Summary
العمليات التنموية مثل الانتشار، الزخرفة، والتمايز، والتوجيه محوار يمكن أن تكون على غرار بسهولة في الحبل الشوكي الزرد. في هذه المقالة، ونحن تصف الإجراء لتصاعد الأجنة الزرد، الذي يحسن التصور لهذه الأحداث.
Abstract
الحبل الشوكي الزرد هو نموذج التحقيق الفعال للأبحاث الجهاز العصبي لعدة أسباب. الأولى، الوراثية، والجينات المعدلة وراثيا النهج ضربة قاضية يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير النظام العصبي. الثانية، براثن كبير من الأجنة متزامنة تنمويا توفير أحجام العينة التجريبية الكبيرة. الثالث، وضوح بصرية للجنين الزرد يسمح للباحثين لتصور السلف، الدبقية، والسكان العصبية. على الرغم من أن الأجنة الزرد شفافة، يمكن أن سماكة العينة تعيق التصور المجهرية فعالة. أحد الأسباب لذلك هو تطوير جنبا إلى جنب من الحبل الشوكي والأنسجة الجسيدة الفوقية. سبب آخر هو الكرة صفار الكبيرة، والتي لا تزال موجودة خلال فترات تكوين الخلايا العصبية في وقت مبكر. في هذه المقالة، ونحن لشرح تسليخ مجهري وإزالة صفار في الأجنة الثابتة، الذي يسمح التصور المجهري مع الحفاظ على الأنسجة المحيطة الجسيدة. نحن المرضس تثبت تصاعد شبه دائمة من الأجنة الزرد. هذا يسمح مراقبة النمو العصبي في المحاور ظهراني بطني والأمامي الخلفي، كما أنه يحافظ على أبعاد ثلاثة من الأنسجة.
Introduction
هو تحول دون تصور من الحبل الشوكي في الزرد من قبل عدد من العوامل. نظرا لسمك و somites المغطي وموقع الداخلية من الحبل الشوكي، مطلوب مسافة طويلة في العمل إلى حد كبير لقرار الخلوية عالية. الكرة صفار (الذي لا يزال حاضرا خلال المراحل الأولى من تكوين الخلايا العصبية) يزيد من مسافة العمل المطلوبة، وتلف بسهولة عن طريق الضغط من ساترة. بالإضافة إلى ذلك، الحطام من صفار التالفة يحظر التصور واضحة من الأنسجة. على الرغم من المقاطع العرضية في (DV) محور ظهراني بطني ممكنة، فإنها لا تسمح بسهولة تصور في وقت واحد في الأمامي الخلفي (ا ف ب) المحور 1.
للتغلب على هذه العقبات، يتم تشريح الأجنة والتي شنت على الشرائح. يوفر هذا الإجراء العديد من الفوائد. الأولى، تكمن بسهولة الأجنة الزرد مع الجانب الوحشي متجهة لأعلى، مما يسهل AP محور التصور. ثانيا، إزالة بال صفارل يقلل من مسافة العمل المطلوبة، ويحد من الحطام. الثالثة، هذا الإجراء تصاعد يسمح لكلا الفلورسنت وbrightfield المجهري. الرابع والأجنة التي شنت في حالة مستقرة لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية، مما يسمح العينة لفترة طويلة التصور. أخيرا، تقدم التنمية يحدث في تلك القطاعات الأمامية هي أكثر نضجا من شرائح الخلفي. من أجل ضمان أن تتم مقارنة نظموا hemisegments الشوكي المتطابقة بين الأجنة، يتم استخدام المغطي الأنسجة الجسيدة كدليل. على سبيل المثال، في العاشر الجسيدة معظم الخلفي يعتلي hemisegment الشوكي العاشرة، وهو ما يعادل تنمويا في الأجنة المتطابقة المرحلة. هذا الإجراء المتصاعدة للأجنة سليمة تتيح سهولة تحديد somites.
نستخدم علم الوراثة والجينات تقنيات تدق إلى أسفل لدراسة آليات التوجيه محوار في الحبل الشوكي النامي. على وجه الخصوص، فقد قررنا أن robo2، robo3، وDCC مطلوبة من أجل صواري ASCE الابتدائيةnding (كوبا) محوار الاستطلاعية. باستخدام الإجراء تصاعد وصفها هنا، كنا قادرين على دراسة النمو بطني، عبور خط الوسط، عرض الصوار، والظهرية 2،3 النمو الأمامي. ويمكن أيضا أن يطبق هذا الإجراء إلى تصاعد DV أو AP الزخرفة من الحبل الشوكي. وقد استخدمنا هذا الإجراء لتحديد الأدوار المتباينة من المستجيبات WNT المصب في DV الزخرفة من الحبل الشوكي. استخدام هذا التركيب، تمكنا من الحصول على قرار من علامات DV على مستوى خلية واحدة، وتحديد التحولات الزخرفة دقيقة نتيجة لتغير استقبال إشارة WNT 4،5. يسمح هذا الإجراء تصاعد أيضا لحساب مؤشر الإنقسامية من خلال مكافحة phosphohistone 3 أو وضع العلامات BrdU (انتشار السلف) التمايز 5.
Protocol
1. تصاعد الأجنة (عند الانتهاء من اختيار تقنيات التصور، مثل كيمياء سيتولوجية مناعية، التهجين في الموقع، الخ)
- وضع الأجنة في طبق بيتري 35 ملم مليئة العازلة في الاختيار (الشكل 1A). ويستند اختيار عازلة على الإجراء وضع العلامات. عادة مخازن تستند PBS-مناسبة.
- تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط، وتأمين الرأس مع زوج واحد من ملقط حين سحب صفار البيض بعيدا مع الزوج الآخر (الشكل 1B). بدلا من ذلك، استخدم دبوس الحشرات في حامل دبوس الحشرات لسحب بلطف بعيدا صفار البيض.
- باستخدام الجنين لعبة البوكر (صيد الانترنت (0.41 مم) لصقها على أي أنبوب شعري أو ماصة باستور) نقل الأجنة إلى جزء من طبق بيتري الذي ليس لديه الكثير من الحطام صفار (أرقام 1C-D).
- باستخدام ماصة باستير الزجاج، ونضح الأجنة في السائل أقل قدر ممكن، وزماصة مستديم لهم على شريحة (الشكل 1E).
- الفتيل بلطف بعيدا السائل الزائد باستخدام مختبر مسح. تجنب الاتصال مع الأجنة.
- إضافة قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة إلى الأجنة. للتسميات الفلورسنت، واستخدام كاشف antifade الاختيار. للإشارات اللونية، 70٪ الجلسرين يمكن استخدامها كوسيلة في تصاعد مستمر.
- باستخدام لعبة البوكر الجنين، توجيه الأجنة على الجانبين في الصفوف (الشكل 1F).
- إضافة "الداب" واحدة من الفازلين أو الشحوم عالية فراغ إلى كل ركن من أركان ساترة (الشكل 1G). هذا يمنع الضرر من الجنين من الضغط المفرط.
- وضع ساترة (الجانب الفازلين لأسفل) على رأس الأجنة (الشكل 1H).
- بلطف اضغط على ساترة في كل زاوية حتى وسائل الإعلام تركيب (70٪ الجلسرين أو مكافحة تتلاشى كاشف التركيب) لمس ساترة (الشكل 1H).
- إذا لزم الأمر، إضافة المزيد من وسائل الإعلام المتصاعدة من قبل pipetting بجوار COVerslip، باستخدام pipettor في نطاق 20-200 مل. سيكون الفتيل تحت.
- باستخدام مختبر مسح ونظيفة تماما حول ساترة. تكون على يقين من أن يتم تطبيق الضغط على ساترة، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الأجنة. يجب أن تكون هذه المنطقة جافة وليس لها أي الفازلين أو وسائل الإعلام تصاعد على ذلك.
- استخدام طلاء الأظافر لختم حول حافة ساترة (الشكل 1I).
Representative Results
عندما توضيح الآليات التي تكمن وراء الأحداث التنموية المختلفة مثل الزخرفة الخلوية، والتمايز، والتوجيه محور عصبي، فإنه من المهم أن تكون قادرا على تصور الخلايا في سياق أنسجتهم. العيوب الزخرفة ظهري بطني الحاضر وعادة ما تحول بطني أو ظهري في مجال التعبير عن عوامل النسخ في باكس، nkx، أو الأسر DBX 4. في بعض الأحيان، قد تكون التغييرات الطفيفة، التي تضم سوى عدد قليل من أقطار الخلية 4. تحليل مقطعية يسمح هذا النوع من التحليل. ومع ذلك، يمكن الكواشف مع إشارات أضعف، أو المقاطع العرضية التي ليست عمودي على محور AP لحد من التفسير. علاوة على ذلك، تحليل مقطعية لا يأخذ بعين الاعتبار بسهولة ما إذا كانت التغييرات لا تزال قائمة في محور AP، ويعتمد على توافر ناظم البرد. يتم التحايل على هذا التحديد من قبل وجهات النظر الجانبي للحبل الشوكي. كما رأينا في الشكل 2B، nkx6.1 مرنا هو دistributed في ما يقرب من النصف بطني من الحبل الشوكي في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، ضمن المجال السلف. الخلايا الاصلية يمكن تمييزها من الخلايا الإنقسامية آخر بسبب وجود لوحة الكلمة، التي وجدت في الجزء الأنسي من الحبل الشوكي. شوهدت مع عدسات مدينة دبي للإنترنت، والخلايا الفردية بشكل واضح للتمييز، وحدود المعرفة بين التعبير عن وnonexpressing الخلايا هو واضح.
ويرافق دورة الخلية السلف الخروج عن التغيرات في التعبير الجيني. على سبيل المثال، كل الخلايا العصبية بعد الإنقسامية التعبير عن HUC / D الذي هو كشفها مع كيمياء سيتولوجية مناعية 1،5. تحقيقات مرنا للجزيرة، غاتا، والأسر VSX تسمية الخلايا العصبية بعد الإنقسامية محددة من الموقف الثابت وعدد داخل كل hemisegment الحبل الشوكي 6. بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن مستقبلات التوجيه محور عصبي مثل تلك التي في الأسرة روبو في السكان المقيد من الخلايا العصبية تالية للتفتل (الشكل 2C)
في 24 HPF، محاور عصبية من الخلايا العصبية تالية للتفتل التالية يمكن تصور مع أساليب مختلفة، ويمكن تمييزها على مستوى خلية واحدة: الظهرية الجانبي تصاعدي (دولا)، صواري تصاعديا الابتدائية (كوبا)، صواري الثانوية تصاعدي (كوسا)، بطني الطولية تنازليا (واحة)، كولمر-Agdur (KA)، صواري Bifurcating / الطولية (الكوز / L)، محيطي تصاعدي (سي آي ايه)، محيطي تنازليا (CID)، وأحادي القطب صواري تنازليا (UCoD)، روهون حية (RB)، العصبونات الحركية ( M) 9. تمديد المحاور من هذه الخلايا العصبية في ظهري، بطني، الأمامي، والخلفي الاتجاهات. أنها فرع، عبور خط الوسط، والخروج على حد سواء ظهريوالحبل الشوكي بطني. عندما يقترن متحد البؤر المسح المجهري بالليزر، هذه السلوكيات الخلوية المتنوعة واضحة في الأجنة التي شنت أفقيا، وذلك باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية والبروتينات الفلورية المرمزة وراثيا مثل GFP 2. في الشكل 2D، تم استخدام znp-1 كيمياء سيتولوجية مناعية لتسمية العصبونات الحركية النامية. العصبونات الحركية الخروج من الحبل الشوكي البطني للعصب العضلات النامية المحيطة بها.
الشكل 1. تشريح والجانبية جبل الأجنة الزرد. (A) وبعد تجهيز المناعي، الموقع التهجين الموجودين في، وتوضع الأجنة في طبق بيتري 35 ملم مليئة PBT (PBS مع 0.5٪ تريتون X-100) أو استخدام محطة (PBS مع 0.1٪ توين 20). صفارالكرة (YB) هو واضح. (ب) تتم إزالة صفار من خلال تأمين رأس الجنين تليها تشريح دقيق. (C) يتم استخدام لعبة البوكر الجنين (صيد الانترنت لصقها على ماصة باستور) لأجنة منفصلة والحطام صفار (D). و pipetted الأجنة تنظيفها على شريحة المجهر (E) والانحياز (F). يتم تطبيق هلام (G) للبترول لزوايا ساترة. (H) يتم وضع ساترة بلطف على أعلى من الأجنة في تصاعد المتوسط. يستخدم البولندية (I) الأظافر لختم حواف ساترة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
< قوية الشكل 2>. تحليل الجينات وأنماط التعبير محوار الاستطلاعية التي شنت أفقيا في الأجنة الزرد. (A) رسم لجنين الزرد في 24 HPF. في دينار بحريني، وتصور ما يقرب من أربعة hemisegments أعلاه تمديد الكيس المحي (منطقة محاصر). (ب) يتم التعبير عن nkx6.1 في الحبل الشوكي بطني، بما في ذلك الكلمة لوحة (FP). وأعرب عن (C) robo3 في الخلايا العصبية تالية للتفتل (السوداء). منطقة لوحة الكلمة والسلف ليس واضحا في هذا المستوى البؤري أكثر الجانبي. في B، C، يحدها الحبل الشوكي لفئة على الجانب الأيسر من الصورة. وقد استخدم (D) متحد البؤر المجهري لصورة znp-1 المناعي، التي تصف المحاور الحركية التي تخرج من النخاع الشوكي البطني. في جميع الصور، هو الأمامي إلى اليسار والظهرية متروك. A 40X مسافة العمل الطويلة، تم استخدام الغمر بالماء (NA 0.8) عدسة (3.3 ملم).oad/50703/50703fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Discussion
تصاعد الأجنة الزرد الوحشي للمساعدات التصور ثابتة للتنمية الحبل الشوكي. من خلال إزالة الكرة صفار، يتم تقليل مسافة العمل المطلوبة للتصوير مجهرية استثنائية. تم نتائجنا ممثل تقتصر على المرحلة 24 HPF، ومع ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها في وقت مبكر من 18 HPF، على الرغم من الأجنة في وقت سابق أكثر صعوبة لتشريح بسبب حجم الجنين وهشاشة النسيج. هذا الأسلوب ينطبق على الأجنة أقدم من 24 HPF أيضا. وبمساعدة من وضوح بصري من الزرد الجنينية، والقدرة على أداء شاشات الوراثية إلى الأمام، وعلم الوراثة العكسية، والنهج المعدلة وراثيا، قد يتم التحقيق العديد من العمليات التنموية. وهذا يشمل مؤشرات الإنقسامية من الأسلاف العصبية مع علامات مثل BrdU ومكافحة الفوسفات-هيستون 4-6 مارس والزخرفة من خلال التعبير عن علامات العصبية والدبقية السلف في باكس، nkx، DBX، وolig familieو 1،4-6. الكواشف أن تقرير تقرير الدبقية والخلايا العصبية (مثل الدبقية البروتين حمض ييفي (GFAP) وHUC / D) 1،4،5،10 يمكن استخدامها. ويمكن تحليل الخلايا العصبية سلالة التمايز من خلال التعبير عن جزيرة، VSX، معكوسة، والجينات غاتا 1،4-6. وأخيرا، وتحليل توجيهات محوار هو ممكن من خلال الأجسام المضادة مثل تويولين مكافحة الأسيتيل، 3A10، وznp-1 2،11،12. على الرغم تستخدم أنظمة نموذج الفقاريات الأخرى (الماوس وفرخ) لدراسة تطور الحبل الشوكي، إلا أن تصاريح الزرد عرض في وقت واحد من جميع المحاور التنموية في الجنين سليمة.
القيد واضحة لهذا النهج هو أن الأجنة يتم إصلاحها، والذي يحول دون التصوير الحي. في الواقع، وإزالة (أو تلف) نتائج صفار في الموت السريع الجنينية، وبالتالي فإنه ليس من الممكن للحد من مسافة العمل في الأجنة الحية باستخدام هذه التقنية. ومع ذلك، تضخم عالية شارك في العمود الفقريالتصوير الثالثة في الأجنة الحية هو ممكن. من أجل الحفاظ على صفار خلال التصوير الحي والأجنة يمكن وضعها في الشرائح الاكتئاب، والتي توفر مساحة أكبر بين العينة وساترة. بدلا من ذلك، العديد من 22 ملم × 22 ملم coverslips ويمكن لصقها على أي شريحة من 3 × 1 في في الشريحة المجهرية. لل coverslips بمثابة "جسر" لساترة الفوقية. إذا الأجنة تكون أقدم من 18 HPF، ويستخدم لتخدير تريكين الأجنة لمنع الحركة. في حين أن المسافة عمل 0.288 مم مطلوب للأجنة deyolked في 24 HPF، عند العمل مع الأجنة الحية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز، مع صفار سليمة، عدسة مجهرية مع مسافة العمل 3.3 مم كافية. بدلا من ذلك، الثقافات ازدراع المستمدة من الأجنة deyolked يمكن تصور باستخدام البلازما جلطة الشلل تقنية 13. ويمكن ملاحظة السكان مختلفة من الخلايا من خلال استخدام البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا مثل GFP، mCherry، أو photoconصبغ vertible Kaede الذي (على سبيل المثال لا الحصر). علاوة على ذلك، الخلايا fluorescently المسمى داخل أجنة خيالية ويمكن أيضا أن ينظر إليها مع هذا النهج 14.
وهناك تقنية تصاعد متسقة ومستقرة لعدة أشهر هو أداة حاسمة لعلماء البيولوجيا التطورية والخلية. هذه التقنية هي واضحة قابلة للتكرار، مما يتيح المقارنة سهلة بين التجارب التجريبية المختلفة. علاوة على ذلك، محاذاة الأجنة في الصفوف يسمح بسهولة تحديد الأجنة محددة لتحليلها لاحقا.
Disclosures
لا توجد المصالح المالية المتنافسة لأي كاتب.
Acknowledgments
بتمويل سكيدمور كلية المنح الإنمائية في إعداد ونشر هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dishes 35 mm x 10 mm |
VWR | 25373-041 |
|
| Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific | NC9839169 |
|
| Cover glass |
Fisher Scientific | 12-541-B22X22-1.5 |
|
| Slides |
Fisher Scientific | 12-550-343 |
|
| SlowFade Gold |
Fisher Scientific | S36936 |
|
| ProLong Gold |
Life Technologies | P36934 |
|
| Petroleum Jelly |
any grocery store |
|
|
| Loop Holders |
VWR | 80094-482 |
|
| Insect Pins |
Fine Science Tools | 26002-10 |
|
| Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools | 26016-12
|
|
Olympus Stereomicroscope |
Olympus | SZ61 |
References
- Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal. Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).
- Bonner, J., et al. Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons. Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).
- Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. Zebrafish. , In Press. (2012).
- Bonner, J., et al. Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling. Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).
- Gribble, S. L., et al. Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression. Development. 136 (5), 781-789 (2009).
- England, S., et al. Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons. Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).
- Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish. Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).
- Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell. 221 (2), 216-230 (2001).
- Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons. Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).
- Kim, H., et al. Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos. Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- de Soysa, T. Y., et al. Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis. BMC Biol. 10 (40), (2012).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).
- Deschene, E. R., Barresi, M. J. Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (31), (2009).
