Summary
Vi har vist en cellekultur protokoll for direkte studium av neuronal og glial komponenter av enterisk nervesystem. En nervecelle / glia blandet kultur på Dekkglass er forberedt fra myenteric plexus av voksen mus gir muligheten til å undersøke enkelte nervecellen og gliaceller funksjon av elektrofysiologi, immunohistochemical,
Abstract
Den enteriske nervesystemet er et stort nettverk av nevroner og gliaceller kjører lengden av mage-tarmkanalen som funksjonsmessig styrer gastrointestinal motilitet. En fremgangsmåte for isolering og kulturen i en blandet populasjon av neuroner og gliaceller fra myenteric plexus er beskrevet. Den primære kulturer kan opprettholdes i over syv dager, med forbindelser utviklingsland blant nevroner og gliaceller. Den langsgående muskel strimmelen med den tilknyttede myenteric plexus blir strippet fra den underliggende sirkulære muskel i ileum eller colon mus og underkastet enzymatisk fordøyelsen. I sterile forhold, er den isolerte nevronale og gliaceller befolkningen bevart innenfor pellet følgende sentrifugering og belagt på dekkglass. Innen 24-48 hr, oppstår neurite utvekst og nerveceller kan identifiseres ved pan-nevrale markører. Etter to dager i kultur, isolerte nevroner brann aksjonspotensialer som observert av patch clamp studier. Videre kan enteriske gliaceller også være identifIED av GFAP farging. Et nettverk av nevroner og gliaceller i nært apposition danner innen 5 - 7 dager. Enteriske nevroner kan være individuelt og direkte studert ved hjelp av metoder som immunhistokjemi, elektrofysiologi, kalsium bildebehandling, og encellede PCR. Videre kan denne framgangsmåten utføres i genetisk modifiserte dyr. Denne metodikken er enkel å utføre og billig. Samlet eksponerer denne protokollen komponentene av det enteriske nervesystemet i en lett manipuleres måte, slik at vi kan bedre oppdage funksjonaliteten til ENS i normale og sykdomstilstander.
Introduction
Den enterisk nervesystem (ENS) er store nettverk av nerver og gliaceller som går langs hele lengden av det gastrointestinale (GI). ENS styrer funksjonelt alle aspekter av fordøyelsen, inkludert peristalsis, væske absorpsjon / sekresjon, følelse av stimuli, osv. (for gjennomgang se 1). Den inneholder over 500 millioner nevroner, mer enn funnet i ryggmargen, og inneholder alle nevrotransmitter klasse funnet i hjernen. Videre er ENS unikt ved at det kan fungere reflexively uten inndata fra sentralnervesystemet 2.. Forståelse av ENS er avgjørende, ikke bare for å forstå normal fysiologisk rolle, men å forstå sitt engasjement i en rekke nevropatier som kan være medfødt (Hirschsprung sykdom), ervervet (Chagas), sekundært til sykdom stater (diabetisk gastroparese), narkotika -indusert (Opioid tarm syndrom), eller på grunn av skade (postoperativ ileus) 1. I tillegg kan enteriske neuroner være en reservoir for viral infeksjon (varicella zoster) tre. På grunn av dets likheter med hjernen og de høye nivåer av serotonin i tarmen, medikamenter rettet mot behandling av sentralnervesystemforstyrrelser defekter ofte har uønskede bivirkninger på ENS 2.. Det er også verdt å merke at mange nevropatier så som Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom viser lignende cellulære forandringer i de enteriske neuroner lenge før deres opptreden på sentrale neuroner, noe som gjør den ENS en tilgjengelig modell for å studere patogenesen av slike sykdommer 4.. Derfor, er en grundig forståelse av den ENS en nødvendighet for å forstå sykdomstilstander og forebyggelse / forutsi farmakologiske bivirkninger.
Nervecellene i ENS har tradisjonelt blitt studert i marsvin hjelp wholemount forberedelser 5-7 eller dyrkede nerveceller åtte. Til tross for den enkle som nevroner kan studeres i dette store dyret, har denne modellen mange begrensninger inkludertmangel av genmodifiserte stammer, mangel av reagenser som er spesifikke for denne arten, og den høye kostnadene forbundet med bestilling og huser disse fagene. Utviklingen av en murin enterisk nervesystem modellen har den unike fordelen med forskjellige knock out-systemer, et stort utvalg av andre etablerte metoder som kan brukes i forbindelse med den cellekultur teknikk, og evnen til å gi en validering for marsvin-modellen .
ENS er sammensatt av tre pleksi som kjører lengden av mage-tarmkanalen: det ytre myenteric plexus (mellom den langsgående og sirkulære muskel) som er hovedsakelig ansvarlig for de peristaltiske handlinger av tarmen, så vel som den submukosal og slimhinne-pleksi, ( ligger under og inne i slimhinner, henholdsvis) som i stor grad styrer fluid absorpsjon / sekresjon og påvisning av en stimuli. Denne fremgangsmåte begynner med isolering av den langsgående muskel / myenteric plexus (LMMP) preparat ved å skrelleav den ytre muskel laget av GI-systemet. Dette reduserer dramatisk ned på forurensning problemer som oppstår når det mucosal lag er involvert i isoleringen. Som et resultat av denne prosessen er ideell for studiet av neuronal kontroll av motiliteten i stedet for sekretoriske handlinger av ENS.
Metoden som presenteres her resulterer i en blandet kultur av enteriske neuroner og gliaceller. Minst to forskjellige typer av neuroner til stede basert på tidligere observasjoner elektrofysiologiske og immuncytokjemisk 9. Tilstedeværelsen av gliaceller er svært fordelaktig, som de er ikke bare en viktig celletype å studere i sin egen rett, men de bidrar til overlevelsen av enteriske nevroner 10 og vedlikeholde innfødte reseptor uttrykk på neuronal celleoverflaten 11. Videre kan mangler av enteriske glia føre til unormale gastrointestinal motilitet sykdomstilstander, innførte 'nevro-gliopathies' 12. Derfor presenterte ENS kulturen her results i flere celletyper som er moden for etterforskning.
Fordelene til denne metodikken er enkel isolasjon, billig verktøy krav, og kort tid å mestre teknikken av erfarne lab personell. Begrensninger av metodikken inkluderer lav total celle utbytte fra høye vev volumer og utelukkelse av ENS nevroner fra slimhinnene og submukøst plexi. Denne prosedyren vil være svært fordelaktig for forskere som spesialiserer seg på elektrofysiologi, immunhistokjemi, encellede PCR, og andre metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer var i samsvar med og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee ved Virginia Commonwealth University.
En. Utarbeidelse av Sterile Poly-D-lysin-og Laminin-belagt glass Dekkglass i 24-brønners plater
- Alle prosedyrer for trinn 1 er utført i sterile betingelser, under en hette, og med sterile reagenser. Glass Dekkglass og dobbel avionisert vann (DDH 2 O) bør steriliseres på forhånd. Fremstilling av plater kan gjøres opp til to uker før neuron isolasjon.
- Under panseret, bruk steril pinsett til å plassere autoklaveres glass Dekkglass i 12 brønner på en 24-brønners plate.
- Forbered poly-D-lysin lager forhånd. Tilsett 50 ml sterilt ddH2O til 5 mg poly-L-lysin. Vortex og butikk i 3 ml deler ved -20 ° C. Tine alikvotene før bruk.
- For en endelig konsentrasjon på 1 ml poly-D-lysin lager per 25 cm 2: 80 ul pipetteav poly-D-lysin lager på toppen av hver glass dekkglass (2 cm 2). La løsningen takke med 10 min.
- Fjern poly-D-lysin hjelp av vakuum og skyll Dekkglass 3x med sterilt DDH 2 O.
- Tillat platene til å tørke i minst 2 timer under hetten.
- Platene kan lagres ved 4 ° C eller - 20 ° C før videre til laminin belegg.
- Forbered laminin lager forhånd. Tine laminin på is og holde på is under bruk. Fortynn til en konsentrasjon på 50 ug / ml; ta hensyn til masse konsentrasjon; hvert parti vil være forskjellig. Avhengig mye konsentrasjon, vil omtrent 20 ml DDH 2 O legges til hvert hetteglass med laminin. Delmengde (5 ml) og oppbevar ved -80 ° C. Tine alikvotene på is før bruk.
- Frakk Dekkglass med 5 mikrogram / cm 2 laminin, pipette 200 mL av laminin lager på hver dekkglass.
- Inkuber laminin løsning på dekkglass i 1 time.
- Sug resterende laminin løsning og skyll Dekkglass gang medDDH 2 O. Unngå å skrape overflaten av dekkglass.
- Oppbevar plater ved 4 ° C i inntil to uker.
2. Advance Utarbeidelse av Neuron Isolation Solutions
- Forbered Krebs-oppløsning (i mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 4 PO, 1,2 4 MgSO, 25 3 NaHCO, 11 glukose, og 2,5 CaCl 2). Place 13.79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSo4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO3 (FW 84,01), 3,96 g glukose (FW 180,2), og 0.555 g CaCl 2 (FW 111) i to L DDH 2 0. Chill til 4 ° C.
- Forbered skylling media (F12 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika / antimykotisk): Til en 500 ml flaske med F12 medium, tilsett 50 ml FBS og 5 ml Antibiotikum / Anti-fungal 100x Liquid (Gibco).
- Forbered enteric nervecellen media (Neurobasal A media med B-27, 2 mM L-glutamin, 1% FBS, 10 ng / ml, Glial Avledet Neurotrophic Factor (GDNF), og antibiotika / Anti-fungal 100x væske). For å gjøre GDNF lager, tilsett 1 ml ddH2O til 10 mikrogram GDNF og fryse tilbake i 50 pl aliquoter, lagre ved -80 ° C. For en 50 ml hetteglass av komplette nervecellen media, kombinere 47,5 ml Neurobasal A media, 1 ml B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 pl 200 mM L-glutamin (Gibco) 50 pl GDNF lager, og 500 ul Antibiotika / antimycotic 100x Væske. Media blir laget i små 50 ml porsjoner for å sikre friskhet av GDNF og for å unngå forurensning av store mengder av dette dyre celle media blanding.
3. Innhøsting Langsgående Muscle / myenteric Plexus (LMMP) Forberedelse fra Mus
- Egnede nasjonale og institusjonelle etikk bør være på plass før du utfører dyreforsøk. Voksen Swiss Webster mus som veier over 25 g (typisk ved 8 ukers alder) er plassert i grupper på 6 før eksperimentene. Vev fra to mus brukes for isolering av ileale enteriske neuroner og gliaceller og tre mus brukes forisolering av colonic celler.
- Forbered kirurgiske området. Samle små kirurgiske sakser, vinklede tang, bomullspinner, tre 200 ml glass begerglass, og et glass / plast stang (pensel). Sørg for at alle forsyninger er grundig vasket og skylt før bruk for å minimere forurensning. Dette trinnet kan utføres på dagen før forsøket.
- Plasser Krebs-oppløsning på is og boble med carbogen (95% oksygen, 5% CO 2) i minst 30 min for å stabilisere pH-verdien.
- Slå på diverse utstyr og varme kjemikalier for å stabiliseres på ønsket temperatur, varme vannbad (r) til 37 ° C, avkjøle sentrifuge til 4 ° C, place Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og 0,5% trypsin i vannbad (37 ° C ). Komplett nervecellen media og skyll media bør forbli nedkjølt.
- Place 150 ml iskald boblet Krebs i tre 200 ml glass kanner merket "skitne", "ren", og "LMMP '. Bubble beger merket "LMMP" med carbogen.
- Etter godkjenning fra etisk komité, avlive mOuse ved halshugging eller CO 2 kvelning.
- Plasser musen i dorsal recumbence på kirurgisk overflaten, ren hud med 70% EtOH, og løft abdominal huden ved hjelp av tang. Ved hjelp av saks, åpne bukhulen og avsløre interne fordøyelsesorganer.
- Fjern lengden av mage-tarmkanalen ved å løfte en del av ileum og avsløre dens mesenteriet. Klipp gjennom mesentery med saks for å forsiktig fjerne og rakne ileum og tykktarm, være forsiktig med å trekke mesentery fra ileum / tykktarm.
- Etter at hele lengden av tarmen rekkes opp, fjerner ileum ved å skjære gjennom tarmen etter magen og proksimal til cecum Merk:. Denne fremgangsmåten kan også utføres med colonic vev ved å fjerne den fra kolon distalt til cecum til proksimalt til anus.
- Vevene kan videre deles mellom proksimale og distale colon, og jejenum, og ileum. Resten av denne fremgangsmåte vil referere til isolering av ileum; Than Prosedyren er den samme for isolering av tykktarmen LMMP. Legges hele ileum i en glassbeholder med iskald Krebs merket "skitten".
- Lage et verktøy for å rense ileum, sløv en stor 20 G nål ved hjelp av en filing stein og feste den til en stor sprøyte (10 ml) inneholder iskald Krebs.
- Rengjør avføring fra ileum ved seksjonering ileum inn i tre eller flere store biter. Ta en ileal delen fra begeret og plasser avstumpet nål inn i enden av en ileal stykke.
- Forsiktig kjøre Krebs gjennom tarmen delen til all avføring fjernes i en egen avfallsbeholder. Plasser den rengjorte delen i beholderen med Krebs merket "ren". Gjenta til hele ileum er renset.
- For å fjerne LMMP, kutt ileum i små segmenter, ca 2-4 cm. Plasser et segment av ileum på en plast eller glass stang; ileum bør passe godt plassert, men ikke være løs eller stram (~ 2 mm). Begynn fjernelse av LMMP ved å forsiktig fjerne biter av mesenteriet likevel festeges til gastrointestinale (GI) ved hjelp av en tang. Forhindre mage-tarmkanalen fra å rotere rundt stangen ved forsiktig feste røret til stangen ved hjelp av tommelen.
- Separer LMMP fra den underliggende sirkulære muskler, først forsiktig gni kanten av tang langs hele linjen der mesentery var festet, fra topp til bunn av segmentet, forsiktig skape et gap i den langsgående muskel. Deretter forsiktig erte bort langsgående muskel ved hjelp av en bomullspinne fuktet med Krebs.
- Begynn på toppen av gapet i den langsgående muskel og erte bort ved hjelp av den letteste horisontale slag, mens bruk meget lett trykk inntil det langsgående muskellag like begynner å skille fra den sirkulære muskel; dette nedover hele stripe langs mesenteriet festepunktet.
- Deretter forsiktig begynne å omgå GI rør; flytte fra topp til bunn og tilbake som den langsgående muskel er sakte separert fra den sirkulære muskler hele veien rundt røret. Når fullført,LMMP vil naturlig komme utenfor resten av GI-røret.
- Plasser den resulterende tynn stripe av langsgående muskel i begerglasset merket 'LMMP'. Gjenta for alle segmentene.
- Etter at alle strimler av LMMP har blitt samlet inn fra en mus, gjenta prosedyren for alle andre mus som brukes. Skyll de 'skitne' og 'rent' begre før gjenbruk.
- Skyll LMMP 3x å fjerne biologisk forurensning. Fyll tre 2 ml Eppendorf rør med iskald Krebs. Plasser LMMP strimlene i det første røret og sentrifugering i 30 sekunder ved 356 x g i en sentrifuge avkjølt til 4 ° C. Fjern forsiktig supernatanten med en pipette og flytte LMMP strips til neste rene Krebs fylt røret. Gjenta denne prosedyren for hver gjenværende tube.
4. Digest LMMP
- Forbered fordøyelse løsning ved å plassere 13 mg kollagenase type 2 og 3 mg BSA i 10 ml carbogen-boblet Krebs-oppløsning.
- Plasser segmenter av skylles LMMP i fordøyelsen løsning og bruk scissorer til klipp LMMP i bittesmå biter.
- Digest LMMP i 60 min ved 37 ° C i vannbad med shaker som samtidig er forsiktig boblet med carbogen.
- Etter fordøyelse er fullført, samles cellene ved sentrifugering i 8 minutter ved 356 xg i sentrifuge avkjølt til 4 ° C.
- Fra dette tidspunktet alle prosedyrer bør gjøres under sterile forhold i en cellekultur hette! Alle reagenser og beholdere bør steriliseres før bruk.
- Under sentrifugering forberede 0,05% trypsin-løsning ved å plassere en varmet ml 0,25% trypsin og 4 ml HBSS varmet i en steril 50 ml cellekultur rør.
- Etter sentrifugering, fjern og kast supernatanten. Ikke bruk et vakuum, og dette vil trolig suge opp cellen pellet grunnet lav sentrifugering hastigheter. Fjern forsiktig cellepelleten og fyll i rent rør med 5 ml av 0,05% trypsin-løsning.
- Fordøy-celler i 0,05% trypsin-løsning i 37 ° C vannbad med risting i 7 minutter. Ikke overskrid 7 min av total trypsin behandling eller nevroner vil omkomme.
- Nøytralisere trypsin med 10 ml kald skylling media etter 7 min av trypsin behandling.
- Sentrifuger cellene for 8 minutter ved 356 x g. Fjern og kast media.
- Under sentrifugering balansere en seksjon av sterilisert mesh Nitex på toppen av en steril 15 ml cellekultur rør.
- Etter sentrifugering, fjern og kast supernatanten. Forsiktig resuspender celle blanding av triturating i 3 ml komplette nervecellen media. Unngå å generere luftbobler under dette trinnet og alle fremtidige tiltak i hvilken celle blandingen blir støtt. Alle Triturations bør gjøres svært forsiktig. Filter celle løsning gjennom Nitex mesh i ren 15 ml cellekultur tube.
- Valgfritt: Cap cellekultur tube og plasser i nedkjølt Hula mixer (eller mikser som gir rotasjon) med milde rullende og tilting i 30 min. Dette trinnet er valgfritt, men anbefalt.
- Valgfritt: Etter Hula mikseren, tilsett 2 ml kald skylling media å vaske cellene.
- Samle cellene ved sentrifugering (8 min, 356 xg). Fjern og kast supernatanten.
- Resuspender celler i 1200 mL komplette nervecellen media. Triturate celler forsiktig ved hjelp av 1 ml plast pipette tips. Ikke generere luftbobler. Pipetter sakte og forsiktig til de fleste biter er brutt opp og cellene er suspendert i væske.
- Legg 750 pl komplett medium til hver av de 12 brønner inneholdende en pre-belagt glass dekkglass og tilsett 100 pl av den utgnidd celleløsning.
- Inkuber nevroner i cellekultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Endring halvcellen media hver 2 dager.
- Nerveceller er klar for elektrofysiologiske opptak etter 1 - 2 dager i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Umiddelbart etter isolering av LMMP-avledede celler, nerveceller og andre celletyper ikke vil være lett synlig. Living, kan runde celler av utydelig fenotype sees samt vev avfallsproduktene fra ufullstendig fordøyd vev fragmenter og bindevev. Denne drivgods er av ingen interesse og vil bli i stor grad fjernes med det første mediet endring i to dager. Ikke forsøk å rengjøre lysbildene før dette som de friske, levedyktige celler vil bli fjernet.
Etter en dag i kultur, vil nervecellene begynner å vise neurite utvekst. Spesifikk identifikasjon av nerveceller kan fortsatt være utydelig på dette tidspunktet. Forutsatt at cellene er vedheftende nok til å overføre til en eksperimentell kammer, vil de være klar for elektrofysiologisk undersøkelse etter en dags kultur. Men cellene er mer tilhenger etter to dager i kultur og ideelt for funksjon studier (elektrofysiologi, kalsium imaging) fra ca dagene 2-5.
ent "> Morfologiske trekk ved nervecellen blir tydelig etter ca en uke i kultur (figur 1). Ideal immunocyctochemical funksjoner kan identifiseres etter ca ti dager, når nevronene vise lange prognoser og vokse i en nesten 'ganglionic' som mote ispedd gliaceller ( figur 2). Denne farging antyder det kan være mulig å studere de synaptiske interaksjoner av disse cellene ved hjelp av denne metodikken.Etter en dag i kultur, er nevroner gjenkjennes på deres sinus que non eller 'definerende trekk', aksjonspotensialet (figur 3). Elektrofysiologisk, kan de funksjonelt klassifisert i minst to typer: neuronal neuroner som inneholder en etter-hyperpolarisering og økt strøm / tetthet forbindelser av natrium og kalium og neuroner som ikke har en etter-hyperpolarisering og betydelig mindre natrium-og kalium-konduktans (figur 4). AHP positive og negative neurons synes å sammenfalle med AH og S nevroner sett i forrige guinea arbeid, henholdsvis. AHP positive nevroner (AH nevroner) har flere lange anslag stammer fra rundt cellen kroppen, mens AHP negative nevroner (S nevroner) har en lang projeksjon som greiner mange ganger. Dette, i forbindelse med de immuncytokjemisk koding i figur 1, tyder på at neuronal populasjon er meget heterogen.
Figur 1. Immunhistokjemisk karakterisering av tarm nevroner og gliaceller isolert fra mus langsgående muskel. Konfokalmikroskopi avslørte neuronal-spesifikk β-III-tubulin (Abcam, kanin, 1:1.000) flekker i hele mount ileal langsgående muskel (A) forberedelse fra musen. Celler isolert fra longitudinal muskel / myenteric plexus (LMMP) preparater inneholder nevroner (B; β-III-tubulin, Abcam, kanin, 1:1.000) som flekke positivt for calbindin (C) (Chemicon, kanin, 1:1.000) og calretinin (D) (swant, kanin, 1:2,000). Gliaceller celler (E) ble visualisert med gliaceller-spesifikk markør GFAP (Chemicon, mus, 1:500). Antistoffer ble visualisert via passende geit sekundært antistoff Alexa 488 (grønt, Molecular sonder 1:1.000) 0. Kjerner ble visualisert ved hjelp av Hoescht 33342 (blå, CG, 1 pg / ml). Ingen farging ble sett når primære antistoff ble utelatt (F). . Modifisert og gjengitt fra Smith, TH, et al Morfin Reduserer Enteric Neuron Excitability via Hemming av natriumkanalene PLoS One, doi:... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) Klikk her for å se større figur <./ P>
Figur 2. Nevroner og gliaceller isolert fra mus langsgående muskel vokse i umiddelbar nærhet til hverandre. Konfokalmikroskopi bildene indikerer nevroner (grønn, β-III-tubulin, Abcam, kanin, 1:1.000) og gliaceller (rød, GFAP, Chemicon, mus , 1:500) lett vokse ved siden av hverandre og ser ut til å samhandle in vitro. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Elektrofysiologi av dyrkede enteriske nevroner og gliaceller. I current klemme modus, alle nevroner (A) vises aksjonspotensialer på gjeldende injeksjon. Gliaceller (B) ikke har aksjonspotensialer men vise store electrotonic potensialer i respons til dagens injeksjon. Protokoller i A & B starter med en gjeldende injeksjon av -0,01 nA og øke til 0,09 nA i elleve 0,01 nA trinn. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Nerveceller dyrket fra musen ileum er en elektrofysiologisk heterogen befolkning. I strømtangsett modus, en nåværende injeksjon av 0,09 nA i nerveceller resulterer i aksjonspotensialer. S nevroner (A), umiddelbart tilbake til den hvile-membranpotensialet following stimulering. AH-type nevroner (B) viser en afterhyperpolarization (AHP) etter stimulering der hviler membranpotensiale faller under baseline før sakte tilbake til den opprinnelige verdien. . Modifisert og gjengitt fra Smith, TH, et al Morfin Reduserer Enteric Neuron Excitability via Hemming av natriumkanalene PLoS One, doi:.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyr Brukte
Denne protokollen er optimalisert for sveitsiske Webster mus. Imidlertid er denne metode lett tilpasses til andre små dimensjoner pattedyr slik som rotter, og til andre stammer av mus. Vi har nå gjennomført foreløpige isolations med C57 mus og μ-opioid reseptor knock-outs. Det er imidlertid også mulig at andre stammer av mus kan være problematisk på grunn av morfologiske variasjoner i mage-tarmkanalen. Videre er det kjent forskjeller mellom musestammer (C57BL / 6 vs Balb / c) i nevrale kretser i LMMP forberedelse 13, noe som kan påvirke den resulterende blanding av nerveceller i den endelige isolasjon. I tillegg bør alder tas i betraktning når du bruker denne metoden, som aldersrelaterte nevrale tap oppstå i myenteric plexus som er spesifikke for kolinerge nevroner og deres tilsvarende gliaceller, og kan ses så tidlig som 12 måneder med 14 år. Til slutt, når man tilpasser denne protokollen til andre spesies av dyr, bør man sørge for å sikre at myenteric plexus kommer unna med den langsgående muskel i stedet for gjenværende festet til rundskrivet muskel.
Vev som brukes
Nevroner og gliaceller kan dyrkes fra både ileum og kolon ved hjelp av denne protokollen. Ileal isoleringer er lettere å utføre på grunn av en større mengde av tilgjengelige vev og den letthet ved hvilken den langsgående muskel skiller fra det tykke sirkulære muskel. Et minimum av to dyr er nødvendig for å oppta 12 brønner av 24-brønners plate for applikasjoner som elektrofysiologiske eller immunocytokjemi. Isoleringen av colonic materiale er mer problematisk. Den tykke colonic langsgående muskel er mer vanskelig å skille fra den sirkulære muskel. Videre er den underliggende sirkulære muskel tynnere i tykktarmen, noe som gjør det mer utsatt for tårer. Dessuten er tykktarmen betydelig kortere enn ileum så tre dyr, på minimum, er pålagt å okkupere 12 wells av en 24-brønns plate. Både ileum og kolon kan høstes og belagt separat fra samme dyr, men ytterligere dyr eller bruk av mindre celle plating område vil være nødvendig for kolon isolasjon.
Varigheten av Cell Culture
Elektrofysiologiske opptak er optimalt utført i isolert enteriske nevroner / glia etter 2 til 6 dager i kultur, på dette tidspunktet celler er avrundede og føyelige, ideelle forhold for å lage en hel-celle segl. Etter en uke i kultur celler blir flatere og mer visuelt differensiert som cellene holder seg til plate. Immuncytokjemisk eksperimenter er best gjøres når cellene er mer fast festet til platen, rundt dag 10, for å forhindre celle-tap i løpet av tallrike vasketrinnet. Mus enteriske cellene har blitt opprettholdt i kultur i opptil tre uker. Mønstre av reseptoren og nevrotransmitter uttrykk over tid er ennå ikke undersøkt i disse kulturene. Imidlertid tidligere studier om neuronal overlevelseog biokjemiske / morfologisk differensiering i tradisjonelle marsvin enteriske neuron isoleringer har funnet at nevroner overlevde opptil 15 dager og opprettholde en høy grad av histokjemiske og morfologiske egenskaper opp til tre uker 8, noe som antyder at neuroner avledet fra andre dyr kilder kan ha samme effekt .
Cell Yield
Det totale utbytte av celler fra denne teknikken er 12 brønner i en 24-brønns plate fra to mus når isolere fra ileum. Dette er et forholdsvis lavt antall neuroner sammenlignet med vev volum, som den myenteric plexus består av mindre enn 1% av den totale tarmveggen. En ulempe med denne metoden er at for å øke antall celler som ble oppnådd, må man øke antallet av dyr anvendt. Når dyrenummer settes opp, er det foreslått at flere laboratorieteknikere samarbeide i det første trinn av isolering av LMMP. Dette reduserer mengden av tid med cellene i en forstyrret tilstand før endelig psettelsen og dette øker celle overlevelse.
Cell Tetthet
Som skrevet, bruker denne protokoll to dyr for å gi en ileal isolering av lav tetthet celle konfluens (~ 10-40% målt etter ett døgn i kultur). Lav tetthet celle plating er ideelt i denne metode for å redusere risikoen for forurensning i det endelige kulturen. Det er også nyttig når enkelt celle elektrofysiologisk utføres. Cell antall kan økes ved å bruke flere dyr eller redusere den endelige plating område, men risiko for kontaminering øker. Til off-set dette problemet når høyere celletetthet er nødvendig, enten økt vaske trinn eller økt bruk av antibiotika er foreslått.
Cell heterogenitet
Neuroner oppnådd ved anvendelse av disse protokollene består av minst to funksjonelt distinkte populasjoner, som angitt av elektrofysiologisk karakterisering (figur 3). Imidlertid er det mange kjente typer av nerveceller med spesifikke neurochemical koding mønstre funnet i marsvin 15 og det samme er trolig tilfelle med musen. Denne celle heterogeniteten er både en fordel og ulempe for denne metode. Cell heterogenitet er gunstig når du utfører encellede funksjonelle studier, observere celle-celle interaksjoner eller i immunocytochemistry, blant andre. Cell heterogenitet kan være spesielt fordelaktig når man studerer nervecellen / gliaceller interaksjoner i kultur (figur 3). Imidlertid er celle heterogenitet en hindring for metoder som immunoblotting, hvor endringer i protein uttrykk, etc., kan ikke bidratt til noen celletype eller nervecelle type. Undersøkelse av gliaceller vil være mindre problematisk som bare to undertyper er vist å eksistere i LMMP forberedelse: intraganglionic og intramuskulær magesaftresistent glia 16. Andre celletyper kan også være tilstede i denne kulturen, som interstitiell celler av Cajal eller fibroblaster.
ep "> Plating CellsI denne metodologien blir celler platet i tolv brønner. Av og til vil en eller to av disse brønner utvikle forurensning i den første dagen etter isolering. Hvis dette skjer, blir skinnene fra det forurensede brønner umiddelbart fjernet og brønnen vasket med 70% etanol for å drepe de gjenværende forurensninger. Denne protokollen kan modifiseres til tallerkenen alle av de isolerte celler i færre brønner eller i en enkelt rett, og som et resultat av dette vil faren for kontaminering øker. Igjen, da risikoen for forurensning øker, ekstra vask trinn eller økt bruk av antibiotika er foreslått. Den antibiotiske / antimykotisk væske (Gibco) som brukes i protokollen består av Amphotericin B, streptomycin og penicillin. Andre antibiotika kombinasjoner eller økte konsentrasjoner kan brukes til å optimalisere reduksjon av forurensning, mens forbereder skyll og fullføre neuron media.
Feste Cells
Celler blir utsådd påDekkglass belagt med laminin og poly-D-lysin. Laminin er viktig i overlevelse av tarm nevroner og gliaceller, og oppfordrer neurite utvekst og neuronal utvikling 17, og som sådan er ansett som viktig for denne isolasjon. Imidlertid kan alternative feste-faktorer til poly-D-lysin, slik som ornitin eller Matrigel, prøves som ønsket.
Som konklusjon, gir denne isolasjon en blandet kultur av enteriske neuroner og gliaceller egnet for et bredt spekter av studier teknikker. Denne metodikken er lett å mestre, billig og tidseffektiv. Det er vår håp om at denne cellemodell vil bidra til forståelsen av forskjellige sykdommer forbundet med ENS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at ingen store konkurrerende interesser eksisterer.
Acknowledgments
National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
