इस तरह के प्रसार, patterning, भेदभाव, और अक्षतंतु मार्गदर्शन के रूप में विकास की प्रक्रिया तत्काल zebrafish रीढ़ की हड्डी में मॉडलिंग की जा सकती. इस अनुच्छेद में, हम इन घटनाओं के दृश्य जो अनुकूलन, zebrafish भ्रूण के लिए एक बढ़ते प्रक्रिया का वर्णन.
zebrafish रीढ़ की हड्डी में कई कारणों से तंत्रिका तंत्र में अनुसंधान के लिए एक प्रभावी खोजी मॉडल है. सबसे पहले, आनुवंशिक, ट्रांसजेनिक और जीन पछाड़ना दृष्टिकोण तंत्रिका तंत्र के विकास अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. दूसरा, developmentally सिंक्रनाइज़ भ्रूण की बड़ी चंगुल बड़े प्रयोगात्मक नमूना आकार प्रदान करते हैं. तीसरा, zebrafish भ्रूण की ऑप्टिकल स्पष्टता पूर्वज, glial, और neuronal आबादी कल्पना करने के लिए शोधकर्ताओं ने परमिट. Zebrafish भ्रूण पारदर्शी हैं, नमूना मोटाई प्रभावी सूक्ष्म दृश्य बाधित कर सकते हैं. इसका एक कारण रीढ़ की हड्डी और overlying विखंड ऊतक का मिलकर विकास है. दूसरा कारण यह अभी भी जल्दी neurogenesis की अवधि के दौरान मौजूद है जो बड़े जर्दी गेंद, है. इस अनुच्छेद में, हम microdissection और विखंड ऊतक आसपास के संरक्षण, जबकि सूक्ष्म दृश्य की अनुमति देता है, जो तय भ्रूण में जर्दी, को हटाने का प्रदर्शन. हम ए एल एसओ zebrafish भ्रूण की semipermanent बढ़ते प्रदर्शित करता है. यह ऊतक के तीन dimensionality को बरकरार रखता है, क्योंकि यह dorso-उदर और पूर्वकाल पीछे कुल्हाड़ियों में सक्षम के चिकित्सकों का अवलोकन परमिट.
Zebrafish में रीढ़ की हड्डी के दृश्य के कारकों में से एक नंबर से हिचकते हैं. कारण overlying somites की मोटाई और रीढ़ की हड्डी का आंतरिक स्थान पर, एक काफी लंबे समय तक काम दूरी उच्च सेलुलर संकल्प के लिए आवश्यक है. (neurogenesis के प्रारंभिक दौर के दौरान अभी भी मौजूद है) की जर्दी गेंद आगे आवश्यक काम दूरी बढ़ जाती है, और आसानी से एक coverslip के दबाव से क्षतिग्रस्त है. इसके अलावा, क्षतिग्रस्त जर्दी से मलबे ऊतकों का स्पष्ट दृश्य पर प्रतिबंध लगाता है. Dorso-उदर (डीवी) अक्ष में पार वर्गों संभव हो रहे हैं, वे आसानी से पूर्वकाल पीछे (एपी) धुरी 1 में एक साथ दृश्य की अनुमति नहीं देते.
इन बाधाओं को दूर करने, भ्रूण स्लाइड पर विच्छेदित और बढ़ रहे हैं. यह प्रक्रिया कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, zebrafish भ्रूण आसानी से पार्श्व पक्ष एपी अक्ष दृश्य की सुविधा है, जो ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ झूठ. जर्दी बाल का दूसरा, हटानेएल आवश्यक काम दूरी कम हो जाती है, और मलबे की सीमा. तीसरा, इस बढ़ते प्रक्रिया फ्लोरोसेंट और brightfield माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए अनुमति देता है. चौथा, घुड़सवार भ्रूण लम्बी नमूना दृश्य की अनुमति, 4 डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए स्थिर रहे हैं. अंत में, विकास की प्रगति कि पूर्वकाल क्षेत्रों में होता है पीछे क्षेत्रों की तुलना में अधिक परिपक्व हो रहे हैं. मंचन मिलान किया रीढ़ की hemisegments भ्रूण के बीच तुलना की जाती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, overlying विखंड ऊतक एक गाइड के रूप में प्रयोग किया जाता है. उदाहरण के लिए, दसवां सबसे पीछे विखंड चरण से मिलान भ्रूण में विकासात्मक बराबर है जो दसवें रीढ़ की hemisegment, overlies. बरकरार भ्रूण के इस बढ़ते प्रक्रिया somites की आसानी से पहचान की अनुमति देता है.
हम विकासशील रीढ़ की हड्डी में अक्षतंतु मार्गदर्शन के तंत्र का अध्ययन करने के आनुवंशिकी और जीन दस्तक नीचे प्रौद्योगिकियों का उपयोग करें. विशेष रूप से, हम robo2, robo3, और डीसीसी जोड़ संबंधी प्राथमिक ASCE के लिए आवश्यक हैं कि निर्धारित किया हैnding (कोपा) अक्षतंतु pathfinding. यहाँ वर्णित बढ़ते प्रक्रिया का उपयोग करना, हम उदर विकास, midline पार, संयोजिका चौड़ाई, पृष्ठीय और पूर्वकाल विकास 2,3 जांच कर रहे थे. इस बढ़ते प्रक्रिया भी DV या रीढ़ की हड्डी के एपी patterning के लिए लागू किया जा सकता है. हम रीढ़ की हड्डी की DV patterning में नीचे की ओर Wnt effectors के असमान भूमिकाओं का निर्धारण करने के लिए इस प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है. इस बढ़ते उपयोग करना, हम एकल कोशिका के स्तर पर DV मार्करों के प्रस्ताव प्राप्त, और बदल Wnt संकेत स्वागत 4,5 के परिणामस्वरूप मिनट patterning पारियों निर्धारित करने में सक्षम थे. इस बढ़ते प्रक्रिया भी विरोधी phosphohistone 3 या BrdU लेबलिंग (पूर्वज प्रसार) भेदभाव से 5 तक mitotic सूचकांक की गणना के लिए अनुमति देता है.
रीढ़ की हड्डी में विकास के निर्धारित zebrafish भ्रूण एड्स दृश्य के पार्श्व बढ़ते. जर्दी गेंद को हटाने के माध्यम से, असाधारण सूक्ष्म इमेजिंग के लिए आवश्यक काम दूरी कम हो जाता है. पहले भ्रूण के कारण भ्रूण का आकार और ऊतकों की कमजोरी को काटना अधिक मुश्किल कर रहे हैं, हालांकि हमारे प्रतिनिधि परिणाम बहरहाल, इस तकनीक के रूप में जल्दी 18 HPF के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, 24 HPF मंच तक ही सीमित थे. इस तकनीक को भी 24 HPF से अधिक पुराने भ्रूण के लिए लागू है. भ्रूण zebrafish के ऑप्टिकल स्पष्टता, जेनेटिक्स, रिवर्स आगे आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता है, और ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण द्वारा सहायता प्राप्त, कई विकास की प्रक्रिया की जांच की जा सकती है. इस BrdU और विरोधी phospho-histone 4-6 मार्च और पैक्स, nkx, DBX, और olig Familie में neuronal और glial पूर्वज मार्करों की अभिव्यक्ति के माध्यम से patterning तरह मार्कर के साथ neuronal progenitors के mitotic सूचकांक में शामिलएस 1,4-6. 1,4,5,10 इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे glial fibrillary एसिड प्रोटीन (GFAP) और Huc / डी के रूप में) glial और neuronal दृढ़ संकल्प है कि रिपोर्ट अभिकर्मकों. Neuronal उप प्रकार भेदभाव आइलेट, VSX, engrailed, और Gata जीन 1,4-6 की अभिव्यक्ति के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है. और अंत में, अक्षतंतु मार्गदर्शन के विश्लेषण में इस तरह के विरोधी acetylated ट्यूबिलिन, 3A10, और znp -1 2,11,12 के रूप में एंटीबॉडी के माध्यम से संभव है. अन्य हड्डीवाला मॉडल प्रणाली (माउस और लड़की) बरकरार भ्रूण में सभी विकास कुल्हाड़ियों से ही zebrafish परमिट एक साथ देखने, रीढ़ की हड्डी के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं.
इस दृष्टिकोण को स्पष्ट सीमा रहते इमेजिंग precludes, जो भ्रूण तय कर रहे हैं कि है. वास्तव में, तेजी से भ्रूण मौत में जर्दी परिणाम (या नुकसान) को हटाने, इस प्रकार यह इस तकनीक का उपयोग रहते भ्रूण में काम दूरी को कम करना संभव नहीं है. बहरहाल, उच्च बढ़ाई रीढ़ की सहलाइव भ्रूण में आर डी इमेजिंग संभव है. लाइव इमेजिंग के दौरान जर्दी बनाए रखने के लिए, भ्रूण नमूना और coverslip के बीच एक बड़ा स्थान प्रदान करते हैं जो अवसाद स्लाइड्स, में रखा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, कई 22 मिमी x 22 मिमी coverslips सूक्ष्म स्लाइड में एक्स 1 में 3 की या तो स्लाइड पर चिपके जा सकता है. coverslips overlying coverslip के लिए एक "पुल" के रूप में सेवा करते हैं. भ्रूण 18 HPF से अधिक उम्र के हैं, तो tricaine आंदोलन को रोकने के लिए भ्रूण anesthetize के लिए प्रयोग किया जाता है. बरकरार जर्दी के साथ, agarose में एम्बेडेड लाइव भ्रूण के साथ कार्य करते समय 0.288 मिमी की दूरी काम, 24 HPF पर deyolked भ्रूण के लिए आवश्यक है, जबकि 3.3 मिमी की दूरी काम के साथ एक सूक्ष्म लेंस के लिए पर्याप्त है. वैकल्पिक रूप से, deyolked भ्रूण से ली गई explant संस्कृतियों एक प्लाज्मा थक्का स्थिरीकरण तकनीक 13 का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं. कोशिकाओं के विभिन्न आबादी ऐसी GFP, mCherry, या photocon के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग के माध्यम से देखा जा सकता हैvertible डाई Kaede (कुछ नाम हैं). इसके अलावा, chimeric भ्रूण भीतर fluorescently लेबल कोशिकाओं को भी इस दृष्टिकोण 14 के साथ देखा जा सकता है.
महीने के लिए स्थिर है कि लगातार बढ़ते तकनीक विकास और कोशिका जीव के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इस सरल तकनीक विभिन्न प्रायोगिक परीक्षणों के बीच आसान तुलना की अनुमति, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. इसके अलावा, पंक्तियों में भ्रूण के संरेखण तत्काल बाद में विश्लेषण के लिए विशिष्ट भ्रूण की पहचान परमिट.
The authors have nothing to disclose.
Skidmore संकाय विकास अनुदान इस पांडुलिपि की तैयारी और प्रकाशन वित्त पोषित.
Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
Petroleum Jelly |
Any grocery store |
|
Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
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Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |