकों ileal आंतों न्यूरॉन्स और glia के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है और तीन चूहों के लिए उपयोग किया जाता हैcolonic कोशिकाओं के अलगाव.
- शल्य चिकित्सा के क्षेत्र तैयार. छोटी सी शल्य कैंची, angled, संदंश, कपास swabs, तीन 200 मिलीलीटर कांच बीकर, और एक गिलास / प्लास्टिक रॉड (तूलिका) को इकट्ठा करो. सभी सामग्री को अच्छी तरह धोया और प्रदूषण को कम करने के लिए उपयोग करने से पहले rinsed हैं सुनिश्चित करें. इस कदम के प्रयोग के पहले दिन किया जा सकता है.
- पीएच स्थिर करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए carbogen (95% ऑक्सीजन, 5% सीओ 2) के साथ बर्फ और बुलबुला पर क्रेब्स समाधान रखें.
- वांछित तापमान पर स्थिर करने के लिए विभिन्न उपकरण और गर्म रसायनों पर मुड़ें, 37 के लिए गर्मी पानी स्नान (ओं) ° 4 डिग्री सेल्सियस, जगह हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) और नहाने के पानी में 0.5% trypsin (37 डिग्री सेल्सियस के लिए सी, शांत अपकेंद्रित्र ). पूरा न्यूरॉन मीडिया और कुल्ला मीडिया प्रशीतित रहना चाहिए.
- जगह 150 मिलीलीटर बर्फ ठंड 'गंदा', 'साफ', और 'LMMP' लेबल तीन 200 मिलीलीटर कांच बीकर में क्रेब्स bubbled. बुलबुला बीकर carbogen साथ 'LMMP' लेबल.
- नैतिकता समिति, Euthanize मीटर से मंजूरी के बादग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 asphyxiation द्वारा ouse.
- 70% EtOH के साथ शल्य चिकित्सा की सतह, साफ त्वचा पर पृष्ठीय लेटना में माउस रखें, और संदंश का उपयोग पेट की त्वचा उठा. कैंची, खुला पेट गुहा और आंतरिक पाचन अंगों प्रकट का उपयोग करना.
- लघ्वान्त्र के एक वर्ग को उठाने और उसके अन्त्रपेशी खुलासा द्वारा जठरांत्र संबंधी मार्ग की लंबाई निकालें. कैंची से अन्त्रपेशी के माध्यम से कटाव धीरे हटाने और लघ्वान्त्र / कोलन से अन्त्रपेशी खींचने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, लघ्वान्त्र और पेट को जानने की.
- आंत की पूरी लंबाई सुलझाया है, के बाद आंत के माध्यम से cecum करने के लिए पेट को बाहर का और समीपस्थ काटने से लघ्वान्त्र हटाने नोट:. इस प्रक्रिया को भी करने के लिए समीपस्थ को cecum करने के लिए बाहर से पेट के हटाने से colonic ऊतक के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है गुदा.
- टिश्यूज आगे प्रॉक्सिमल और बाहर बृहदान्त्र, और jejenum, और लघ्वान्त्र के बीच विभाजित किया जा सकता है. इस प्रक्रिया के बाकी लघ्वान्त्र के अलगाव का उल्लेख होगा, tवह प्रक्रिया पेट के LMMP के अलगाव के लिए एक ही है. बर्फ ठंड क्रेब्स 'गंदा' चिह्नित के साथ एक गिलास कंटेनर में पूरे लघ्वान्त्र रखें.
- लघ्वान्त्र साफ करने के लिए एक उपकरण बनाने के लिए, और एक फाइलिंग पत्थर का उपयोग कुंद एक बड़े 20 जी सुई बर्फ ठंड क्रेब्स युक्त एक बड़े सिरिंज (10 मिलीलीटर) को देते हैं.
- तीन या अधिक बड़े टुकड़ों में लघ्वान्त्र सेक्शनिंग द्वारा लघ्वान्त्र से fecal बात साफ करें. बीकर से एक ileal अनुभाग निकालें और एक ileal टुकड़ा के अंत में पा सुई जगह.
- सभी fecal बात एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में हटा दिया जाता है जब तक धीरे पेट अनुभाग के माध्यम से क्रेब्स चलाते हैं. 'साफ' चिह्नित क्रेब्स के कंटेनर में साफ खंड रखें. पूरे लघ्वान्त्र साफ किया जाता है जब तक दोहराएँ.
- LMMP को निकालने के लिए लगभग 2, छोटे खंडों में लघ्वान्त्र काट - 4 सेमी. एक प्लास्टिक या कांच की छड़ पर लघ्वान्त्र का एक खंड प्लेस, लघ्वान्त्र snuggly फिट लेकिन (~ 2 मिमी) ढीला या तना हुआ नहीं होना चाहिए. धीरे अन्त्रपेशी के टुकड़े निकाल कर LMMP को हटाने शुरू करो अब भी देते हैंएक संदंश का उपयोग जठरांत्र (सैनिक) पथ के लिए एड. धीरे अंगूठे का उपयोग रॉड के लिए ट्यूब लगाए द्वारा छड़ी के चारों ओर घूर्णन से सैनिक पथ रोकें.
- अंतर्निहित परिपत्र मांसपेशी से LMMP अलग, पहले धीरे धीरे अनुदैर्ध्य मांसपेशी में एक अंतर बनाने, ऊपर से खंड के नीचे तक, अन्त्रपेशी जुड़ा था जहां पूरे रेखा के साथ संदंश के किनारे रगड़ें. फिर धीरे क्रेब्स के साथ गीला एक कपास झाड़ू का उपयोग कर अनुदैर्ध्य मांसपेशी दूर तंग.
- अनुदैर्ध्य मांसपेशी में अंतर के शीर्ष पर शुरू और अनुदैर्ध्य मांसपेशी सिर्फ परिपत्र मांसपेशी से अलग करने के लिए शुरू होता है जब तक बहुत हल्का दबाव लागू करने, जबकि lightest क्षैतिज स्ट्रोक का उपयोग कर दूर तंग, अन्त्रपेशी लगाव बिंदु के साथ पूरे पट्टी नीचे यह करते हैं.
- फिर धीरे सैनिक ट्यूब के आसपास काम करने के लिए शुरू, अनुदैर्ध्य मांसपेशी धीरे ट्यूब के आसपास परिपत्र मांसपेशी से सभी तरह से अलग है के रूप में ऊपर से नीचे और वापस करने के लिए घूम रहा है. जब पूरा,LMMP स्वाभाविक सैनिक ट्यूब के शेष उतर आएगा.
- 'LMMP' चिह्नित बीकर में अनुदैर्ध्य मांसपेशी के परिणामस्वरूप पतली पट्टी रखें. सभी वर्गों के लिए दोहराएँ.
- LMMP के सभी स्ट्रिप्स एक माउस से इकट्ठा किया गया है, के बाद इस्तेमाल किया जा रहा है किसी भी अन्य चूहों के लिए प्रक्रिया को दोहराने. अच्छी तरह से फिर से उपयोग करने से पहले 'गंदा' और 'साफ' बीकर कुल्ला.
- जैविक प्रदूषण को दूर करने के लिए 3x LMMP कुल्ला. बर्फ ठंड क्रेब्स के साथ तीन 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों भरें. एक अपकेंद्रित्र में 356 XG पर 30 सेकंड के लिए पहली ट्यूब और स्पिन में LMMP स्ट्रिप्स जगह 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटाने और अगले साफ क्रेब्स भरे ट्यूब LMMP स्ट्रिप्स चाल. प्रत्येक शेष ट्यूब के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
4. डाइजेस्ट LMMP
- 10 मिलीलीटर carbogen-bubbled क्रेब्स समाधान में 13 मिलीग्राम collagenase टाइप 2 और 3 मिलीग्राम बीएसए रखकर पाचन समाधान तैयार है.
- पाचन समाधान और उपयोग scis में rinsed LMMP की जगह खंडोंप्रायोजक छोटे टुकड़ों में LMMP कटाव.
- डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बरतन के साथ 37 पर 60 मिनट धीरे carbogen साथ bubbled किया जा रहा है समय के लिए डाइजेस्ट LMMP.
- पाचन के बाद पूरा हो गया, अपकेंद्रित्र में 356 XG पर 8 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा
- इस बिंदु से आगे सभी प्रक्रियाओं एक सेल संस्कृति हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए! सभी अभिकर्मकों और कंटेनरों के इस्तेमाल से पहले निष्फल होना चाहिए.
- Centrifugation के दौरान, 1 मिलीलीटर रखकर 0.05% trypsin समाधान तैयार 0.25% trypsin के गर्म और 4 मिलीग्राम एक बाँझ 50 मिलीलीटर सेल संस्कृति ट्यूब में HBSS के गरम.
- Centrifugation के बाद, हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. एक निर्वात का उपयोग न करें, यह संभावना कम centrifugation के गति के कारण सेल गोली चूसना जाएगा. ध्यान 0.05% trypsin समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ स्वच्छ ट्यूब में सेल गोली और जगह को हटा दें.
- 37 7 मिनट के लिए झटकों के साथ डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 0.05% trypsin समाधान में कोशिकाओं को पचाने. 7 मील से अधिक नहीं हैएन कुल trypsin उपचार या न्यूरॉन्स का नाश होगा.
- Trypsin उपचार के 7 मिनट के बाद ठंडे कुल्ला मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर.
- 356 x जी पर 8 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. निकालें और मीडिया त्यागें.
- Centrifugation के दौरान, एक बाँझ 15 मिलीलीटर सेल संस्कृति ट्यूब के शीर्ष पर निष्फल Nitex जाल का एक खंड संतुलन.
- Centrifugation के बाद, हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 3 मिलीग्राम पूरा न्यूरॉन मीडिया में triturating द्वारा धीरे resuspend सेल मिश्रण. इस कदम और सेल मिश्रण triturated है जिसमें भविष्य की सभी चरणों के दौरान हवाई बुलबुले पैदा करने से बचें. सभी triturations बहुत धीरे से किया जाना चाहिए. साफ 15 मिलीलीटर सेल संस्कृति ट्यूब में Nitex जाल के माध्यम से फिल्टर सेल समाधान.
- वैकल्पिक: कैप सेल संस्कृति ट्यूब और 30 मिनट के लिए कोमल रोलिंग और झुकाव के साथ प्रशीतित Hula मिक्सर में जगह (या रोटेशन प्रदान करता है कि किसी भी मिक्सर). यह कदम वैकल्पिक लेकिन अनुशंसित है.
- वैकल्पिक: Hula मिक्सर के बाद, कोशिकाओं को धोने के लिए 2 मिलीलीटर ठंड कुल्ला मीडिया जोड़ें.
- Centrifugation द्वारा कोशिकाओं (8 मिनट, 356 XG) को इकट्ठा करो. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 1,200 μl पूरा न्यूरॉन मीडिया में कोशिकाओं Resuspend. धीरे 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग कोशिकाओं Triturate. हवाई बुलबुले उत्पन्न न करें. ज्यादातर हिस्सा टूट जाता है और कोशिकाओं तरल में निलंबित कर रहे हैं जब तक धीरे धीरे और धीरे पिपेट.
- एक पूर्व लेपित गिलास coverslip युक्त 12 कुओं में से प्रत्येक के लिए पूरा मीडिया के 750 μl जोड़ें और triturated सेल समाधान के 100 μl जोड़ें.
- 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में न्यूरॉन्स सेते हैं.
- सेल मीडिया हर 2 दिनों के आधे बदलें.
- न्यूरॉन्स के बाद 1 electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तैयार हैं - संस्कृति में 2 दिनों के लिए.
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Representative Results
LMMP व्युत्पन्न कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के तुरंत बाद अलगाव तत्काल स्पष्ट नहीं किया जाएगा. लिविंग, अस्पष्ट phenotype के दौर कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह अधूरे पचा ऊतक टुकड़े और संयोजी ऊतक से ऊतक कतरे के रूप में देखा जा सकता है. इस flotsam कोई चिंता का विषय है और मोटे तौर पर दो दिनों में पहली बार मीडिया के परिवर्तन के साथ हटा दिया जाएगा. स्वस्थ, व्यवहार्य कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से निकाल दिया जाएगा, के रूप में इस से पहले स्लाइड साफ करने का प्रयास न करें.
संस्कृति में एक दिन के बाद, न्यूरॉन्स neurite परिणाम दिखाने के लिए शुरू हो जाएगा. न्यूरॉन्स की विशिष्ट पहचान अभी भी इस समय अस्पष्ट हो सकता है. कोशिकाओं को एक प्रायोगिक कक्ष को स्थानांतरित करने के लिए काफी अनुयायी हैं, बशर्ते वे संस्कृति के एक दिन बाद electrophysiological अध्ययन के लिए तैयार हो जाएगा. 5 - हालांकि, कोशिकाओं को लगभग दिन 2 से संस्कृति और समारोह के अध्ययन के लिए आदर्श (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम इमेजिंग) में दो दिनों के बाद और अधिक अनुयायी हैं.
ईएनटी "> न्यूरॉन के morphological सुविधाओं संस्कृति में लगभग एक सप्ताह (चित्रा 1) के बाद अलग हो जाते हैं. न्यूरॉन्स (glia साथ interspersed फैशन की तरह लगभग एक 'ganglionic' में लंबे समय के अनुमानों को प्रदर्शित करने और बढ़ने जब आदर्श immunocyctochemical सुविधाओं, के बारे में दस दिनों के बाद पहचाना जा सकता है चित्रा 2). यह धुंधला यह इस पद्धति का उपयोग कर इन कोशिकाओं की synaptic बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव हो सकता है.संस्कृति में एक दिन के बाद, न्यूरॉन्स उनके साइन कुए गैर या 'निर्णायक सुविधा', कार्य क्षमता (चित्रा 3) द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. Electrophysiologically, वे कार्यात्मक रूप में कम से कम दो neuronal प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है: एक के बाद hyperpolarization होते हैं कि न्यूरॉन्स और सोडियम और पोटेशियम और एक के बाद hyperpolarization और काफी कम सोडियम और पोटेशियम चालकता (चित्रा नहीं है कि न्यूरॉन्स की वर्तमान / घनत्व संबंधों में वृद्धि हुई 4). AHP सकारात्मक और नकारात्मक पताeurons क्रमश: एएच और पिछले गिनी काम में देखा एस न्यूरॉन्स के साथ सहसंबंधी दिखाई देते हैं. AHP नकारात्मक न्यूरॉन्स (एस न्यूरॉन्स) शाखाओं जो कई बार एक लंबे प्रक्षेपण किया है जबकि AHP सकारात्मक न्यूरॉन्स (एएच न्यूरॉन्स), सेल शरीर के चारों ओर से होने वाले कई लंबी अनुमानों है. यह चित्र 1 में immunocytochemical कोडिंग के साथ संयोजन के रूप में, कि neuronal आबादी बहुत विषम है पता चलता है.
चित्रा 1. माउस अनुदैर्ध्य मांसपेशियों से अलग आंतों न्यूरॉन्स और glia की immunohistochemical लक्षण वर्णन. Confocal माइक्रोस्कोपी पूरे माउंट ileal अनुदैर्ध्य मांसपेशी में neuronal विशेष β-III ट्यूबिलिन (Abcam, खरगोश, 1:1,000) धुंधला (ए) माउस से तैयारी का पता चला. सेल अलग एल सेcalbindin (सी) (Chemicon, खरगोश, 1:1,000) और calretinin (डी) के लिए सकारात्मक दाग है; ongitudinal मांसपेशी / myenteric जाल (LMMP) की तैयारी न्यूरॉन्स (β-III ट्यूबिलिन, Abcam, खरगोश, 1:1,000 बी) के होते हैं (Swant, खरगोश, 1:2,000). Glia कोशिकाओं (ई) glia विशिष्ट मार्कर GFAP (Chemicon, माउस, 1:500) के साथ देखे गए थे. एंटीबॉडी उपयुक्त बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा 488 (हरा, आण्विक जांच, 1:1,000) 0 के माध्यम से कल्पना थे. नाभिक Hoescht 33342 (नीले, तटरक्षक, 1 ग्राम / एमएल) का उपयोग करते हुए कल्पना थे. प्राथमिक एंटीबॉडी (एफ) छोड़ा जाता था जब कोई धुंधला देखा गया था. . संशोधित और स्मिथ, वें, एट अल से reprinted अफ़ीम सोडियम चैनल के निषेध के माध्यम से आंत्र न्यूरॉन excitability घट जाती है एक PLoS, डोई:... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें <./ P>
चित्रा 2. माउस अनुदैर्ध्य मांसपेशियों से अलग न्यूरॉन्स और glia एक दूसरे के करीब निकटता में हो जाना. Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों न्यूरॉन्स (हरा, β-III ट्यूबिलिन, Abcam, खरगोश, 1:1,000) और glia (लाल, GFAP, Chemicon, माउस का संकेत , 1:500) आसानी से एक दूसरे से सटे बढ़ने और इन विट्रो में बातचीत करने के लिए दिखाई देते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. सुसंस्कृत आंतों न्यूरॉन्स और glia के इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी. घन मेंrrent दबाना मोड, सभी न्यूरॉन्स (ए) के मौजूदा इंजेक्शन पर कार्रवाई क्षमता का प्रदर्शन किया. Glia (बी) कार्रवाई क्षमता नहीं है, लेकिन वर्तमान इंजेक्शन के जवाब में बड़े इलेक्ट्रोटोनिक क्षमता को प्रदर्शित करते हैं. एक सूचना और प्रसारण -0.01 एनए के एक वर्तमान इंजेक्शन के साथ शुरू और ग्यारह 0.01 एनए चरणों में 0.09 एनए को बढ़ाने में प्रोटोकॉल. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
4 चित्रा. माउस लघ्वान्त्र से सुसंस्कृत न्यूरॉन्स एक electrophysiologically विषम जनसंख्या हैं. वर्तमान दबाना मोड, कार्रवाई क्षमता में न्यूरॉन्स परिणाम में 0.09 एनए के एक वर्तमान इंजेक्शन में. एस न्यूरॉन्स (ए), तुरंत आराम झिल्ली क्षमता च के लिए वापसीउत्तेजना ollowing. एएच प्रकार न्यूरॉन्स (बी) के आराम झिल्ली क्षमता धीरे प्रारंभिक मूल्य पर लौटने से पहले नीचे आधारभूत गिर जाता है, जिसमें उत्तेजना के बाद एक afterhyperpolarization (AHP) प्रदर्शित करते हैं. . संशोधित और स्मिथ, वें, एट अल से reprinted अफ़ीम सोडियम चैनल के निषेध के माध्यम से आंत्र न्यूरॉन excitability घट जाती है एक PLoS, डोई:.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).
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Discussion
खेतों में पशु
इस प्रोटोकॉल स्विस वेबस्टर चूहों के लिए अनुकूलित किया गया है. हालांकि, इस पद्धति चूहों जैसे अन्य छोटे आकार के स्तनधारियों के लिए और चूहों की अन्य उपभेदों के लिए आसानी से अनुकूल है. हम सफलतापूर्वक C57 चूहों और μ-opioid रिसेप्टर दस्तक बहिष्कार के साथ प्रारंभिक isolations प्रदर्शन किया है. हालांकि, यह चूहों की अन्य उपभेदों सैनिक पथ में रूपात्मक बदलाव के कारण समस्याग्रस्त हो सकता है कि यह भी संभव है. इसके अलावा, अंतिम अलगाव में न्यूरॉन्स के परिणामस्वरूप मिश्रण को प्रभावित कर सकते हैं जो LMMP तैयारी 13 के neuronal circuitry में माउस उपभेदों के बीच में जाना जाता मतभेद (बनाम / Balb ग C57BL / 6) हैं. इसके अतिरिक्त, उम्र इस पद्धति का उपयोग करते समय उम्र से संबंधित neuronal नुकसान cholinergic न्यूरॉन्स और उनके इसी glia के लिए विशिष्ट हैं कि myenteric जाल में होते हैं, के रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए, और 14 साल की उम्र के 12 महीने के रूप में जल्दी के रूप में देखा जा सकता है. अंत में, अन्य तकनीक और नवीनता के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल जबजानवरों की तों, देखभाल myenteric जाल बल्कि परिपत्र मांसपेशी से जुड़ी शेष से अनुदैर्ध्य मांसपेशी के साथ भाग आता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए.
टिशू
न्यूरॉन्स और glia इस प्रोटोकॉल का उपयोग लघ्वान्त्र और पेट दोनों से संवर्धित किया जा सकता है. Ileal isolations उपलब्ध ऊतक की एक बड़ी राशि और अनुदैर्ध्य मांसपेशी मोटी परिपत्र मांसपेशी से अलग करती है, जिस पर आसानी के कारण प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं. दो जानवरों की एक न्यूनतम ऐसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या immunocytochemistry के रूप में आवेदन के लिए 24 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं पर कब्जा करने की जरूरत है. colonic सामग्री के अलगाव अधिक समस्याग्रस्त है. मोटी colonic अनुदैर्ध्य मांसपेशी परिपत्र मांसपेशी से अलग करने के लिए और अधिक कठिन है. इसके अलावा, अंतर्निहित परिपत्र मांसपेशी आँसू करने के लिए इसे और अधिक शिकार बना, पेट में पतली है. कम से कम तीन पशुओं,, 12 wel के कब्जा करने की आवश्यकता है ताकि इसके अलावा, पेट के लघ्वान्त्र की तुलना में काफी कम है24 अच्छी तरह से थाली की रास. लघ्वान्त्र और पेट काटा और एक ही पशु से अलग चढ़ाया, लेकिन अतिरिक्त जानवरों या कम सेल चढ़ाना क्षेत्र के उपयोग के पेट के अलगाव के लिए आवश्यक हो जाएगा किया जा सकता है दोनों.
सेल संस्कृति की अवधि
Electrophysiological रिकॉर्डिंग बेहतर संस्कृति में 2 से 6 दिन के बाद पृथक न्यूरॉन्स आंतों / glia में प्रदर्शन कर रहे हैं, इस समय कोशिकाओं के एक पूरे सेल मुहर बनाने के लिए गोल और कोमल, आदर्श स्थिति है. संस्कृति कोशिकाओं में एक सप्ताह के बनने के बाद चापलूसी और कोशिकाओं की थाली का पालन के रूप में अधिक नेत्रहीन भेदभाव. कोशिकाओं को और अधिक मजबूती से थाली से जुड़े होते हैं जब immunocytochemical प्रयोगों सबसे अच्छा कई धोने चरणों के दौरान सेल नुकसान को रोकने के लिए, दिन 10 के आसपास, कर रहे हैं. माउस आंतों की कोशिकाओं को तीन सप्ताह तक के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया है. समय के साथ रिसेप्टर और न्यूरोट्रांसमीटर अभिव्यक्ति के पैटर्न इन संस्कृतियों में अध्ययन किया जाना बाकी है. Neuronal अस्तित्व पर हालांकि, पिछले अध्ययनोंऔर पारंपरिक गिनी पिग आंतों का न्यूरॉन isolations में जैव रासायनिक / भेदभाव रूपात्मक न्यूरॉन्स 15 दिनों के लिए बच गया और ऊपर अन्य जानवरों स्रोतों से प्राप्त न्यूरॉन्स भी ऐसा ही हो सकता है जो तीन सप्ताह 8, histochemical और रूपात्मक गुणों का एक उच्च स्तर को बनाए रखने में पाया है कि .
सेल यील्ड
लघ्वान्त्र से अलग है जब इस तकनीक से कोशिकाओं की कुल उपज दो चूहों से एक 24 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं है. Myenteric जाल कुल आंत की दीवार के 1% से कम के होते हैं, क्योंकि यह ऊतक की मात्रा की तुलना में न्यूरॉन्स की एक अपेक्षाकृत कम संख्या है. इस विधि के लिए एक वापसी प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए, एक का इस्तेमाल पशुओं की संख्या बढ़ाने चाहिए. जानवरों की संख्या बढ़ रहे हैं, यह कई प्रयोगशाला सदस्यों LMMP के अलगाव के पहले कदम में सहयोग का सुझाव दिया है. इस अंतिम पी से पहले कोशिकाओं को एक बाधित राज्य में कर रहे हैं समय की राशि कम कर देता हैlating और यह बढ़ जाती सेल अस्तित्व.
सेल घनत्व
लिखित रूप में, इस प्रोटोकॉल कम घनत्व सेल संगम (- संस्कृति में एक दिन के बाद मापा 40% ~ 10) की एक ileal अलगाव उपज के लिए दो जानवरों का उपयोग करता है. कम घनत्व सेल चढ़ाना अंतिम संस्कृति में संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए इस पद्धति में आदर्श है. एकल कक्ष इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी किया जाता है जब यह भी उपयोगी है. सेल संख्या अधिक पशुओं का उपयोग कर या अंतिम चढ़ाना क्षेत्र, लेकिन संदूषण का खतरा बढ़ जाता कम करके बढ़ाया जा सकता है. उच्च सेल घनत्व की आवश्यकता होती है जब इस समस्या को बंद सेट, या तो कदम या एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग में वृद्धि धोने का सुझाव दिया है की वृद्धि हुई.
सेल विविधता
इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल न्यूरॉन्स के रूप में electrophysiological लक्षण वर्णन से संकेत कम से कम दो कार्यात्मक अलग आबादी, (चित्रा 3) के शामिल हैं. हालांकि, कई ज्ञात प्रकार हैं गिनी पिग 15 और उसी में पाया विशिष्ट नयूरोचेमिकल कोडन पैटर्न के साथ न्यूरॉन्स शायद माउस का सच है की. यह सेल विविधता इस पद्धति के लिए एक फायदा और नुकसान दोनों है. दूसरों के बीच में, immunocytochemistry में या सेल सेल बातचीत के अवलोकन के एकल कक्ष कार्यात्मक अध्ययन, जब प्रदर्शन सेल विविधता फायदेमंद है. संस्कृति में न्यूरॉन / glia बातचीत (चित्रा 3) का अध्ययन करते समय सेल विविधता विशेष रूप से लाभप्रद हो सकता है. हालांकि, सेल विविधता जैसे प्रोटीन अभिव्यक्ति, आदि में परिवर्तन, किसी भी एक प्रकार की कोशिका या न्यूरॉन प्रकार के लिए योगदान नहीं किया जा सकता है, जहां immunoblotting के तरीके के लिए एक बाधा है. Intraganglionic और इंट्रामस्क्युलर आंतों का glia 16: केवल दो उपप्रकार LMMP तैयारी में अस्तित्व के लिए दिखाए जाते हैं के रूप में glia की परीक्षा में कम समस्याग्रस्त हो जाएगा. अन्य प्रकार की कोशिकाओं को भी इस तरह के Cajal या fibroblasts की बीचवाला कोशिकाओं के रूप में, इस संस्कृति में मौजूद हो सकता है.
ep "> चढ़ाना कोशिकाओंइस पद्धति में, कोशिकाओं बारह कुओं में चढ़ाया जाता है. कभी कभी, इन कुओं में से एक या दो अलगाव के बाद पहली बार दिन में प्रदूषण का विकास होगा. यदि ऐसा होता है, दूषित कुओं से स्लाइड तुरंत खारिज कर रहे हैं और अच्छी तरह से शेष प्रदूषण को मारने के लिए 70% इथेनॉल के साथ rinsed है. इस प्रोटोकॉल कम कुओं में या एक ही थाली में अलग कक्षों के सभी, और एक परिणाम के रूप में थाली करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, प्रदूषण का खतरा बढ़ जाएगा. फिर, जब संदूषण वृद्धि, अतिरिक्त धोने कदम या बढ़ा एंटीबायोटिक इस्तेमाल के जोखिम का सुझाव दिया है. प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एंटीबायोटिक / कवकनाशी तरल (Gibco) Amphotericin बी, स्ट्रेप्टोमाइसिन, और पेनिसिलीन के होते हैं. अन्य एंटीबायोटिक संयोजन या वृद्धि की सांद्रता कुल्ला और न्यूरॉन मीडिया पूरा तैयार करते समय संदूषण की कमी का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
संलग्न कोशिकाओं
कोशिकाओं पर चढ़ाया जाता हैcoverslips के laminin और पाली डी lysine के साथ लेपित. Laminin आंतों न्यूरॉन्स और glia के अस्तित्व में महत्वपूर्ण है, और neurite परिणाम और neuronal विकास 17 को प्रोत्साहित करती है, और इस तरह के रूप में, इस अलगाव के लिए आवश्यक माना जाता है. हालांकि, इस तरह ओर्निथिन या Matrigel, के रूप में, पाली डी lysine के लिए वैकल्पिक लगाव कारक के रूप में वांछित की कोशिश की जा सकती है.
अंत में, इस अलगाव आंतों न्यूरॉन्स और अध्ययन तकनीक की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त glia की एक मिश्रित संस्कृति प्रदान करता है. इस पद्धति, गुरु के लिए आसान, सस्ती और समय कुशल है. यह इस सेल मॉडल सत्ता के साथ जुड़े विभिन्न विकृतियों की समझ में योगदान करेगा कि हमारी आशा है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रमुख प्रतिस्पर्धी हितों है कि अस्तित्व की घोषणा.
Acknowledgments
स्वास्थ्य अनुदान DA024009 के राष्ट्रीय संस्थान, DK046367 और T32DA007027.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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