Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba

Published: November 5, 2013 doi: 10.3791/50717
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Geneva

Summary

Мы адаптировали набор протоколов для измерения активных форм кислорода (АФК), которые могут применяться в различных амебы и млекопитающих клеточных моделях для качественных и количественных исследований.

Abstract

Активные формы кислорода (ROS), включают различные реактивных и короткоживущих, кислородсодержащих молекул, которые динамически друг в друга или устранены либо каталитически или спонтанно. Из-за коротких из продолжительности жизни большей АФК и разнообразие их источников и субклеточных локализаций, полная картина может быть получена только путем тщательных измерений, используя комбинацию протоколов. Здесь мы представляем набор из трех различных протоколов, используя OxyBurst зеленый (OBG) покрытием бисер, или dihydroethidium (DHE) и Amplex Ultrared (AUR), чтобы контролировать качественно и количественно различные ROS в профессиональных фагоцитов, таких как Dictyostelium. Мы оптимизировали процедуры покрытия бисер и использовали бисер OBG-покрытием и живой микроскопии динамически визуализировать intraphagosomal ROS поколения на уровне одной клетки. Мы определили липополисахарида (ЛПС) из Е. палочка как мощный стимулятор для генерации АФК в Dictyostelium. Кроме того, мы гeveloped реального времени, средне-пропускной анализ с использованием DHE и ОЗМ количественно измерить внутриклеточный супероксид и внеклеточный H 2 O 2 производства, соответственно.

Introduction

Активные формы кислорода (ROS) участвуют в самых разнообразных биологических процессов, таких как иммунной защиты, сигнализации, развитие тканей и ответ на повреждение, а также гипертензии и рака. Хорошо изучены phagosomal НАДФН оксидазы техника посвящена быстрой генерации АФК, известный как окислительный взрыв, чтобы убить бактерии поступать в организм в нейтрофилов фагосом 1. Кроме того, утечка электронов как побочный продукт дыхательной цепи митохондрий Ранее считалось, что отвечает только за нерегулируемой источника АФК. Но в последнее время, он был идентифицирован как важного механизма содействия intraphagosomal убийства бактерий в макрофагах мыши 2. В последние годы социальная амеба, Dictyostelium, стала мощным и популярная модель для изучения клеток внутренние механизмы врожденного иммунного ответа. Действительно, Dictyostelium и человека фагоциты поделиться удивительно высокий уровень сохранения в молекулег механизмы, ответственные за бактерии чувствуя, поглощения и уничтожения 3,4. В гомологи белков и ферментов, связанных с производством или ROS детоксикации, такие как NADPH оксидазы, каталазы, супероксиддисмутаза, можно найти в обоих человеческих и Dictyostelium. Как наиболее изученного амебы, Dictyostelium представлены несколько уникальных преимуществ по сравнению млекопитающих модельной системы. Они растут при комнатной температуре без необходимости CO 2, с временем удвоения 8-10 часов. Они могут быть легко сохранены как прилипшие или суспензионных культур. Кроме того, благодаря своей полностью секвенировали и аннотированный гаплоидный геном, и в легкой генетических манипуляций, Dictyostelium стал очень привлекательным экспериментальная модель организм.

В предыдущих исследованиях, различные хлорированные и фторированные производные флуоресцеина (известных под общим названием OxyBurst Грин, OBG), которые излучают флуоресценции после окисления АФК, были использованы в качестве репортера АФК. Сотовый проникающий Предполагаемоеerified производные используются для измерения цитоплазматический ROS, в то время как декстран-или-белком производные клеток-impermeant используются для измерения внеклеточной ROS. В частности, бусы OBG BSA покрытием уже используется для обнаружения phagosomal производство АФК в клетках млекопитающих 5. Однако читатель подход микропланшет может дать только усредненную поколения РОС кривой от популяции клеток. С помощью настоящего протокола, с помощью Dictyostelium, профессиональный фагоцитов и оптимизированные условия эксперимента, получаем стабильную и эффективную фагоцитоз без сопряжения любой опсонин на шарики. ДНЕ был использован в различных модельных системах, таких как нейтрофилы и макрофаги млекопитающих, для обнаружения АФК 6-9. Между тем, есть некоторые разногласия по поводу специфичности и чувствительности метода 8,10. В качестве улучшенной версии Amplex красный, интенсивности флуоресценции AUR меньше чувствительны к рН, что делает его более подходящим для измеренияРОС в nonneutral или слабокислотных кругах. AUR был недавно применен в нескольких млекопитающих систем 11,12, но его использование в nonmammalian моделей, которые довольно часто требуют слабо кислой среде роста, не сообщалось еще. Кроме того, нет опубликован протокол количественно и динамично измерить АФК и локализацию в социальной амебы Dictyostelium.

Целью представленной набором протоколов, чтобы обеспечить легкий и универсальное решение для мониторинга различных АФК и их локализацию, а в дальнейшем дать понимание РОС-связанных клеточных механизмов. Для анализа OBG, мы использовали живую микроскопии для наблюдения за всем процессом производства phagosomal ROS После поглощения OBG покрытием бисера Dictyostelium клеток, и при условии, новый подход к изучению механизма intraphagosomal убийства бактерий. Мы оптимизировали среднего пропускной DHE и AUR анализы в Dictyostelium, для измерения внутриклеточного СуперОксIDE и внеклеточный H 2 O 2 производство, соответственно, с помощью LPS в качестве мощного стимулятора ROS. Обратите внимание, что ЛПС Недавно было показано, увеличить бактерицидную активность Dictyostelium к фагоцитированы бактерий 13. Кроме того, лечение с DEDTC и каталазы явно подтвердили, что эти два метода специально измерять различные типы и субклеточных локализаций АФК в Dictyostelium. Наконец, анализ OBG могут быть адаптированы к любой клейкого фагоцитарной клетки, путем дальнейшего opsonizing шарики с лигандов рецепторов фагоцитирующих клеток животных. В принципе, DHE и AUR анализы также могут быть доработаны для измерений в любой приверженец или неадгезивных клетки при соответствующих условиях эксперимента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Визуализация и качественные Измерение продукции АФК в фагосом

Шарики OBG покрытием должны быть подготовлены заранее. Процедуры покрытия бисер и агар техника наложения адаптированы из опубликованных ссылок 5,14.

  1. Добавьте 1 мл суспензии 3,0 мкм карбоксилированных бисером кремнезема (около 1,8 х 10 9 бусы) в 1,5 мл трубки, мыть шарики 3x 1 мл PBS быстрым спином и встряхивания.
  2. Ресуспендируют бусины в 1 мл PBS, содержащего 25 мг / мл цианамид (чтобы активировать карбоксилированные шарики кремнезема ковалентно связываться prelabeled BSA), инкубировать на колесе в течение 15 мин.
  3. Wash 3x 1 мл буфера для связывания (0,1 М натрий-боратного, рН 8,0) путем быстрого вращения (центрифуги на полной скорости в верхней части таблицы мини-центрифуге в течение 5 сек или, альтернативно, центрифуге при 2000 х г в течение 1 мин в настольной центрифуге) и встряхиванием, чтобы удалить лишнюю цианамида.
  4. Смешайте промытых бусы с 500 мкл сoupling буфер, содержащий 1 мг OxyBurst Грин (OBG) H2HFF (дигидро-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, заполнить трубу с азотом из стандартного газового можете до укупорки, и инкубировать на колесе в течение 14 часов (в течение ночи) при комнатной температуре в темноте.
  5. Промыть шарики 2x 1 мл закалки буфера (250 мМ глицин в PBS) для удаления непрореагировавшего OBG и дважды буфера для связывания для удаления буфера закалки быстрым спином и вортексе.
  6. Добавьте 1 мл буфера для связывания, содержащие 50 мкг Alexa Fluor 594 сукцинимидиловым эфиром к сопряженным с БСА. Заполните трубку азотом до укупорки, и инкубируют на колесе в течение 1,5 ч при комнатной температуре в темноте.
  7. Вымойте бисером 3x 1 мл закалки буфер быстрого спина и встряхивая, чтобы остановить реакцию, затем промыть шарики 3x 1 мл PBS быстрым спином и встряхивания.
  8. Наконец, ресуспендируют бисером в 1 мл PBS с 2 мкл 10% вес / объем азида для долговременного хранения. Измерьте concentratioн из бисера в суспензии с гемоцитометре (как правило, около 1-2 х 10 9 бисер / мл), заполнить трубу азотом до укупорки, и хранить при температуре 4 ° С в темноте.
  9. Эффективность покрытие флуоресцеина OBG может быть проверена путем проверки спектр излучения с использованием возбуждения при 500 нм. Когда окисляется H 2 O 2 в присутствии пероксидазы хрена (HRP), интенсивность флуоресценции окисленных шариков, при пика эмиссии (538 нм), составляет 11-12x выше, чем у неокисленных шариков с покрытием.
  10. Урожай растет в геометрической прогрессии Dictyostelium клетки от блюдо 10 см Петри, плиты различной плотности клеток на 3 см чашки с оптически прозрачного пластика или стеклянным дном, и выращивать их на ночь. Отберите блюда, которые около 80% сливной для эксперимента. Подробный протокол для культивирования Dictyostelium клетки была опубликована 15.
  11. Замените культуральной среды с LoFlo среды (LF среда), инкубировать2 часа до эксперимента в целях снижения внеклеточный и intraendosomal аутофлюоресценция в HL5C культуральной среде.
  12. Параллельно растопите 10 мл 1,5% Bacto агара в LF среды, залить агар на плоскую поверхность (например стеклянной пластины 10 см х 10 см), с тем, чтобы сформировать слой агара толщиной около 1 мм, ждать 10-15 мин затвердеть. Разрежьте агар слой в 2 см х 2 см площадей и место в LF среды для дальнейшего использования.
  13. Между тем, подготовить вращающимся диском или широкий поле микроскопа, установить температуру окружающей камере при 22 ° С и настройки для этого эксперимента. (См. дополнительные комментарии в дискуссии).
  14. После 2 ч инкубации аспирации среды из LF 3-см чашку, но клеточный монослой должны еще быть покрыта тонкой пленкой среды. Развести шарики, покрытые 1,5 х 10 7 бисер / мл и добавляют 10 мкл на клеточном слое.
  15. Возьмите один квадратный агар лист, процедить лишнюю жидкость, но держать влажной. Осторожно положите йе агар квадрат в верхней части слоя клеток. Не перемещайте агар квадрат, когда он лежит на клетках. Агара используется для увеличения контакта между бисером и клеток, тем самым улучшая усвоение, и это также немного сжимает клетки, сохраняя их лучше в фокальной плоскости объектива.
  16. Поместите крышку на блюдо, положите его на столике микроскопа, и автоматически принимать фотографии в красной, зеленой и фазовых каналов каждый 1 мин в течение 2 часов или больше.
  17. Выберите и сосредоточиться на клеточных событий, которые содержат весь процесс фагоцитоза. Слияние оптимизированные 3 канала и собрать фотографии в фильм с помощью профессионального программного обеспечения для обработки изображений. Количественная интенсивность флуоресценции каждого выбранного бисером в красных и зеленых каналов, и отношение зеленый / красный будет отражать динамичный phagosomal АФК клеток.

2. Количественный и среднего пропускная Измерение внутриклеточного супероксид производства

  1. Сбор Oпе 80% сливной блюдо Dictyostelium в 10 мл HL5C среды. Центрифуга Dictyostelium клетки в 850 мкг в течение 5 мин, внимательно и полностью аспирации избыточного среды. Ресуспендируют клеток в SS6.4 буфера [0.12 М сорбита в Соренсен буфера (14.69 мМ KH 2 PO 4 и 6,27 мМ Na 2 HPO 4), рН 6,4], подсчета клеток и разбавляют до конечной плотности 6 х 10 6 клеток / мл (см. дополнительные комментарии в дискуссии).
  2. Добавить 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку белой непрозрачной 96-луночный планшет (см. дополнительные комментарии в дискуссии).
  3. Развести DHE акции (30 мм в ДМСО) в 500 раз с SS6.4, пипетки 50 мкл разбавленного DHE в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки при необходимости. Конечная концентрация ДНЕ 30 мкМ. Реакция начинается сразу.
  4. Стимулы или ингибиторы могут быть добавлены в этот момент, а также на другие моменты времени в соответствии с конкретными потребностями.
  5. Используйте пункт "верхнюю чтение & # END34; режим флуоресцентного микропланшет-ридера, с возбуждения флуоресценции / эмиссии в 522 нм nm/605, читать каждые 2 мин в течение 1 ч, средний дрожания 5 сек / мин, при 22 ° С

3. Количественный и пропускная способность измерения Температура внеклеточной Н 2 О 2 Производство

  1. Выполните те же действия, как описано в 2.1 и 2.2.
  2. Подготовка разбавленный HRP, добавив 5 мкл HRP складе (100 ед / мл в дистиллированной воде) в 10 мл SS6.4, вихря или инвертировать трубку к хорошо перемешать и держать на льду для последующего использования. Разбавленный раствор HRP находится на 0,05 Ед / мл.
  3. Подготовьте AUR реакционной смеси путем смешивания запас AUR (10 мМ в ДМСО AUR) и разбавленный раствор HRP в SS6.4 буфера в конечной концентрации 6,25 мкМ и 0,005 ед / мл, соответственно. Например, для приготовления реакционной смеси в течение 40 реакций, смешать 1600 мкл SS6.4 с 400 мкл разбавленного HRP и 2,5 мкл исходного раствора AUR.
  4. Добавить 50 мкл AUR смесиры в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки, если это необходимо. Теперь начала реакции.
  5. Стимулы или ингибиторы могут быть добавлены в этот момент, а также на другие моменты времени в соответствии с конкретными потребностями.
  6. Используйте точку режим конец "сверху прочтения» флуоресцентным микро-ридере, с возбуждения флуоресценции / эмиссии при 530 нм nm/590, читать каждые 2 мин в течение 1 ч, средний встряски 5 сек / мин, при 22 ° С

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Генерация АФК в фагосом могут быть визуализированы качественно и динамично с помощью микроскопа (File S1). Красной флуоресценции, испускаемый Alexa Fluor 594 является рН от регистра и остается постоянным в среде phagosomal, в то время как окисление OBG увеличивает его флуоресценцию в зеленом канале. Спектры излучения в пробирке окисленных и неокисленных шарики, покрытые OBG сравниваются на фиг.1В, показывая значительное увеличение интенсивности после окисления. Для облегчения визуализации живых событий, два канала будут объединены и в результате цвет меняется с красного на оранжевый во время фагоцитоза дикого типа AX2 клеток в течение 1 мин поглощения. Увеличение зеленой флуоресценции указывает поколение ROS возможно непосредственно в фагосомы. С помощью планшетного, средне-пропускной количественное измерение внутриклеточного супероксида и внеклеточный H 2 O 2 производства приведены в FIGUповторно 2C и рис 3B, соответственно. Базальной РОС производство из AX2 клеток, возможно, от регулярной оксидо-восстановительного метаболизма, может быть измерено. Когда клетки стимулируются с ЛПС, сигналы для продукции АФК значительно увеличены в обоих анализах. Кроме того, в DHE анализа, снижение синей флуоресценции (dihydroethidium) и увеличение красной флуоресценции (этидий) сигналы обратно пропорциональна, как и ожидалось. Локализация продукции АФК измеряется как DHE и AUR анализов подтверждаются на рисунке 2D и фиг.3С, соответственно. Добавление DEDTC (мембрана проникающий супероксиддисмутазы (СОД) ингибитор), 16 увеличили сигнал ДНЕ и снижение сигнала AUR в зависимости от дозы, что указывает на DEDTC вызвало накопление СОД подложки супероксида и истощение SOD продукта H 2 O 2 ожидается в результате реакции, показанной на фиг.2А.lternatively, добавив каталазу (мембрана impermeant H 2 O 2 утоления), внутриклеточный супероксид сигнал от DHE анализа была не влияет, в то время как внеклеточный Н 2 О 2 сигнал от AUR анализа снизилась в зависимости от дозы.

Рисунок 1
Рисунок 1. Принцип и использование OBG (OxyBurst Зеленый) анализа. A) OBG флуоресцеин и Alexa Fluor 594 ковалентно присоединен к поверхности 3 мкм кремнезема шариков через BSA. Флуоресценции от OBG флуоресцеина указывает окисление по АФК, в то время как сигнал от Alexa Fluor 594 помогает локализовать бусы и служит для управления флуоресценции количественного. B) В тесте пробирке для эффективности покрытия. H 2 O 2 и HRP используются для окисления покрытые гранулы в пробирке. Под возбужденныхAtion при 500 нм, окисленные шарики показывают значительное пик излучения на 538 нм по сравнению с неокисленных бисером, с соотношением интенсивностей, по крайней мере 11-12 раз.

Рисунок 2
Рисунок 2. Принцип и использование DHE (Dihydroethedium) анализа. А) Резюме биохимических реакций, связанных с DHE и AUR анализов. Б) в цитозоле, мембрана проникающего DHE имеет возбуждения и эмиссии пики при 370/420 нм соответственно. В результате окисления супероксида, этидий способен интеркаляции в ядерной и митохондриальной ДНК и переместился возбуждения и эмиссии пики при 522/605 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции этидия соответствует количества супероксида внутри клеток. С) представитель эксперимент показывает, что при стимуляции ЛПС, динамический суперпроизводство оксид от ах2 клеток значительно выше, чем базального уровня от нестимулированных клеток и ах2 фоне реакции в буфере. Уменьшение синей флуоресценции и увеличение красной флуоресценции обратно пропорциональна, как ожидалось. D) При обработке различных концентраций DEDTC (мембрана проникающий супероксид дисмутаза ингибитора), наклона (RFU / мин) увеличивается производственных этидий от дозы зависимым образом, в то время как лечение каталазы (мембрана impermeant H 2 O 2 утоления) не влияет супероксид производство. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. Принцип и использование AUR (Amplex Ultrared) анализа. А) Мембрана impermeant AUR окн быть окислены в его флуоресцентного резоруфином форме, AUR-бык, Н 2 О 2 в присутствии пероксидазы (возбуждения и излучения пики при 530 и 590 нм, соответственно). Интенсивность флуоресценции AUR-Ox соответствует сумме H 2 O 2 произведено за пределами клетки. Б) представитель эксперимент показывает, что при стимуляции ЛПС, динамический H 2 O 2 из ах2 производство клеток значительно выше, чем базальных уровень от нестимулированных AX2 клеток, а фон реакция. C) При обработке различных концентраций DEDTC или каталазы, склона (РФС / мин) ОЗМ-восстановительных производственных уменьшается в зависимости от дозы, за счет ингибирования H 2 O 2 производство из внутриклеточного супероксида и истощения внеклеточного H 2 O 2, соответственно. Нажмите здесь, чтобы увеличитьфигура.

Файл S1. Фильм динамического производства phagosomal АФК в Dictyostelium клеток. Покадровой фильм был записан в течение 40 мин живой микроскопии, используя увеличение 60X. Во время первой минуты после поглощением фагоцитоза, флуоресценция OBG флуоресцеина покрытием бисера изменен с красного до ярко-оранжевого, указывая, что АФК, вероятно, были произведены непосредственно внутри фагосом. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По сравнению с ранее описанными методами, анализ OBG динамически визуализирует процесс phagosomal ROS поколения на уровне одной клетки, вместо измерения среднего сигнала ROS из популяции клеток. Такие методы населения-усреднения, как правило, чтобы скрыть важную информацию, вызванного несинхронного фагоцитоза. Мы успешно адаптировались DHE и AUR анализы, чтобы Dictyostelium и оптимизированы протоколы. Самое главное, мы определили типы и субклеточных локализаций АФК измеренные этими двумя анализов. Взятые вместе, все множество протоколов измерений АФК для Dictyostelium представляет собой практичный и мощную систему для изучения РОС-связанные клеточные механизмы, такие как врожденного иммунитета, дифференциации клеток и внутриклеточной сигнализации.

Для анализа OBG, подготовка покрытых гранул имеет решающее значение для успеха эксперимента. В связи со сложностью опосредованной рецепторами фагоцитарной поглощения в млекопитающихн клеток, частицы должны быть опсонизированным (например, с IgGs), чтобы вызвать прием пищи. Низкая эффективность поглощения в клетках млекопитающих резко ограничивает визуализацию отдельных событий поколения phagosomal АФК. Скорость фагоцитоза в Dicytostelium было отмечено в 10-20 раз выше, чем в макрофаг 17, и с настоящим протоколом мы получили надежную и эффективную фагоцитоз без конъюгации любой опсонин на шарики. Это не только упрощает процедуру шарик-покрытия, но снижает риск окисления красителя флуоресцеина OBG во время манипуляций. Так как флуоресцеин OBG можно окислить света и кислорода, реагент должен быть защищен от воздействия окружающего света и воздуха как можно больше (например, использовать алюминиевую фольгу, чтобы покрыть трубу, и заполнить трубку азотом или другим инертным газом), особенно для длительного хранения.

Для живого изображения, клетки могут быть покрыты на различных блюд с оптически сLear днища. В то время как Dictyostelium придерживается немного лучше пластика, большинство клеток млекопитающих (см. ниже) придерживаться одинаково хорошо к стеклу. Еще одним важным шагом для оптимальной визуализации является для инкубации Dictyostelium клеток в LF среды (низкой фоновой флуоресценции) в течение не менее 2 часов, прежде чем приступить к шагам визуализации. Поскольку фон зеленая флуоресценция сигнал культуральной среды (HL5C) должна быть истощены от своих эндосомных отсеков, чтобы избежать помех с сигналом, генерируемым из окисленных бисером покрытием. Мы также настоятельно рекомендуем выполнять по крайней мере один пилотный эксперимент по оптимизации настройки микроскопа (например, интенсивности лазер, времени экспозиции, и т.д.), особенно для зеленого канала. Шарики постоянно излучают сильную красную флуоресценцию в течение всего эксперимента, но зеленая флуоресценция возрастает при взаимодействии с АФК сразу после фагоцитоза и плато в 5-10 мин. Поэтому лучше, чтобы настроить параметры для гReen канал ближе к концу эксперимента, когда зеленая флуоресценция от большинства шариков может быть полностью визуализирован. Как только настройки оптимизированы, сохранить его для будущих экспериментов для достижения воспроизводимых результатов.

В ходе анализа OBG, здоровые клетки должны продолжить свою случайную моторику, а не сгонять. В противном случае, это свидетельствует о повреждении клеток, которые могут быть вызваны либо сушки агара или чрезмерной интенсивности лазерного излучения. Поэтому держать достаточное количество жидкости на агара в течение всего срока всего эксперимента, а также сохранить интенсивность и экспозиции лазерного время как можно ниже.

В AUR и ДНЕ анализов, наклон кривых флуоресценции чтения показывает зависимое от дозы соотношение к количеству клеток, используемых в каждую лунку в пределах определенного диапазона. Для того чтобы достичь наиболее воспроизводимые результаты, необходимо использовать одинаковое число клеток для каждого условия эксперимента. Кроме того,из-за различий в размерах клеток между различными типами клеток, что настоятельно рекомендуется, что в пилотных экспериментах различные разведения протестированы, чтобы получить клеточный монослой после прикрепления на дне скважины. Для Dictyostelium AX2 клеток, 3 х 10 5 клеток образуют монослой, и это плотность клеток также относится ко многим другим дикого типа и мутантных штаммов Dictyostelium. Для того чтобы получить точные числа клеток, то лучше рассчитывать после центрифугирования, а не до, так как центрифугирование и гранулы шаги ресуспендирования может вызвать некоторую потерю клеток. Мы используем автоматизированную счетчика клеток рассчитывать после ресуспендированием осадок клеток (лучше всего работает с клеточных плотностях выше 6 х 10 6 клеток / мл), то именно разбавить образцы клетки до 6 х 10 6 клеток / мл.

Для DHE и AUR анализов, низкие сигналы может быть связано с использованием неоптимальных 96-луночных, и, таким образом, мы рекомендуем использовать белые непрозрачные 96-луночных планшетов. По сравнению с черным или прозрачнойЛОР пластины, захваченное флуоресцентный сигнал усиливается при отражении на белой поверхности, что значительно увеличивает отношение сигнал-шум. Недостатком белых непрозрачных пластин, иногда, сильные флуоресцентные сигналы могут просочиться в соседних скважин. Тем не менее, с помощью 100 мкл реакционного объема и описанного концентрации зонда, мы не обнаружили случайных утечек сигнал в обоих DHE и AUR анализов. Кроме того, мы рекомендуем выполнять некоторые пилотные эксперименты по оптимизации чувствительности флуоресценции ридере. Принимая планшет-ридера SynergyMX в качестве примера, чувствительность 100 и 70 работают лучше всего для DHE и AUR анализа, соответственно. Кроме того, важно следить за конкретный спектров возбуждения и испускания в условиях эксперимента, с клетками. Действительно, мы наблюдаем сдвиг максимума излучения для ОЗМ к 590 нм, по сравнению с 581 нм, упомянутых производителем. Наконец, мы получили несколько лучшие результаты, возбуждая при 530 нм вместо 568нм предложил заводом-изготовителем.

По сравнению с исходного раствора AUR, раствор DHE гораздо более склонны к окислению, даже когда в защищенном от света при температуре -20 ° С. Таким образом, лучше использовать запас DHE в течение 10 дней после растворения из порошка. Если цвет исходного раствора меняется от серого до фиолетового или розового, снимите его и подготовить только что из порошка 18.

В анализе AUR, как AUR и HRP может быть рассмотрен макропиноцитозом. Поэтому флуоресцентный сигнал в результате окисления Н 2 О 2 может также частично генерироваться внутри macropinosomes. Однако, так как AUR и HPR не проникают клеточные мембраны, сигнал измеряется внутри macropinosomes с помощью анализа AUR-прежнему топологически эквивалентна внеклеточного сигнала, в отличие от сигнала, генерируемого в цитозоле.

На основании серии предварительных тестов для обоих DHE и AUR анализов,представляется важным использовать простой буфер, который не содержит глюкозу или другие биологические компоненты носителя, потому что они сильно мешают обоих анализах и привести к высокой артефактного флуоресцентного сигнала. Таким образом, мы используем фосфатный буфер Соренсена дополненный 0,12 М сорбитол, в неперевариваемые осмолита используется для установки осмолярность подобный к культуральной среде Dictyostelium 19. Обратите внимание, что высокое содержание соли изоосмотическими буферов, используемых для клеток млекопитающих, таких как PBS, наносит ущерб Dictyostelium.

Протоколы, представленные здесь, не можем измерить все возможные ROS, например гипохлоритом, гидроксильные радикалы и синглетный кислород, и их субклеточных локализаций. Более полную картину поколения АФК по-прежнему ограничивается наличием и развитием специфических зондов.

Этот набор протоколов могут быть легко адаптированы к другим клеткам, в том числе фагоцитов млекопитающих, со следующим ModificAtion. Например, в OBG анализа среду без FCS и фенолового красного может быть использован для получения низкой фоновой флуоресценции. В ДНЕ и AUR анализов, PBS буфера может быть использован вместо SS6.4, и количество клеток высевали в каждую лунку для получения сливающийся слой может быть адаптирована путем проб и ошибок, в соответствии с их размером. Концентрации HRP, ОЗМ и DHE также могут быть оптимизированы в пилотных экспериментах для достижения наиболее чувствительные результаты. Тем не менее, возможные побочные эффекты ДМСО должны быть проверены при использовании повышенные концентрации ОЗМ и / или DHE реагентов. Мы протестировали DHE и AUR успешно анализах с другим простейшим, Acanthamoeba castellanii и с мыши BV2 микроглии клеточной линии. Кроме того, ДНЕ и AUR анализы также могут быть использованы для измерения поколение ROS во время хозяин-патоген взаимодействий, например, во время инфекции Dictyostelium или Acanthamoeba микобактериями Маринум.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарны докторами Карл-Хайнц Краузе и Винсент Jaquet за помощью и советом, чтобы настроить эти протоколы, а также поблагодарить Кристоф Бауэр и Джером Bosset от Bioimaging платформы НКРС и д-р Навин Gopaldass за техническую поддержку. Исследование опирается на ProDoc гранта Швейцарского национального научного фонда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA Invitrogen O-13291
Alexa Fluor 594 Invitrogen A-20004
Carboxylated silica beads Kisker Biotech PSi-3.0COOH
HL5C medium ForMedium HLC0102
LoFlo medium ForMedium LF1001
Bacto agar BD 204010
Dihydroethidium Sigma 37291-25MG
Amplex UltraRed Invitrogen A36006
Horseradish peroxidase Roche 10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC) Sigma D3506-100G
Catalase Sigma C9322-1G
Cyanamide Sigma 187364-25G
Lipopolysaccharides Sigma L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high ibidi 81156 Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm MatTek corporation P35G-1.5-14-C Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter Merck Millipore PHCC00000
White 96 well plate Nunc 236108
Centrifuge SORVALL Legend RT
Microplate reader BioTek Synergy Mx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
  2. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
  3. Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. dictyBase and the Dicty Stock Center. Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).
  4. Basu, S., et al. dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species. Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).
  5. VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst. Traffic. 10, 372-378 (2009).
  6. Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals. Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).
  7. Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods. Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).
  8. Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays. Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).
  9. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay. Ann. Biomed. Eng. , (2012).
  10. Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles. J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).
  11. Guimaraes-Ferreira, L., et al. Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).
  12. Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
  13. Walk, A., et al. Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells. Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).
  14. Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).
  15. Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).
  17. Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. Methods in Molecular Biology. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).
  18. Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species. Proto. Exch. , (2008).
  19. Neuhaus, E. M., Soldati, T. A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes. J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).

Tags

Микробиология выпуск 81 биологии (в целом) Биохимия активные формы кислорода супероксид перекись водорода OxyBurst Зеленый бусы карбоксилированных Dihydroethidium Amplex Ultrared фагоцитоз,
Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Soldati, T. Detecting,… More

Zhang, X., Soldati, T. Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System. J. Vis. Exp. (81), e50717, doi:10.3791/50717 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter