Summary
Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.
Abstract
Zebra balığı omurilik çeşitli nedenlerden dolayı sinir sistemi araştırma için etkili bir araştırmacı modeldir. İlk olarak, genetik, transjenik ve gen yok etme yaklaşımlar sinir sisteminin gelişimi altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. İkincisi, gelişimsel senkronize embriyolarının büyük kavramaları büyük deneysel örneklem boyutları sağlar. Üçüncü olarak, Zebra balığı embriyo optik netlik atasını, glial ve nöronal popülasyonları görselleştirmek için araştırmacılara izin verir. Zebra balığı embriyolar saydam olmasına rağmen, numune kalınlığı etkili mikroskobik görselleştirme engelleyebilir. Bunun bir nedeni, spinal kord ve örten hücre gruplarının doku tandem gelişmedir. Başka bir nedeni hala erken nöron dönemlerinde mevcut büyük sarısı top vardır. Bu yazıda, mikrodiseksiyon ve somite çevresindeki doku koruyarak mikroskobik görselleştirme sağlar sabit embriyoların sarısı, kaldırılmasını göstermektedir. Biz also zebra balığı embriyoların yarı kalıcı monte edilmesini göstermektedir. Bu doku üç boyutluluk korur gibi bu, ön-ventral ve anterior-posterior eksende nörolojik gelişim gözlenmesini izin verir.
Introduction
Zebrabalıkları omurilik Görselleştirme bir dizi faktöre tarafından inhibe edilir. Nedeniyle örten Somitlerin kalınlığı ve omurilik iç konuma, oldukça uzun bir çalışma mesafesi yüksek hücresel çözünürlük gereklidir. (Nöron erken aşamalarında hala mevcut) sarısı top ayrıca gerekli çalışma mesafesini artırır ve kolayca bir lamel basınç nedeniyle zarar görebilir. Buna ek olarak, hasarlı sarısı enkaz dokuların net görselleştirme yasaklamaktadır. Ön-ventral (DV) ekseninde kesitler mümkün olmasına rağmen, onlar kolayca anterior-posterior (AP) eksen 1 eşzamanlı görselleştirme izin vermez.
Bu engelleri aşmak için, embriyolar slaytlar üzerinde disseke ve monte edilir. Bu prosedür birçok avantaj sağlar. İlk olarak, zebra balığı embriyolarının kolayca lateral yan AP ekseni görüntülenmesini kolaylaştırır, hangi yukarı bakacak şekilde yalan. Yumurta sarısı bal İkinci sökmel gerekli çalışma mesafesi azalır ve enkaz sınırlar. Üçüncü olarak, bu montaj prosedür floresan ve aydınlık mikroskobu hem de sağlar. Dördüncü olarak, monte edilmiş embriyoların uzun numune görselleştirme sağlayan, 4 ° C'de ay boyunca stabildir. Son olarak, gelişim ilerlemesi anterior segmentlerde meydana posterior segmentlere göre daha olgundur. Aşamalı eşleşen spinal hemisegments embriyolar arasında karşılaştırıldı sağlamak amacıyla, üzerinde uzanan doku hücre gruplarının, bir kılavuz olarak kullanılır. Örneğin, onuncu en arka somite sahne uyumlu embriyoların gelişimsel eşdeğer onuncu spinal hemisegment üzerler. Sağlam embriyolar bu montaj prosedürü Somitlerin kolay tanımlama sağlar.
Biz gelişmekte olan omurilik akson rehberlik mekanizmaları çalışmak için genetik ve gen knock-down teknolojileri kullanıyoruz. Özellikle, robo2, robo3 ve DCC Commissural Birincil ASCE için gerekli olduğunu tespit ettiknding (CoPA) akson pathfinding. Burada anlatılan, montaj prosedürünü kullanarak, ventral büyüme, orta hat geçiş, ek yeri genişliği, dorsal anterior büyüme 2,3 incelemek başardık. Bu işlem aynı zamanda montaj DV ya da spinal kord AP dokusuna tatbik edilebilir. Biz omurilik DV desenleme aşağı Wnt efektörlerinin farklı rolleri belirlemek için bu yordamı kullandık. Bu montaj kullanarak, tek hücre düzeyinde DV belirteçlerin çözünürlük elde, ve değişmiş Wnt sinyal alımı 4,5 sonucunda dakikalık desenleme vardiya belirlemek başardık. Bu montaj prosedür aynı zamanda anti-phosphohistone 3 veya BrdU etiketleme (progenitör çoğalması) farklılaşma 5 ile mitotik indeks hesaplama sağlar.
Protocol
1.. Embriyolar Montaj (örneğin İmmünositokimya olarak seçilen Görselleştirme Tekniği, tamamlanmasıyla, In situ Hibridizasyon, vb)
- Seçim tamponu (Şekil 1A) ile dolu bir 35 mm Petri tabağına yerleştirin embriyolar. Tamponun seçimi etiketleme prosedürü dayanmaktadır. Tipik olarak PBS-tabanlı tamponlar uygundur.
- Bir mikroskop ve forseps kullanarak altında, diğer çifti (Şekil 1B) ile uzak sarısını çekerken forseps bir çift ile başını sağlamlaştırmak. Alternatif olarak, yavaşça sarısı uzağa çekmek için bir böcek pin tutucu bir böcek iğne kullanın.
- Embriyo poker kullanarak sarısı enkaz (Şekil 1C-D) bir sürü yok Petri kabı bir parçası embriyoları taşımak (misina (0.41 mm çapında) bir kılcal tüp veya bir Pasteur pipet ya yapıştırılmış).
- , Bir cam Pasteur pipet kullanarak, mümkün olan ve g kadar küçük sıvı içinde embriyolar aspireently bir slayt (Şekil 1E) üzerine onları pipetle.
- Yavaşça bir laboratuvar mendilde kullanarak fazla sıvıyı fitil. Embriyolar ile temastan kaçının.
- Embriyoların montaj orta bir damla ekleyin. Floresan etiketler için, seçtiğiniz bir antifade reaktif kullanın. Kolorimetrik sinyaller için,% 70 gliserol, bir montaj ortamı olarak kullanılabilir.
- Embriyo poker kullanarak, sıra (Şekil 1F) kendi yüzüne embriyolar yönlendirmek.
- Bir lamel (Şekil 1G) her köşesine vazelin ya da yüksek vakum gres biri "DAB" ekleyin. Bu aşırı sıkışmadan embriyonun hasar görmesini önler.
- Embriyolar (Şekil 1H) üstüne lamel (aşağı vazelin tarafı) yerleştirin.
- Yavaşça (% 70 gliserol veya anti-solmaya montaj reaktif) lamel (Şekil 1H) dokunuyor montaj medya kadar her köşesinde lamel dokunun.
- Gerekirse, hemen yanındaki cov için pipetleme fazla montaj ortamları eklemekerslip, 20-200 ml aralığında bir pipet kullanarak. Bu altında fitil olacaktır.
- Bir laboratuvar kullanarak lamel etrafında tamamen temiz, silin. Bu embriyolar zarar verir gibi, lamel baskı uygulamak değil belirli olun. Bu alan, kuru olması ve bunun üzerinde hiçbir vazelin ya da montaj medya olmalıdır.
- Lamel (Şekil 1 H) kenarında mühür tırnak cilasıyla.
Representative Results
Gibi hücresel desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi çeşitli gelişimsel olayları altında yatan mekanizmaların tanıtılması, bu onların doku kapsamında hücreleri görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Pax, NKX veya dbx ailelerin 4 transkripsiyon faktörlerinin ifade alanındaki bir ventral ve dorsal vardiya tipik olarak mevcut dorsoventral desenleme kusurları. Zaman zaman, değişiklikler yalnızca birkaç hücre çapını 4 içeren, ince olabilir. Kesit analizi analizi bu tür izin verir. Bununla birlikte, daha zayıf sinyaller veya AP eksenine dik olmayan kesitlere sahip reaktifler yorumlanması sınırlayabilir. Ayrıca, kesit analizi kolayca değişiklikler AP ekseninde devam olup olmadığını dikkate almak ve bir kriostadın durumuna dayanmaktadır değildir. Bu sınırlama omurilik yan manzarası ile aşılmasıdır. Şekil 2B'de görüldüğü gibi, nkx6.1 mRNA dprogenitör etki alanı içinde, 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) omuriliğin kabaca ventral yarısında istributed. Progenitör hücreler, omurilik orta kısmında bulunan zemin levhası, varlığı nedeniyle postmitotik hücrelerden ayırt edilebilir. DIC optik ile Bakanlar, tek tek hücrelerin açıkça ayırt edilebilir ve hücreleri ifade ve nonexpressing arasında tanımlanmış bir sınır açıktır.
Progenitör Hücre döngüsü çıkış gen ekspresyonunda değişiklikler eşlik etmektedir. Örneğin, tüm post-mitotik nöronlar immünsitokimya 1,5 ile saptanabilir HUC / D ifade eder. islet, gata, ve VSX aileler için mRNA sondalar her spinal kord hemisegment 6 içinde tutarlı bir konumda ve dizi spesifik post-mitotik nöronlar etiket. Buna ek olarak, bu tür robot ailede gibi akson rehberlik reseptörleri postmitotic nöronların kısıtlı popülasyonlarında (Şekil 2C) ifade edilmiştir
24 hpf, aşağıdaki postmitotic nöronların akson çeşitli yöntemler ile görüntülendi ve tek hücre düzeyinde ayırt edilebilir olabilir: Sırt Yanal Artan (Dola), Commissural İlköğretim Artan (CoPA), Commissural İkincil Artan (Cosa), ventral Boyuna Azalan (Veld), kolmer-Agdur (KA), Commissural çatallanan / Boyuna (CoB / L), Çevresel Artan (CIA), Çevresel Azalan (CID) ve Unipolar Commissural Azalan (UCoD), Rohon Sakal (RB), motor nöronlar ( M) 9. Aksonlar dorsal, ventral, anterior ve posterior yönde bu nöronların uzanır. Onlar şube, dorsal hem de orta hatta çapraz ve çıkmakve ventral spinal kord. Konfokal lazer tarama mikroskobu ile birleştiğinde, bu çeşitli hücresel davranışlar İmmunositokimyayı ve bu GFP 2 genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri kullanarak, yanal monte edilmiş embriyoların belirgindir. Şekil 2B, znp-1 immünositokimya geliştirmek motor nöronlar etiketlemek için kullanıldı. Motonöronlar çevreleyen gelişmekte olan kas innerve ventral omurilik çıkın.
Şekil 1. Diseksiyon ve zebra balığı embriyoların monte yanal. (A) için immünofloresan İşlemeden sonra, in situ hibridizasyon vb olarak, embriyolar bir 35 mm Petri (% 0.5 Triton X-100 içeren PBS) PBT ile dolu çanak veya Ptw (PBS ile yerleştirilir % 0.1 Tween-20). Yumurta sarısıtopu (YB) açıktır. (B) yumurta sarısı ardından dikkatli bir diseksiyon embriyo kafasını sabitleyen çıkarılır. (C) Bir embriyo poker (misina bir Pasteur pipeti yapıştırılmış) ayrı embriyo ve yumurta sarısı enkaz (D) için kullanılır. Temizlenmiş embriyolar bir mikroskop lamı (E) üzerine pipetlenir ve (F) hizalanır. (G) vazelin lamel köşelerine uygulanır. (H) bir örtücü cam, orta montaj embriyoların üstüne hafifçe yerleştirilir. (I) Tırnak cilası lamel kenarları mühür için kullanılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
< strong> Şekil 2. In pathfinding gen ekspresyonu ve akson Analizi yanal Zebra balığı embriyolar monte edilmiş. 24. hpf Zebra balığı embriyo (A) Çizim. BD, yumurta sarısı kesesi uzantısı yukarıda kabaca dört hemisegments (kutulu alan) görüntülenmiştir. (B) nkx6.1 zemin levhası (FP) gibi ventral spinal kord, olarak ifade edilir. (C) robo3 postmitotic nöronların (PMN) olarak ifade edilir. Zemin plakası ve progenitör bölge, bu daha lateral odak düzlemi belirgin değildir. B'de, C, omurilik görüntünün sol tarafında bir destek tarafından sınırlanmaktadır. (D) mikroskopisi ventrale omurilik çıkan motor aksonlar etiketler görüntü znp-1 immünofloresans, kullanılmıştır. Bütün görüntülerde, ön sol ve dorsal kalmıştır. Bir 40X uzun çalışma mesafesi, su daldırma (NA 0.8) lens (3,3 mm) kullanılmıştır.oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Discussion
Omurilik gelişim sabit Zebrafish embriyolar yardımcıları görselleştirme Yanal montaj. Yumurta sarısı topun kaldırılması sayesinde, olağanüstü mikroskobik görüntüleri için gerekli olan çalışma mesafesi azalır. Daha önce embriyo, embriyo boyutu ve doku kırılganlığına incelemek için daha zor olmasına rağmen bizim için temsili sonuçlar, bununla birlikte, bu teknik, ilk 18 HPF olarak kullanılabilir, 24 HPF aşaması ile sınırlı kalmıştır. Bu teknik aynı zamanda 24 HPF daha büyük embriyolar için de geçerlidir. Embriyonik zebrafish optik berraklık, genetik tersine, ileri genetik ekranlar gerçekleştirme yeteneği, ve transgenik yaklaşımlar yardımıyla, çeşitli gelişimsel süreçlerin araştırılması olabilir. Bu BrdU ve anti-fosfor-histon 04-06 Mart ve pax, NKX, DBX ve olig familie nöronal ve glial progenitör belirteçler ifade ile desenleme gibi işaretleri ile nöronal atalarıdır mitotik indeksleri içerirs 1,4-6. 1,4,5,10 kullanılabilir (örneğin glial fibriler asit protein (GFAP) ve HUC / D olarak) glial ve nöronal kararlılık rapor Reaktifler. Nöronal alt farklılaşma adacık, VSX, engrailed ve gata genlerin 1,4-6 sentezlenmesi yoluyla analiz edilebilir. Ve son olarak, akson rehberlik analiz, anti-asetillenmiş tubulin, 3A10 ve znp-1 2,11,12 gibi antikor ile mümkündür. Diğer omurgalı model sistemler (fare ve civciv) sağlam embriyonun tüm gelişimsel sadece eksenlerin Zebrafish izin eşzamanlı izleme, omurilik gelişimini incelemek için kullanılır rağmen.
Bu yaklaşımın belirgin sınırlama Canlı görüntülemeyi engeller ki, embriyolar sabit olmasıdır. Aslında, hızlı embriyonik ölümle sarısı sonuçları (ya da hasar) çıkarılması, bu nedenle bu teknik kullanılarak canlı embriyolar işçi mesafeyi azaltmak mümkün değildir. Ancak, yüksek büyütme spinal işbirliğicanlı embriyolarının rd görüntüleme mümkündür. Canlı görüntüleme sırasında sarısı korumak için, embriyolar, numune ve lamel arasında daha büyük bir alan sağlamak depresyon slaytlar, yerleştirilebilir. Seçenek olarak ise, çok 22 mm x 22 mm lamelleri mikroskobik slayt x 1 'de bir 3 ya da slayt üzerinde yapıştırılmış olabilir. Lamelleri örten lamel için bir "köprü" olarak hizmet vermektedir. Embriyolar 18 HPF daha büyük ise, tricaine hareket etmesini önlemek için embriyolar uyuşturmak için kullanılır. Bozulmamış sarısı ile, agaroz gömülü canlı embriyolar ile çalışırken 0,288 mm çalışma mesafesi, 24 hpf deyolked embriyolar için gerekli olsa da, 3.3 mm çalışma mesafesi olan mikroskobik lens yeterlidir. Seçenek olarak ise, deyolked embriyolardan türetilen eksplant kültürleri, bir plazma pıhtısı hareketsiz 13 tekniği kullanılarak görüntülenebilir. Çeşitli hücre popülasyonları gibi GFP, mCherry veya Photocon genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri aracılığıyla gözlemlenebilirvertible boya Kaede (birkaç isim). Ayrıca, kimerik embriyoların içinde floresan etiketli hücreleri de bu yaklaşımla 14 ile görülebilir.
Ay için kararlı tutarlı bir montaj tekniği gelişim ve hücre biyologlar için kritik bir araçtır. Bu basit teknik, farklı deneysel çalışmalarda arasında kolay karşılaştırma sağlayan, tekrarlanabilir. Ayrıca, sıra embriyo hizalama kolayca daha sonra analiz için özel embriyo tanımlanmasına izin verir.
Disclosures
Hiçbir rakip mali çıkarlarını yazar ya için var.
Acknowledgments
Skidmore Fakültesi Gelişme Hibe Bu yazının hazırlanması ve yayını finanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dishes 35 mm x 10 mm |
VWR | 25373-041 |
|
| Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific | NC9839169 |
|
| Cover glass |
Fisher Scientific | 12-541-B22X22-1.5 |
|
| Slides |
Fisher Scientific | 12-550-343 |
|
| SlowFade Gold |
Fisher Scientific | S36936 |
|
| ProLong Gold |
Life Technologies | P36934 |
|
| Petroleum Jelly |
any grocery store |
|
|
| Loop Holders |
VWR | 80094-482 |
|
| Insect Pins |
Fine Science Tools | 26002-10 |
|
| Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools | 26016-12
|
|
Olympus Stereomicroscope |
Olympus | SZ61 |
References
- Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal. Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).
- Bonner, J., et al. Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons. Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).
- Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. Zebrafish. , In Press. (2012).
- Bonner, J., et al. Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling. Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).
- Gribble, S. L., et al. Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression. Development. 136 (5), 781-789 (2009).
- England, S., et al. Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons. Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).
- Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish. Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).
- Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell. 221 (2), 216-230 (2001).
- Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons. Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).
- Kim, H., et al. Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos. Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- de Soysa, T. Y., et al. Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis. BMC Biol. 10 (40), (2012).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).
- Deschene, E. R., Barresi, M. J. Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (31), (2009).
