Summary
이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.
Abstract
제브라 피쉬의 척수는 여러 가지 이유로 신경계 연구에 대한 효과적인 조사 모델입니다. 우선, 유전 형질 전환 유전자 녹다운 방식은 신경계 발달 근본적인 분자 메커니즘을 조사하는 데에 이용 될 수있다. 둘째, 발달 동기 배아의 큰 클러치는 큰 실험 샘플 크기를 제공합니다. 셋째, 제브라 피쉬 배아의 광학 선명도는 전구, 아교 세포 및 신경 세포의 인구를 시각화하는 연구를 허용합니다. 제브라 피쉬 배아 투명하지만, 시험편 두께는 효과적인 미세 시각화를 방해 할 수있다. 그 이유 중 하나는 척수와 상부의 체절 조직의 탠덤 개발이다. 또 다른 이유는 아직 초기 신경의 기간 동안 존재하는 큰 노른자 공입니다. 이 문서에서는, 우리는 미세 절제 및 체절 조직을 둘러싼 유지하면서 미세한 시각화 할 수 있습니다 수정 배아의 노른자의 제거를 보여줍니다. 우리 ALS오 제브라 피쉬 배아의 반영구적 설치를 보여줍니다. 이 조직의 3 차원 성을 유지로서 이것은 dorso - 복부 및 전후방 축에 신경 발달의 관찰을 허용한다.
Introduction
제브라 피쉬의 척수의 시각화는 여러 가지 요인에 의해 억제된다. 인해 피개 somites의 두께 및 척수의 내부 위치에, 꽤 긴 작동 거리를 높은 해상도 셀룰러 요구된다. (신경의 초기 단계 여전히 존재) 노른자 볼이 더 필요한 작동 거리를 증가하고, 쉽게 커버 슬립의 압력에 의해 손상된다. 또한, 손상 노른자에서 파편은 조직의 명확한 시각화를 금지합니다. dorso - 복부 (DV) 축 단면이 가능하지만, 그들은 쉽게 전후방 (AP) 축 1에 동시 시각화를 허용하지 않습니다.
이러한 장애를 극복하기 위해, 배아는 슬라이드에 해부 및 장착되어있다. 이 절차는 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 제브라 피쉬 배아는 쉽게 측면이 AP 축 시각화를 용이하게 위쪽으로 향 거짓말. 노른자 균형의 두 번째 제거내가 필요한 작동 거리를 감소하고, 파편을 제한합니다. 셋째,이 설치 절차는 형광 및 명 시야 현미경을 모두 할 수 있습니다. 넷째, 장착 된 배아는 장기 표본 시각화 수 있도록, 4 ° C에서 달 동안 안정. 마지막으로, 개발의 진행은 그 전방 세그먼트에서 발생이 후방 세그먼트보다 더 성숙. 무대 일치 척추 hemisegments이 배아를 비교하고 있는지 확인하기 위해, 위에있는 체절 조직은 가이드로 사용됩니다. 예를 들어, 열 번째 가장 후방 체절 무대 일치 배아의 발달에 상응하는 10 번째 척추 hemisegment을 덮는다. 그대로 배아이 설치 절차는 somites을 쉽게 식별 할 수 있습니다.
우리는 개발 척수 축삭지도의 메커니즘을 연구하는 유전학과 유전자 노크 다운 기술을 사용합니다. 특히, 우리는 robo2, robo3 및 DCC가 Commissural 차 ASCE에 필요한 것으로 확인nding (COPA) 축삭 길 찾기. 여기에 설명 된 설치 절차를 사용하여, 우리는 복부 성장, 중간 선 교차점, 접합면의 폭, 지느러미와 전방 성장 2,3를 검사 할 수 있었다. 이 절차는 또한 마운팅 DV 또는 척수의 AP 패터닝에 적용될 수있다. 우리는 척수의 DV의 패턴에서 하류로 Wnt 이펙터의 서로 다른 역할을 확인하려면이 절차를 사용했습니다. 이 실장을 사용하여, 우리는 단일 세포 수준에서 DV 마커의 해상도를 획득하고, 변화된로 Wnt 신호 수신 4,5의 결과로서 분 패터닝 변화를 확인할 수 있었다. 이 설치 절차는 또한 안티 - 포스 포 3 BrdU의 라벨 (전구 확산) 차별화 (5)를 통해 유사 분열 지수 계산을 할 수 있습니다.
Protocol
1. 태아를 설치 (예 : 면역 세포로 선정 시각화 기술, 완료되면, 현장 하이브리드 화에서, 등)
- 선택의 버퍼 (그림 1A)로 가득 35mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 버퍼의 선택은 라벨 절차를 기반으로합니다. 일반적으로 PBS 기반의 버퍼가 적합하다.
- 해부 현미경 및 집게를 사용에서 다른 쌍 (그림 1B) 멀리 노른자를 당기는 동안 집게 일쌍으로 머리를 고정합니다. 또한, 부드럽게 노른자를 멀리 끌어 곤충 핀 홀더에 곤충 핀을 사용합니다.
- 배아 포커 사용 노른자 파편 (그림 1C-D)의 여지가없는 페트리 접시의 부분에 배아를 이동 (낚시 줄 (0.41 mm 직경은) 모세관 또는 파스퇴르 피펫 하나에 붙어).
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능하고 g만큼 작은 액체 배아 대기음이라 고한다면, 슬라이드 (그림 1E)에 그들을 피펫.
- 조심스럽게 실험실을 닦아 사용하여 물기를 멀리 심지. 배아과의 접촉을 피하십시오.
- 배아에 매체를 장착 한 방울을 추가합니다. 형광 라벨, 선택의 antifade 시약을 사용합니다. 비색 신호의 경우, 70 % 글리세롤 마운팅 매질로서 사용될 수있다.
- 배아 포커를 사용하여 행 (그림 1 층)에있는 그들의 양쪽에 배아의 방향.
- 커버 슬립 (그림 1G)의 각 모서리에 석유 젤리 또는 높은 진공 그리스의 하나 "덩어리"를 추가합니다. 이것은 과도한 압축에서 배아의 손상을 방지한다.
- 배아 (그림 1H)의 상단에 커버 슬립 (아래 석유 젤리 쪽)을 놓습니다.
- 부드럽게 (70 % 글리세롤 또는 반대로 페이드 장착 시약) 커버 슬립 (그림 1H)을 만지고 설치 미디어까지 각 모서리에 커버 슬립을 누릅니다.
- 필요한 경우, 바로 옆에 COV에 피펫 팅 더 설치 미디어를 추가erslip, 20-200 ML의 범위에서 피펫을 사용. 그것은 아래에 심지됩니다.
- 실험실을 사용하면 커버 슬립 주위에 완전히 깨끗하고 닦아냅니다. 이 배아를 손상시킬 수로, 커버 슬립에 압력을 적용 할 것이 확실합니다. 이 지역은 건조하고 그것에 더 석유 젤리 또는 설치 미디어가 없어야합니다.
- 커버 슬립 (그림 1I)의 가장자리 주위에 밀봉 매니큐어를 사용합니다.
Representative Results
셀룰러 패터닝, 분화 및 축삭지도 등의 각종 이벤트가 발달 기초 메커니즘을 해명 할 때, 그 조직의 컨텍스트 내에서 세포를 시각화 할 수있는 것이 중요하다. PAX, nkx, 또는 DBX 가족 4 전사 인자의 발현 도메인의 복부 나 등의 변화와 같이 일반적으로 현재 Dorsoventral 패턴 결함. 때때로, 변경 사항은 몇 가지 세포 직경 4를 포함, 미묘한있을 수 있습니다. 단면 분석은 이러한 유형의 분석을 허용한다. 그러나, 약한 신호 또는 AP의 축에 수직하지 않은 단면을 가진 시약은 해석을 제한 할 수 있습니다. 또한, 단면 분석을 쉽게 변경이 AP 축에서 지속 여부를 고려하고, 저온 유지 장치의 가용성에 의존하지 않습니다. 이 제한은 척수의 측면보기로 우회한다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, mRNA의 nkx6.1은 D이다전구 도메인 내, 24 시간 후 수정 (HPF)에서 척수의 약 복부 반 istributed. 전구 세포는 척수의 중간 부분에서 발견되는 바닥 플레이트의 존재로 인해 포스트 유사 분열 세포로부터 구별 가능하다. DIC 광학과 횟수, 각각의 세포는 명확히 구별하고, 발현 세포와 nonexpressing 간의 정의 된 경계가 분명하다.
전구 세포주기 출구는 유전자 발현의 변화에 의해 수반된다. 예를 들어, 모든 사후 유사 분열 신경 세포는 면역 세포 화학 1,5와 감지 할 HUC / D를 표현한다. 섬, GATA, 및 VSX의 가족을위한 mRNA의 프로브는 각 척수 hemisegment 6 내에서 일관된 위치와 번호를 특정 후 유사 분열 신경을 레이블. 또, 로보 제품군에서와 축삭지도 수용체 postmitotic 뉴런의 제한된 인구 (그림 2C)를 표현
24 HPF에서 다음 postmitotic 뉴런의 축색 돌기는 다양한 방법으로 시각화하고, 단일 세포 수준에서 구별 할 수있다 : 지느러미 측면 오름차순 (도라), Commissural 차 오름차순 (COPA), Commissural 보조 오름차순 (코사), 복부 세로 내림차순 (초원), Kolmer-Agdur (KA), Commissural 두 갈래 / 세로 (COB / L), 원주 오름차순 (CIA), 원주 내림차순 (CID), 유니 폴라 Commissural 내림차순 (UCoD), Rohon - 수염 (RB), 운동 신경원 ( M) 9. 축삭은 지느러미, 복부, 전방 및 후방 방향으로 뉴런에서 확장. 그들은 지점, 지느러미 모두에게 중간 선을 통과하고, 종료및 복부 척수. 공 초점 레이저 주사 현미경을 결합 할 때, 이러한 다양한 세포 행동은 면역 세포와 같은 GFP 2 등의 유전자 인코딩 형광 단백질을 이용하여 가로 방향으로 장착 된 배아에 분명하다. 도 2D에서, ZNP-1 면역 세포가 개발 운동 신경원을 레이블로 사용되었다. 운동 신경원은 주변 개발 근육을 신경을 분포시키다 배쪽으로 척수를 종료합니다.
그림 1. 해부 및 제브라 피쉬 배아의 마운트 측방. (A)를 면역에 대한 처리 한 후, 현장 하이브리드 화 등으로, 배아는 35mm 페트리 (0.5 % 트리톤 X-100과 PBS) PBT 가득 접시 또는 PTW (PBS로 배치됩니다 0.1 % 트윈 -20). 노른자구슬 (YB)가 명백하다. (B) 난황을 조심 해부이어서 배아의 머리를 고정에 의해 제거된다. (C) 배아 포커 (낚시 줄이 파스퇴르 피펫에 붙어) 별도의 배아와 노른자 파편 (D)에 사용된다. 청소 배아는 현미경 슬라이드 (E)에 피펫 팅 (F) 정렬됩니다. (G) 석유 젤리가 커버 슬립의 모서리에 적용됩니다. (H) 커버 슬립이 장착 매체의 배아 위에 부드럽게 배치됩니다. (I) 매니큐어는 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하는 데 사용됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
< 강한> 그림 2. 길 찾기 유전자 발현 패턴과 축삭의 분석은 옆으로 제브라 피쉬 배아를 장착. 24 HPF에서 zebrafish의 배아 (A) 그리기. BD에서, 난황 확장 위의 약 네 hemisegments은 (박스 영역) 시각입니다. (B) nkx6.1은 바닥 플레이트 (FP)를 포함 복부 척수로 표현된다. (C) robo3은 postmitotic 뉴런 (PMN)로 표현된다. 바닥 판 및 전구 영역이 더 많은 측면 초점면에서 분명하지 않습니다. B에서 C는, 척수는 화상의 왼쪽에 브래킷에 의해 경계된다. (D) 공 초점 현미경은 배쪽으로 척수를 종료 모터 축삭 레이블 이미지 ZNP-1 면역에 사용되었다. 모든 이미지에서 앞쪽은 왼쪽에 있으며 등쪽이 다. 40X 긴 작동 거리, 침수 (NA 0.8) 렌즈 (3.3 mm)를 사용 하였다.oad/50703/50703fig2highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
척수 개발의 고정 된 제브라 피쉬 배아 보조 시각화 측면 장착. 난황 공의 제거를 통해, 뛰어난 현미경 이미징에 필요한 작동 거리가 감소된다. 초기 배아 인한 태아의 크기 및 조직의 취약성에 해부하기가 더 어렵 비록 우리의 대표적인 결과는, 그러나,이 기술은 이미 HPF (18)로 사용할 수있는, HPF (24) 단계로 제한되었다. 이 기술은도 24 HPF보다 오래된 배아에 적용 가능하다. 배아 지브라 피쉬의 광학적 선명도, 유전학 역방향 순방향 유전 화면을 수행 할 수있는 능력, 및 형질 전환 방법에 의해 원조, 몇개의 발생 과정을 조사 할 수있다. 이 BrdU의 안티 - 포스 포 히스톤 3월 4일부터 6일까지 및 인원, nkx, DBX, 그리고 olig의 FAMILIE에있는 신경 세포와 아교 전구 마커의 발현을 통해 패턴과 같은 마커를 신경 전구 세포의 유사 분열 지수를 포함의 1,4-6. 1,4,5,10 사용할 수 있습니다 (예 : 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 HUC / D)를 아교 세포 및 신경 세포의 결정을보고 시약. 신경 세포의 하위 차별화 섬, VSX, engrailed 및 GATA 유전자 1,4-6의 발현을 분석 할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 축삭지도의 분석은 안티-아세틸 튜 불린, 3A10 및 ZNP-1 2,11,12 등의 항체를 통해 가능하다. 다른 척추 동물 모델 시스템 (마우스와 병아리)는 그대로 태아의 모든 개발 축 만 제브라 피쉬의 허가 동시보기, 척수 개발을 연구하는 데 사용하고 있지만.
이 방법의 명백한 제한은 라이브 영상을 배제하는, 배아가 고정되어 있다는 것입니다. 실제로, 신속한 배아 죽음 노른자 결과 (또는 손상)의 제거는, 따라서,이 기술을 이용하여 살아있는 배아의 작동 거리를 감소시키는 것이 가능하지 않다. 그러나, 높은 배율 척수 공동라이브 배아 RD 이미징이 가능합니다. 라이브 영상 중에 노른자를 보존하기 위하여, 태아는 시료 및 커버 슬립 사이에 더 큰 공간을 제공하는 오목 슬라이드에 배치 될 수있다. 또한, 여러 개의 22mm X 22mm 커버 슬립은 현미경 슬라이드에 x 1의 3 중 하나를 슬라이드에 접착 할 수있다. 커버 슬립 위에 놓인 coverslip에 대해 "다리"역할을합니다. 배아는 HPF (18)보다 오래된 경우 tricaine은 이동을 방지하기 위해 배아를 마취하기 위해 사용된다. 그대로 노른자와, 아가로 오스에 포함 된 라이브 배아로 작업 할 때 0.288 mm의 작동 거리가 24 HPF에서 deyolked 배아 필요하지만, 3.3 mm의 작동 거리와 현미경 렌즈는 충분하다. 또한, deyolked 배아에서 파생 된 이식편 문화 플라즈마 응고 고정화 기술 (13)를 사용하여 시각화 할 수있다. 다양한 세포 집단은 GFP, mCherry 또는 photocon 같은 유전자에 의해 코딩 형광 단백질을 이용하여 관찰 할 수있다vertible 염료 카에데 (몇 가지 이름을). 또한, 키메라 배아 내에서 형광 표지 된 세포는 또한이 방법 (14)에 볼 수 있습니다.
달 동안 안정 일관된 설치 기술 개발 및 세포 생물학을위한 중요한 도구입니다. 이 간단한 기술은 다른 실험적인 시도 사이의 비교를 용이있게 재현. 또한, 행 배아의 정렬은 쉽게 나중에 분석을 위해 특정 배아의 식별을 허용합니다.
Disclosures
더 경쟁하는 금융 이익은 저자 중 하나에 존재하지 않습니다.
Acknowledgments
스키드 모어 강사 개발 그랜트는이 원고의 준비 및 게시를 투자했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dishes 35 mm x 10 mm |
VWR | 25373-041 |
|
| Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific | NC9839169 |
|
| Cover glass |
Fisher Scientific | 12-541-B22X22-1.5 |
|
| Slides |
Fisher Scientific | 12-550-343 |
|
| SlowFade Gold |
Fisher Scientific | S36936 |
|
| ProLong Gold |
Life Technologies | P36934 |
|
| Petroleum Jelly |
any grocery store |
|
|
| Loop Holders |
VWR | 80094-482 |
|
| Insect Pins |
Fine Science Tools | 26002-10 |
|
| Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools | 26016-12
|
|
Olympus Stereomicroscope |
Olympus | SZ61 |
References
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