Summary
Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements.
Abstract
La moelle épinière poisson zèbre est un modèle d'enquête efficace pour la recherche sur le système nerveux pour plusieurs raisons. Tout d'abord, génétique, gènes transgéniques et des approches de knockdown peuvent être utilisés pour examiner les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement du système nerveux. Deuxièmement, les grandes griffes d'embryons de développement synchronisés fournissent de grandes tailles d'échantillons expérimentaux. Troisièmement, la clarté optique de l'embryon de poisson zèbre permet aux chercheurs de visualiser ancêtre, gliales, et populations neuronales. Bien que les embryons de poisson zèbre sont transparentes, épaisseur de l'échantillon peut gêner la visualisation microscopique efficace. Une raison à cela est la mise en tandem de la moelle épinière et le tissu recouvrant somites. Une autre raison est la grande bille de jaune d'oeuf, qui est toujours présente dans les périodes de début de la neurogenèse. Dans cet article, nous démontrons microdissection et le retrait du jaune dans les embryons fixes, qui permet la visualisation microscopique tout en préservant les tissus environnants somites. Nous also démontrer montage semi-permanent de embryons de poisson zèbre. Ceci permet l'observation de développement neurologique dans les axes dorso-ventral et antéro-postérieure, comme il préserve le caractère tridimensionnel de tissu.
Introduction
La visualisation de la moelle épinière chez le poisson zèbre est inhibé par un certain nombre de facteurs. En raison de l'épaisseur des somites sus-jacentes et l'emplacement interne de la moelle épinière, d'une distance de travail de la longueur considérable est requis pour une résolution cellulaire élevée. La balle de jaune d'oeuf (qui est toujours présent pendant les premiers stades de la neurogenèse) augmente encore la distance de travail requise, et est facilement endommagé par une pression à partir d'une lamelle couvre-objet. En outre, les débris de jaune endommagé interdit visualisation claire des tissus. Bien que les sections transversales dans les (DV) axe dorso-ventral sont possibles, elles ne permettent pas facilement la visualisation simultanée dans l'axe 1 antéro-postérieur (AP).
Pour surmonter ces obstacles, les embryons sont disséqués et montés sur des lames. Cette procédure présente plusieurs avantages. Tout d'abord, embryons de poisson zèbre se trouvent facilement avec le côté latéral vers le haut, ce qui facilite la visualisation AP axe. En second lieu, le retrait de la BAL du jaune d'oeufl diminue la distance de travail nécessaire et limite les débris. Troisièmement, cette procédure de montage permet à la fois fluorescent et la microscopie en fond clair. Quatrièmement, les embryons sont montés stable pendant des mois à 4 ° C, ce qui permet spécimen prolongée visualisation. Enfin, la progression du développement se produit en ce que les segments antérieurs sont plus matures que les segments postérieurs. Afin de veiller à ce que la colonne vertébrale étagées hemisegments appariés sont comparées entre les embryons, recouvrant le tissu somite est utilisé en tant que guide. Par exemple, le dixième somites plus postérieure recouvre la moelle hemisegment dixième, ce qui est équivalent de développement dans des embryons au stade appariés. Cette procédure de montage d'embryons intacts permet d'identifier facilement les somites.
Nous utilisons la génétique et de technologies géniques knock-down pour étudier les mécanismes de guidage axonal dans la moelle épinière en développement. En particulier, nous avons déterminé que robo2, ROBO3 et DCC sont nécessaires pour Commissural Asce primairending (COPA) des axones. En utilisant la procédure de montage décrit ici, nous avons pu examiner la croissance ventrale, la ligne médiane de passage, la largeur de la commissure, dorsale et 2,3 de croissance antérieure. Cette procédure de montage peut également être appliquée à DV ou AP structuration de la moelle épinière. Nous avons utilisé cette procédure pour déterminer les rôles disparates d'effecteurs Wnt en aval DV structuration de la moelle épinière. L'utilisation de ce montage, nous avons réussi à obtenir une résolution de marqueurs DV au niveau de la cellule unique, et déterminer les changements de mise en forme de minutes à la suite d'altération de la réception du signal Wnt 4,5. Cette procédure de montage permet également de calcul de l'indice mitotique par anti-phosphohistone 3 ou marquage BrdU (ancêtre de la prolifération) de différenciation 5.
Protocol
Une. Les embryons de montage (à la fin de la sélection technique de visualisation, comme immunocytochimie, hybridation in situ, etc)
- Placez embryons dans un plat de 35 mm de Pétri remplie avec le tampon de choix (figure 1A). Le choix du tampon est basée sur la procédure d'étiquetage. Typiquement, des tampons à base de PBS sont appropriés.
- Sous un microscope de dissection, et l'aide de pinces, fixez la tête avec une paire de pinces, tout en tirant le jaune loin avec l'autre paire (figure 1B). Vous pouvez également utiliser une broche d'insecte dans un porte-broche insecte de tirer doucement le jaune.
- Utilisation du poker embryonnaire (de ligne de pêche (diamètre 0,41 mm) collée sur une ou l'autre d'un tube capillaire ou une pipette Pasteur) déplacer les embryons à une partie de la boîte de Petri qui ne possède pas une grande quantité de débris de jaune d'oeuf (Figures 1C-D).
- En utilisant une pipette Pasteur en verre, aspirer les embryons dans le moins de liquide possible, et gently les introduire à la pipette sur une lame (figure 1E).
- Mèche doucement l'excès de liquide à l'aide d'un laboratoire lingette. Eviter le contact avec les embryons.
- Ajouter une goutte de milieu de montage pour les embryons. Pour les étiquettes fluorescentes, utiliser un réactif antifade de choix. Pour les signaux colorimétriques, 70% de glycerol peut être utilisé comme milieu de montage.
- Utilisation du poker de l'embryon, orienter les embryons sur leurs côtés dans les rangées (figure 1F).
- Ajouter un "tape" de vaseline ou de graisse à vide poussé à chaque coin d'une lamelle (figure 1G). Ceci empêche des dommages de l'embryon de la compression excessive.
- Placez la lamelle (côté de la vaseline en bas) sur des embryons (figure 1H).
- Tapoter doucement la lamelle sur chaque coin jusqu'à ce que le milieu de montage (70% de glycérol ou anti-fade réactif de montage) est en contact avec la lamelle (figure 1H).
- Si nécessaire, ajouter plus de support de montage par aspiration juste à côté de la coverslip, à l'aide d'une pipette dans la plage de 20 à 200 ml. Il mèche sous.
- L'utilisation d'un laboratoire essuyer, nettoyer complètement autour de la lamelle. Soyez certain de ne pas appliquer une pression sur la lamelle, car cela pourrait endommager les embryons. Cette zone doit être sec et n'ont pas de gelée de pétrole ou de médias de fixation.
- Utilisez le vernis à ongles pour sceller autour du bord de la lamelle (figure 1I).
Representative Results
Lorsque la compréhension des mécanismes qui sous-tendent divers événements de développement tels que la structuration cellulaire, la différenciation et le guidage axonal, il est important d'être en mesure de visualiser les cellules dans le contexte de leur tissu. Défauts dorso-ventral de motifs généralement présents comme un changement ventrale ou dorsale dans le domaine de l'expression des facteurs de transcription dans la pax, NKX, ou familles dbx 4. Parfois, les changements peuvent être subtils, comprenant seulement quelques diamètres de cellules 4. Analyse transversale permet ce type d'analyse. Toutefois, des réactifs avec des signaux plus faibles, ou des sections transversales qui ne sont pas perpendiculaires à l'axe AP peuvent limiter l'interprétation. En outre, une analyse transversale ne facilement prend pas en compte le fait que les changements persistent dans l'axe AP, et repose sur la disponibilité d'un cryostat. Cette limitation est contournée par des vues latérales de la moelle épinière. Comme on le voit sur la figure 2B, Nkx6.1 ARNm est distributed à peu près la moitié ventrale de la moelle épinière à 24 h après la fécondation (HPF), dans le domaine de l'ancêtre. Les cellules progénitrices peuvent être distinguées des cellules post mitotiques en raison de la présence de la plaque de fond, qui se trouve dans la partie médiane de la moelle épinière. Vu avec optique DIC, les cellules individuelles sont nettement distinctes et une limite définie entre l'expression et nonexpressing cellules est évidente.
sortie du cycle de cellules progénitrices est accompagné par des changements dans l'expression génique. Par exemple, tous les neurones post-mitotiques expriment HuC / D qui est détectable par immunohistochimie 1,5. sondes d'ARNm de l'îlot, gata, et les familles de VSX étiqueter les neurones post-mitotiques spécifiques de la position constante et le nombre de chaque cordon hemisegment moelle 6. En outre, les récepteurs de guidage axonal, tels que ceux de la famille de robo sont exprimés dans les populations de neurones post-mitotiques restreintes (Figure 2C)
À 24 HPF, les axones des neurones post-mitotiques suivantes peuvent être visualisées avec différentes méthodes, et se distinguent au niveau de la cellule unique: Dorsale latéral ascendant (LRPC), Commissural Croissant primaire (COPA), Commissural secondaire croissant (CSR), ventrale longitudinale décroissant (plaine), Kolmer-Agdur (KA), Commissural bifurcation / longitudinales (CoB / L), circonférentielle Croissant (CIA), circonférentielle Descendant (CID), et unipolaire Commissural Descendant (UCOD), Rohon-Barbe (RB), les motoneurones ( M) 9. Axones s'étendent de ces neurones dans la dorsale, ventrale, antérieure et postérieure directions. Ils branche, croisent la ligne médiane, et sortent à la fois la dorsaleet la moelle épinière ventrale. Lorsqu'il est couplé avec la microscopie confocale à balayage laser, ces comportements cellulaires variées sont évidents dans les embryons montés latéralement, en utilisant des protéines fluorescentes et immunocytochimie codés génétiquement telles que GFP 2. Dans la figure 2D, ZNP-1 immunocytochimie a été utilisé pour étiqueter les motoneurones en développement. Motoneurones quittent la moelle épinière ventrale pour innerver les muscles entourant le développement.
Figure 1. Dissection et latéral monter des embryons de poisson zèbre. (A) Après le traitement pour l'immunofluorescence, hybridation in situ, etc, les embryons sont placés dans une boîte de Petri 35 mm rempli de PBT (PBS avec 0,5% de Triton X-100) ou PTW (PBS avec 0,1% de Tween-20). Le jaune d'oeufballe (YB) est évident. (B) Le jaune est éliminé par fixation de la tête de l'embryon suivie par dissection minutieuse. (C) Un poker d'embryon (la ligne de pêche collé sur une pipette Pasteur) est utilisé pour séparer les embryons et les débris de jaune d'oeuf (D). Embryons nettoyés sont déposés à la pipette sur une lame de microscope (E) et alignés (F). Gelée (G) des hydrocarbures est appliquée sur les coins de la lamelle couvre-objet. (H) La lamelle est placée légèrement au-dessus des embryons dans un milieu de montage. (I) Le vernis à ongles est utilisé pour sceller les bords de la lamelle. Cliquez ici pour agrandir l'image .
< strong> Figure 2. L'analyse des profils d'expression des gènes et des axones en monté latéralement embryons de poisson zèbre. (A) Dessin d'un embryon de poisson zèbre à 24 HPF. En BD, environ quatre hemisegments-dessus de la prolongation de la vésicule ombilicale sont visualisées (zone encadrée). (B) Nkx6.1 est exprimé dans la moelle épinière ventrale, y compris la plaque de base (FP). (C) ROBO3 est exprimé dans les neurones post-mitotiques (PMN). La zone de la plaque de sol et progénitrices n'est pas évidente dans ce plan focal plus latérale. En B, C, la moelle épinière est délimitée par un support sur le côté gauche de l'image. (D) La microscopie confocale a été utilisée pour l'image ZNP-1 immunofluorescence, qui marque les axones moteurs qui sortent de la moelle épinière ventrale. Dans toutes les images, est antérieure à la gauche et dorsale est écoulé. Une longue distance de travail 40X, immersion dans l'eau (NA 0,8) lentille a été utilisé (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Discussion
Montage latéral fixe des embryons de poissons zèbres aides visualisation du développement de la moelle épinière. Grâce à l'élimination de la bille de jaune d'oeuf, la distance de travail nécessaire à l'imagerie microscopique exceptionnelle est réduite. Nos résultats représentatifs ont été limitées à l'étape 24 hpf, cependant, cette technique peut être utilisée aussi tôt que 18 hpf, bien que les embryons antérieurs sont plus difficiles à disséquer raison de la taille de l'embryon et de la fragilité du tissu. Cette technique est également applicable à des embryons âgés de plus de 24 hpf. Aidé par la clarté optique du poisson zèbre embryonnaire, la capacité d'effectuer des cribles génétiques à terme, la génétique inverse, et les approches transgéniques, plusieurs processus de développement peuvent être étudiées. Ceci inclut des indices mitotiques de progéniteurs neuronaux avec des marqueurs tels que BrdU et anti-phospho-histone H3 4-6 et un motif à travers l'expression de marqueurs progénitrices neuronales et gliales dans la pax, NKX, dbx, et olig families 1,4-6. Les réactifs qui signalent détermination neuronale et gliale (telle que la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) et HuC / D) 1,4,5,10 peuvent être utilisés. Différenciation neuronale sous-type peut être analysée à travers l'expression de l'îlot, VSX, engrailed, et les gènes de gata 1,4-6. Et enfin, l'analyse de guidage axonal est possible grâce à des anticorps tels que la tubuline anti-acétyle, 3A10, et ZNP-1 2,11,12. Bien que d'autres systèmes de modèles vertébrés (souris et poussin) sont utilisés pour étudier le développement de la moelle épinière, seul le permis de poisson zèbre visualisation simultanée de tous les axes de développement de l'embryon intact.
La limitation évidente de cette approche est que les embryons sont fixes, ce qui exclut l'imagerie en direct. En fait, l'élimination du (ou des dommages à) les résultats de jaune d'oeuf dans la mort embryonnaire rapide, il n'est donc pas possible de réduire la distance de travail dans les embryons vivants en utilisant cette technique. Cependant, fort grossissement co moellee imagerie embryons vivants est possible. Afin de préserver le jaune au cours de l'imagerie en temps réel, les embryons peuvent être placés dans des glissières de dépression, qui donnent un plus grand espace entre l'échantillon et la lamelle couvre-objet. Sinon, plusieurs 22 mm x 22 mm lamelles peuvent être collées sur chaque diapositive d'un 3 po x 1 po lame de microscope. Les lamelles servent de "pont" pour la lamelle de recouvrement. Si les embryons sont âgés de plus de 18 HPF, tricaine est utilisé pour anesthésier les embryons pour éviter tout mouvement. Bien qu'une distance de travail de 0,288 mm est nécessaire pour les embryons deyolked à 24 hpf, lorsque l'on travaille avec des embryons vivants noyées dans l'agarose, les jaunes intactes avec une lentille microscopique avec une distance de travail de 3,3 mm, est suffisante. En variante, les cultures d'explants provenant d'embryons deyolked peuvent être visualisées en utilisant une technique d'immobilisation d'un caillot de plasma 13. Différentes populations de cellules peuvent être observées grâce à l'utilisation de protéines fluorescentes codées génétiquement telles que GFP, mCherry, ou le photoconcolorant convertibles Kaede (pour n'en nommer que quelques-uns). En outre, les cellules marquées par fluorescence dans des embryons chimériques peuvent également être visualisés à cette approche 14.
Une technique de montage cohérent qui est stable pendant des mois est un outil essentiel pour les biologistes du développement et de cellules. Cette technique simple est reproductible, permettant une comparaison facile entre les différents essais expérimentaux. En outre, l'alignement des embryons dans les rangées permet facilement l'identification des embryons spécifiques pour une analyse ultérieure.
Disclosures
Aucun intérêt financier concurrentes existent pour l'un des auteurs.
Acknowledgments
Skidmore Faculté subvention de développement a financé la préparation et la publication de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dishes 35 mm x 10 mm |
VWR | 25373-041 |
|
| Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific | NC9839169 |
|
| Cover glass |
Fisher Scientific | 12-541-B22X22-1.5 |
|
| Slides |
Fisher Scientific | 12-550-343 |
|
| SlowFade Gold |
Fisher Scientific | S36936 |
|
| ProLong Gold |
Life Technologies | P36934 |
|
| Petroleum Jelly |
any grocery store |
|
|
| Loop Holders |
VWR | 80094-482 |
|
| Insect Pins |
Fine Science Tools | 26002-10 |
|
| Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools | 26016-12
|
|
Olympus Stereomicroscope |
Olympus | SZ61 |
References
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