发育过程,如增殖,图案,分化和轴突导向可以很容易地模拟在斑马鱼的脊髓。在这篇文章中,我们描述了一个安装程序,斑马鱼的胚胎,从而优化了这些事件的可视化。
斑马鱼的脊髓是神经系统研究的一个有效的调查模式有以下几个原因。首先,基因,转基因和基因敲除的方法可以被用来检查相关的神经系统发育的分子机制。其次,同步发育胚胎的大型离合器提供大型实验的样本量。三,斑马鱼胚胎的光学清晰度允许研究人员能够可视祖,胶质和神经元群体。尽管斑马鱼的胚胎是透明的,试样厚度可以阻碍有效的微观可视化。其中一个原因是脊髓和覆体节组织的串联发展。另一个原因是大卵黄球,这仍然是在早期神经发生期间存在。在这篇文章中,我们展示了显微切割和拆除蛋黄固定胚胎,这使得微观可视化,同时保留周围的体节的组织。我们阿尔斯Ø证明斑马鱼胚胎的半永久性的安装。这就允许观察神经发育中的背腹和前后轴线,因为它保留了立体感的组织。
在斑马鱼中的脊髓的可视化是由若干因素的抑制。由于上覆体节的厚度和脊髓的内部位置,在相当长的工作距离是必需的高细胞分辨率。卵黄球(它仍然存在于神经发生的早期阶段),进一步增加了所需的工作距离,并且很容易通过从盖玻片压力损坏。此外,从受损的蛋黄碎屑禁止清晰的组织的可视化。虽然在背腹(DV)轴的横截面是可能的,它们不容易允许同时可视化中的前-后(AP)的轴1。
为了克服这些障碍,胚胎解剖和幻灯片上。此过程提供了一些好处。首先,斑马鱼胚胎容易出在侧面朝上,这有利于AP轴可视化。第二,去除蛋黄的BAL升降低要求的工作距离,并且限制碎屑。三,本次安装程序允许荧光和明场显微镜。四,安装的胚胎是稳定了几个月,在4°C,使长时间的标本可视化。最后,开发进展发生在眼前段比后段更成熟。为了确保分级匹配脊hemisegments胚胎之间进行比较时,上覆体节组织作为一个指南。例如,第十最后部体节覆盖在第十脊hemisegment,这是在阶段相匹配的胚胎发育当量。完整胚胎此安装程序可方便识别体节。
我们利用遗传学和基因敲除技术研究轴突导向的机制在发展中脊髓。特别是,我们已经确定ROBO2,ROBO3,和DCC所需的连合小学ASCEnding(COPA)轴突路径。使用此处描述的安装过程,我们能够审视腹增长,中线交叉,合缝宽度,背鳍和前增长2,3。该安装过程也可以应用到DV或脊髓的AP构图。我们已经用这种方法来确定在脊髓的DV图案Wnt信号的下游效应物不同的角色。使用这种安装,我们能够取得的DV标志的分辨率在单细胞水平,并确定分钟图案变化为改变的Wnt信号接收4,5的结果。此安装程序还允许有丝分裂指数的计算通过抗磷组3或BrdU标记(祖细胞增殖)分化5。
脊髓发展的固定斑马鱼胚胎辅助可视化横向安装。通过除去卵黄球的,需要特殊的显微成像的工作距离被减小。我们的代表性的结果被限制到24个高倍视野的阶段,然而,这种技术可以早在18个高倍视野中使用,尽管早期胚胎是更难以解剖由于胚胎的大小和组织的脆弱性。这种技术也适用于年龄大于24个高倍视野胚胎。由胚胎斑马鱼的光学透明性,执行正向遗传筛选,反向遗传学的能力,并且转基因方法的帮助下,几种发育过程可能进行调查。这包括神经元祖细胞具有类似的BrdU和抗磷酸化组蛋白3月4日至6日 ,通过在PAX,NKX,DBX,并OLIG FAMILIE神经元和神经胶质祖细胞标记物的表达图案标记有丝分裂指数s 1,4-6。试剂用于报告胶质和神经元确定(如胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和于克/ D)1,4,5,10都可以使用。神经元亚型的分化可以通过胰岛,VSX,engrailed基因和转录因子GATA基因1,4-6的表达进行分析。最后,轴突引导的分析有可能通过抗体诸如抗乙酰化的微管蛋白,3A10和ZNP-1 2,11,12。虽然其他脊椎动物模型系统(小鼠和鸡)被用来研究脊髓的发展,只有斑马鱼可以同时观看未受影响胚胎发育的所有轴。
最明显的限制,这种方法是,胚胎是固定的,这就排除了实时成像。事实上,除去(或损坏)的蛋黄结果中快速胚胎死亡,因此是不能够减少使用这种技术的工作距离在活的胚胎。然而,高倍率脊髓合作在活胚胎的RD成像是可能的。为了在实时成像以保持蛋黄,胚胎可以被放置在低气压的幻灯片,它提供的标本和盖玻片之间更大的空间。可选地,几个22毫米x 22毫米的盖玻片可以粘在×1一3在显微镜载玻片或幻灯片上。盖玻片作为一个“桥梁”,为覆盖玻片。如果胚胎是年龄超过18 HPF,三卡因用于麻醉胚胎,以防止移动。而与嵌入琼脂糖活胚胎中工作时,具有完整的蛋黄是必需的0.288毫米的工作距离为deyolked胚胎在24个高倍视野,一个显微镜头为3.3毫米的工作距离是足够的。或者,从deyolked胚来源的外植体培养可使用血浆凝块固定化技术13可视化。细胞的不同人群可以通过使用遗传编码荧光蛋白如GFP,mCherry的,或者photocon的被观察vertible染枫(仅举几例)。另外,嵌合体胚胎内荧光标记的细胞也可以用这种方法14观看。
一致的安装技术,可稳定几个月是发育和细胞生物学的重要工具。这个简单的技术是可重复的,允许不同的实验试验之间易于比较。此外,在胚胎行的对齐方式容易进行鉴定后分析具体的胚胎。
The authors have nothing to disclose.
斯基德莫尔学院发展基金资助的这个手稿的编写和出版。
Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
Petroleum Jelly |
Any grocery store |
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Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
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Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |