이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.
제브라 피쉬의 척수는 여러 가지 이유로 신경계 연구에 대한 효과적인 조사 모델입니다. 우선, 유전 형질 전환 유전자 녹다운 방식은 신경계 발달 근본적인 분자 메커니즘을 조사하는 데에 이용 될 수있다. 둘째, 발달 동기 배아의 큰 클러치는 큰 실험 샘플 크기를 제공합니다. 셋째, 제브라 피쉬 배아의 광학 선명도는 전구, 아교 세포 및 신경 세포의 인구를 시각화하는 연구를 허용합니다. 제브라 피쉬 배아 투명하지만, 시험편 두께는 효과적인 미세 시각화를 방해 할 수있다. 그 이유 중 하나는 척수와 상부의 체절 조직의 탠덤 개발이다. 또 다른 이유는 아직 초기 신경의 기간 동안 존재하는 큰 노른자 공입니다. 이 문서에서는, 우리는 미세 절제 및 체절 조직을 둘러싼 유지하면서 미세한 시각화 할 수 있습니다 수정 배아의 노른자의 제거를 보여줍니다. 우리 ALS오 제브라 피쉬 배아의 반영구적 설치를 보여줍니다. 이 조직의 3 차원 성을 유지로서 이것은 dorso – 복부 및 전후방 축에 신경 발달의 관찰을 허용한다.
제브라 피쉬의 척수의 시각화는 여러 가지 요인에 의해 억제된다. 인해 피개 somites의 두께 및 척수의 내부 위치에, 꽤 긴 작동 거리를 높은 해상도 셀룰러 요구된다. (신경의 초기 단계 여전히 존재) 노른자 볼이 더 필요한 작동 거리를 증가하고, 쉽게 커버 슬립의 압력에 의해 손상된다. 또한, 손상 노른자에서 파편은 조직의 명확한 시각화를 금지합니다. dorso – 복부 (DV) 축 단면이 가능하지만, 그들은 쉽게 전후방 (AP) 축 1에 동시 시각화를 허용하지 않습니다.
이러한 장애를 극복하기 위해, 배아는 슬라이드에 해부 및 장착되어있다. 이 절차는 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 제브라 피쉬 배아는 쉽게 측면이 AP 축 시각화를 용이하게 위쪽으로 향 거짓말. 노른자 균형의 두 번째 제거내가 필요한 작동 거리를 감소하고, 파편을 제한합니다. 셋째,이 설치 절차는 형광 및 명 시야 현미경을 모두 할 수 있습니다. 넷째, 장착 된 배아는 장기 표본 시각화 수 있도록, 4 ° C에서 달 동안 안정. 마지막으로, 개발의 진행은 그 전방 세그먼트에서 발생이 후방 세그먼트보다 더 성숙. 무대 일치 척추 hemisegments이 배아를 비교하고 있는지 확인하기 위해, 위에있는 체절 조직은 가이드로 사용됩니다. 예를 들어, 열 번째 가장 후방 체절 무대 일치 배아의 발달에 상응하는 10 번째 척추 hemisegment을 덮는다. 그대로 배아이 설치 절차는 somites을 쉽게 식별 할 수 있습니다.
우리는 개발 척수 축삭지도의 메커니즘을 연구하는 유전학과 유전자 노크 다운 기술을 사용합니다. 특히, 우리는 robo2, robo3 및 DCC가 Commissural 차 ASCE에 필요한 것으로 확인nding (COPA) 축삭 길 찾기. 여기에 설명 된 설치 절차를 사용하여, 우리는 복부 성장, 중간 선 교차점, 접합면의 폭, 지느러미와 전방 성장 2,3를 검사 할 수 있었다. 이 절차는 또한 마운팅 DV 또는 척수의 AP 패터닝에 적용될 수있다. 우리는 척수의 DV의 패턴에서 하류로 Wnt 이펙터의 서로 다른 역할을 확인하려면이 절차를 사용했습니다. 이 실장을 사용하여, 우리는 단일 세포 수준에서 DV 마커의 해상도를 획득하고, 변화된로 Wnt 신호 수신 4,5의 결과로서 분 패터닝 변화를 확인할 수 있었다. 이 설치 절차는 또한 안티 – 포스 포 3 BrdU의 라벨 (전구 확산) 차별화 (5)를 통해 유사 분열 지수 계산을 할 수 있습니다.
척수 개발의 고정 된 제브라 피쉬 배아 보조 시각화 측면 장착. 난황 공의 제거를 통해, 뛰어난 현미경 이미징에 필요한 작동 거리가 감소된다. 초기 배아 인한 태아의 크기 및 조직의 취약성에 해부하기가 더 어렵 비록 우리의 대표적인 결과는, 그러나,이 기술은 이미 HPF (18)로 사용할 수있는, HPF (24) 단계로 제한되었다. 이 기술은도 24 HPF보다 오래된 배아에 적용 가능하다. 배아 지브라 피쉬의 광학적 선명도, 유전학 역방향 순방향 유전 화면을 수행 할 수있는 능력, 및 형질 전환 방법에 의해 원조, 몇개의 발생 과정을 조사 할 수있다. 이 BrdU의 안티 – 포스 포 히스톤 3월 4일부터 6일까지 및 인원, nkx, DBX, 그리고 olig의 FAMILIE에있는 신경 세포와 아교 전구 마커의 발현을 통해 패턴과 같은 마커를 신경 전구 세포의 유사 분열 지수를 포함의 1,4-6. 1,4,5,10 사용할 수 있습니다 (예 : 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 HUC / D)를 아교 세포 및 신경 세포의 결정을보고 시약. 신경 세포의 하위 차별화 섬, VSX, engrailed 및 GATA 유전자 1,4-6의 발현을 분석 할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 축삭지도의 분석은 안티-아세틸 튜 불린, 3A10 및 ZNP-1 2,11,12 등의 항체를 통해 가능하다. 다른 척추 동물 모델 시스템 (마우스와 병아리)는 그대로 태아의 모든 개발 축 만 제브라 피쉬의 허가 동시보기, 척수 개발을 연구하는 데 사용하고 있지만.
이 방법의 명백한 제한은 라이브 영상을 배제하는, 배아가 고정되어 있다는 것입니다. 실제로, 신속한 배아 죽음 노른자 결과 (또는 손상)의 제거는, 따라서,이 기술을 이용하여 살아있는 배아의 작동 거리를 감소시키는 것이 가능하지 않다. 그러나, 높은 배율 척수 공동라이브 배아 RD 이미징이 가능합니다. 라이브 영상 중에 노른자를 보존하기 위하여, 태아는 시료 및 커버 슬립 사이에 더 큰 공간을 제공하는 오목 슬라이드에 배치 될 수있다. 또한, 여러 개의 22mm X 22mm 커버 슬립은 현미경 슬라이드에 x 1의 3 중 하나를 슬라이드에 접착 할 수있다. 커버 슬립 위에 놓인 coverslip에 대해 "다리"역할을합니다. 배아는 HPF (18)보다 오래된 경우 tricaine은 이동을 방지하기 위해 배아를 마취하기 위해 사용된다. 그대로 노른자와, 아가로 오스에 포함 된 라이브 배아로 작업 할 때 0.288 mm의 작동 거리가 24 HPF에서 deyolked 배아 필요하지만, 3.3 mm의 작동 거리와 현미경 렌즈는 충분하다. 또한, deyolked 배아에서 파생 된 이식편 문화 플라즈마 응고 고정화 기술 (13)를 사용하여 시각화 할 수있다. 다양한 세포 집단은 GFP, mCherry 또는 photocon 같은 유전자에 의해 코딩 형광 단백질을 이용하여 관찰 할 수있다vertible 염료 카에데 (몇 가지 이름을). 또한, 키메라 배아 내에서 형광 표지 된 세포는 또한이 방법 (14)에 볼 수 있습니다.
달 동안 안정 일관된 설치 기술 개발 및 세포 생물학을위한 중요한 도구입니다. 이 간단한 기술은 다른 실험적인 시도 사이의 비교를 용이있게 재현. 또한, 행 배아의 정렬은 쉽게 나중에 분석을 위해 특정 배아의 식별을 허용합니다.
The authors have nothing to disclose.
스키드 모어 강사 개발 그랜트는이 원고의 준비 및 게시를 투자했습니다.
Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
Petroleum Jelly |
Any grocery store |
|
Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
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Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |