Summary
Vi tilpasset et sett av protokoller for måling av reaktive oksygenforbindelser (ROS) som kan brukes i ulike Amoeba og pattedyr cellulære modeller for kvalitative og kvantitative studier.
Abstract
Reaktive oksygen arter (ROS) består av en rekke reaktive og kortlivede, oksygenholdige molekyler, som er dynamisk interconverted eller elimineres enten katalytisk eller spontant. På grunn av den korte liv spenner fra de fleste ROS og mangfoldet av sine kilder og subcellulære lokaliseringer, kan et fullstendig bilde oppnås bare ved forsiktig målinger ved hjelp av en kombinasjon av protokoller. Her presenterer vi et sett med tre forskjellige protokoller ved hjelp OxyBurst Grønn (OBG)-belagt perler, eller dihydroethidium (DHE) og Amplex UltraRed (AUR), for å overvåke kvalitativt og kvantitativt ulike ROS i profesjonelle fagocytter som Dictyostelium. Vi optimalisert perler belegningsprosedyrer og brukte OBG-belagte perler og live mikros å dynamisk visual intraphagosomal ROS generasjon på celle-nivå. Vi identifiserte lipopolysakkarid (LPS) fra E. coli som en potent stimulator for ROS generasjon i Dictyostelium. I tillegg vi developed sanntid, medium-throughput analyser ved hjelp DHE og AUR å kvantitativt måle intracellulær superoksid og ekstracellulære H 2 O 2-produksjon, hhv.
Introduction
Reaktive oksygenarter (ROS) er involvert i en rekke biologiske prosesser som vertsforsvar, signalering, vev utvikling og respons på skade, så vel som hypertensjon og kreft. Den godt studert phagosomal NADPH oksidase maskiner er dedikert til rask ROS generasjon, kjent som den oksidative burst, for å drepe bakterier inntatt i nøytrofile 'phagosomes en. I tillegg ble lekkasje av elektroner som et biprodukt av den mitokondrielle respiratoriske kjeden tidligere antatt å være ansvarlig for bare en uregulert kilde ROS. Men i det siste, og ble identifisert som en viktig mekanisme for å bidra til intraphagosomal dreping av bakterier i musemakrofager 2. I de senere årene har det sosiale amøbe, Dictyostelium, bli en mektig og populær modell for å studere celle iboende mekanismer i det medfødte immunrespons. Faktisk Dictyostelium og humane fagocytter har en overraskende høy grad av konservering i molekylr machineries ansvarlige for bakterier sensing, engulfment og drepe 3,4. De homologer av proteiner og enzymer som er relatert til ROS eller avgiftning, slik som NADPH oksidase, catalases, superoxide Dismutases, kan finnes i human-og Dictyostelium. Som best studerte amøbe, presenterer Dictyostelium flere unike fordeler fremfor pattedyrmodellsystem. De vokser ved romtemperatur uten behov for CO2, med en dobling tid på 8-10 timer. De kan lett bli holdt som tilhenger eller suspensjonskulturer. I tillegg, takket være deres fullt sekvensert og annotert haploid genom, og til enkel genetisk manipulasjon, har Dictyostelium blitt en svært attraktiv eksperimentell modell organisme.
I tidligere studier, diverse klorerte og fluorerte derivater av fluorescein (kollektivt kjent som OxyBurst Green, OBG) som avgir fluorescens etter oksidasjon av ROS, har blitt brukt som en ROS reporter. Cell-permeant esterified derivater benyttes til å måle cytoplasmatisk ROS, mens celle-impermeant dekstran-eller protein-koblede derivater benyttes til å måle ekstracellulære ROS. Spesielt har OBG BSA-belagte perlene som allerede er blitt brukt for å detektere phagosomal ROS-produksjon i pattedyrceller 5. Imidlertid kan det mikroplateleser baserte tilnærmingen bare gi et gjennomsnitt ROS generasjon kurve fra en populasjon av celler. Med dagens protokoll, ved hjelp av Dictyostelium, en profesjonell phagocyte, og optimaliserte eksperimentelle forhold, får vi stabil og effektiv fagocytose uten conjugating noen opsonin på perlene. DHE har vært brukt i forskjellige modellsystemer, slik som pattedyr nøytrofiler og makrofager, for å detektere ROS produksjons 6-9. I mellomtiden er det noen controversies over spesifisitet og sensitivitet for metoden 8,10. Som en forbedret versjon av Amplex Red, fluorescensintensiteten av AUR er mindre følsom overfor pH, noe som gjør det mer egnet til å måleROS i nonneutral eller svakt sure miljøer. AUR har nylig blitt brukt i flere pattedyr systemer 11,12, men bruken i nonmammalian modeller, som ganske ofte krever svakt syrlig vekstmedier, har ikke blitt rapportert ennå. I tillegg er det ingen publiserte protokoll til kvantitativt og dynamisk måle ROS produksjon og lokalisering i det sosiale amøbe Dictyostelium.
Målet med den presenterte sett av protokoller er å gi en enkel og allsidig løsning for å overvåke ulike ROS og deres lokalisering, og videre gi innsikt i ROS-relaterte cellulære mekanismene. For OBG analysen, brukte vi leve mikros å overvåke hele prosessen med phagosomal ROS generasjon etter opptak av OBG-belagte perler av Dictyostelium celler, og gitt en ny tilnærming for å studere mekanismen av intraphagosomal drap av bakterier. Vi har optimalisert medium gjennomstrømming DHE og AUR-analyser i Dictyostelium, for å måle intracellulær superoxide og ekstracellulære H 2 O 2-produksjon, henholdsvis, ved hjelp av LPS som en potent stimulator ROS. Legg merke til at LPS ble nylig vist å øke den baktericide aktivitet av Dictyostelium mot phagocytosed bakterier 13. I tillegg behandling med DEDTC og katalase eksplisitt bekreftet at disse to metodene spesifikt måle ulike typer og subcellulære lokaliseringer av ROS i Dictyostelium. Endelig kan OBG assay tilpasses enhver vedheftende fagocytisk celle, ved ytterligere opsonizing perlene med ligander for fagocytiske reseptorer av dyreceller. I prinsippet kan de DHE og AUR-analyser også være finjustert for målinger i alle tilhenger eller ikke-festede celle under passende eksperimentelle forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Visualisering og Kvalitativ måling av ROS Produksjonen i phagosomes
De OBG-belagte perler bør være forberedt på forhånd. Perlene belegningsprosedyrer og agar overlay teknikk er tilpasset fra publiserte referanser 5,14.
- Tilsett 1 ml suspensjon av 3,0 mikrometer karboksylerte silika perler (ca. 1,8 x 10 9 perler) til et 1,5 ml rør, vaske perlene 3x med 1 ml PBS ved hurtigsentrifugering og virvling.
- Resuspender perlene i 1 ml PBS inneholdende 25 mg / ml cyanamid (for å aktivere de karboksylerte silikaperler til kovalent binding prelabeled BSA), inkuberes på et hjul i 15 min.
- Vask 3 ganger med 1 ml koblingsbuffer (0,1 M natriumborat, pH 8,0) ved hurtigsentrifugering (sentrifuger ved full hastighet i en bordplate mini sentrifuger i 5 sek, eller alternativt sentrifuger ved 2000 xg i 1 min i en bordsentrifuge) og virvling å fjerne overflødig cyanamid.
- Bland de vasket perler med 500 mL av coupling buffer som inneholder en mg OxyBurst Grønn (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, fyll røret med nitrogengass fra en standard gass-kan før tildekking, og inkuberes på et hjul for 14 timer (over natten) ved RT i mørket.
- Vask kulene 2x med 1 ml av slukke-buffer (250 mM glycin i PBS) for å fjerne uomsatt OBG, og to ganger med koblingsbuffer for å fjerne quenching buffer ved hurtigsentrifugering og virvling.
- Tilsett 1 ml koblingsbuffer inneholdende 50 ug av fluor Alexa 594 succinimidyl-ester for å konjugere til BSA. Fyll røret med nitrogen før capping, og inkuberes på et hjul i 1,5 time ved romtemperatur i mørket.
- Vask kulene 3x med 1 ml bråkjøling buffer ved hurtigsentrifugering og virvling for å stoppe reaksjonen, og deretter å vaske perlene 3x med 1 ml PBS ved hurtigsentrifugering og virvling.
- Endelig resuspendere kulene i 1 ml PBS med 2 pl 10% w / v azid for langtidslagring. Mål-konsentrasjonenn av perler i suspensjonen med en hemocytometer (vanligvis rundt 1-2 x 10 9 perler / ml), fyll røret med nitrogen før tildekking, og oppbevar ved 4 ° C i mørket.
- Belegget effektiviteten av OBG fluorescein kan testes ved å kontrollere emisjonsspektrum ved hjelp av eksitasjon ved 500 nm. Når oksidert ved H 2 O 2 i nærvær av pepperrot-peroxydase (HRP), fluorescensintensiteten av oksiderte perler, ved avgivelses topp (538 nm), er 11-12x høyere enn for nonoxidized belagte perler.
- Harvest-eksponentielt voksende Dictyostelium celler fra en 10 cm petriskål, plate ulike tettheter av celler på 3 cm retter med en optisk klar plast eller glassbunn, og vokse dem over natten. Velg de retter som er omtrent 80% konfluent for forsøket. En detaljert protokoll for å dyrke Dictyostelium celler har blitt publisert 15.
- Erstatte kultur medium med LoFlo medium (LF medium), inkuberes i2 time før forsøket for å minske den ekstracellulære og intraendosomal autofluorescens av HL5C kulturmedium.
- Parallelt smelte 10 ml 1,5% Bacto agar i LF medium, helles agaren på en flat overflate (dvs. en glassplate på 10 cm x 10 cm) for å danne en agar lag ca 1 mm tykt, vent i 10 til 15 min å stivne. Skjær agar lag i 2 cm x 2 cm torg og plasser i LF medium for senere bruk.
- I mellomtiden forbereder spinning-disk eller bredt felt mikroskop, sett temperaturen på miljø kammer ved 22 ° C og justere innstillingene for dette eksperimentet. (Se ytterligere kommentarer i diskusjonen).
- Etter 2 timer med inkubering, suge LF medium fra 3 cm plate, men blir cellemonoskiktet bør fremdeles være dekket av en tynn film av medium. Fortynn de belagte perler til 1,5 x 10 7 perler / ml og tilsett 10 pl på cellelaget.
- Ta en firkantet agar ark, drenere overflødig væske, men beholde våt. Forsiktig satt the agar kvadratet på toppen av cellelaget. Ikke flytt agar firkantet når det ligger på cellene. Den agar overlegg brukes for å øke kontakten mellom perlene og celler, og dermed forbedre opptaket, og det er også lett komprimerer cellene, holde dem bedre i fokalplanet til objektivet.
- Sett lokket på fatet, legg det på mikroskopet scenen, og automatisk ta bilder i de røde, grønne og fase kanaler hver 1 min for 2 timer eller lenger.
- Velg og fokus på cellulære hendelser som inneholder hele prosessen med fagocytose. Flett de optimaliserte tre kanaler og sette sammen bildene til en film ved hjelp av profesjonell bildebehandling. Tall fluorescensintensiteter i hver utvalgte kuler i røde og grønne kanaler, og forholdet mellom grønn / rød vil reflektere den dynamiske phagosomal ROS produksjon av cellene.
2. Kvantitativ og Medium-throughput Måling av intracellulær superoksydproduksjon
- Samle one 80% konfluent rett av Dictyostelium i 10 ml HL5C medium. Sentrifuger Dictyostelium cellene ved 850 xg i 5 min, nøye og fullstendig aspirer overflødig medium. Suspender cellene i SS6.4 buffer [0,12 M sorbitol i Sorensen buffer (14.69 mM KH 2 PO 4 og 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], telle celler og fortynne til en endelig tetthet på 6 x 10 6 celler / ml (se flere kommentarer i diskusjonen).
- Tilsett 50 ul av cellesuspensjonen i hver brønn av en hvit ikke-transparent plate med 96 brønner (se bemerkninger i omtalen).
- Fortynne DHE lager (30 mM i DMSO) 500 ganger med SS6.4, pipette 50 mL av fortynnet DHE i hver brønn med flerkanalspipette om nødvendig. Den endelige konsentrasjonen av DHE er 30 pM. Reaksjonen starter straks.
- Stimuli eller hemmere kan legges på dette punktet, eller på andre tidspunkter i henhold til spesifikke behov.
- Bruk endepunktet "top lesing & #34; modus av en fluorescens mikroplateleser, med fluorescenseksitasjon / utslipp på 522 nm/605 nm, lese hver 2 min for en time, medium shake 5 sek / min, ved 22 ° C.
Tre. Kvantitativ og høy gjennomstrømning Måling av Ekstracellulær H 2 O 2 Produksjon
- Følg de samme trinnene som er beskrevet i 2.1 og 2.2.
- Forbered fortynnet HRP ved å tilsette 5 pl av HRP lager (100 U / ml i destillert vann) i 10 ml SS6.4, vortex eller invertere røret for å blande frisk og holde på is for senere bruk. Den fortynnet HRP-løsning ved 0,05 U / ml.
- Klargjør AUR reaksjonsblanding ved å blande AUR lager (10 mM AUR i DMSO) og fortynnet HRP-løsningen inn SS6.4 buffer til sluttkonsentrasjoner på 6,25 uM og 0,005 U / ml, respektivt. Som et eksempel, å fremstille reaksjons-blandingen i 40 reaksjoner, bland 1,600 mL av SS6.4 med 400 pl av fortynnet HRP og 2,5 mL av AUR stamløsning.
- Tilsett 50 pl av AUR mixture inn hver brønn med flerkanalspipette om nødvendig. Nå reaksjonen starter.
- Stimuli eller hemmere kan legges på dette punktet, eller på andre tidspunkter i henhold til spesifikke behov.
- Bruk endepunktet "top lesing"-modus av en fluorescens mikroplateleser, med fluorescenseksitasjon / utslipp på 530 nm/590 nm, lese hver 2 min for en time, medium shake 5 sek / min, ved 22 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generasjonen av ROS i phagosomes kan visualiseres kvalitativt og dynamisk ved mikroskopi (File S1). Den røde fluorescensen avgitt av Alexa fluor 594 er pH-ufølsomme og forblir konstant i phagosomal miljø, mens oksydasjon av OBG øker dens fluorescens i den grønne kanalen. Utslipps spektra av in vitro oksidert og nonoxidized OBG-belagte perler er sammenlignet i figur 1B, som viser en betydelig økning i intensitet etter oksidasjon. For å legge til rette for visualisering av live events, er de to kanalene slått sammen og de resulterende farge skifter fra rødt til oransje under fagocytose av villtype AX2 celler innenfor en min av opptak. Økningen i grønn fluorescens indikerer ROS generasjon muligens direkte i phagosome. Ved å bruke en mikroplateleser, medium-throughput kvantitativ måling av intracellulær og ekstracellulær superoksid H 2 O 2-produksjon er vist i Figure 2C og figur 3B, respektivt. Basal ROS produksjon fra AX2 celler, muligens fra vanlig oxido-reduktive stoffskifte, kan måles. Når cellene blir stimulert med LPS, blir signalene for ROS produksjonen signifikant økt i begge analysene. I tillegg, i DHE analysen, reduksjon av blå fluorescens (dihydroethidium) og økningen av rød fluorescens (Ethidium) signaler er negativt korrelert, som forventet. Lokalisering av ROS produksjonen målt ved både DHE og AUR analysene er bekreftet i figur 2D og Figur 3C, henholdsvis. Tilsetning av DEDTC (en membran permeant superoksid dismutase (SOD)-inhibitor) 16, økte DHE signalet og reduserte AUR-signalet på en doseavhengig måte, noe som indikerer at DEDTC forårsaket akkumuleringen av SOD substrat superoksid og uttømming av SOD produktet H to O to forventes fra reaksjonen vist i Figur 2A. Alternatively, ved tilsetning av katalase (en membran impermeant H 2 O 2 quencher), den intracellulære superoksyd-signalet fra DHE-analysen var ikke påvirket, mens den ekstracellulære H to O to signal fra AUR-analysen ble redusert på en doseavhengig måte.
Figur 1. Prinsipp og bruk av OBG (OxyBurst Grønn) analysen. A) OBG fluorescein og Alexa fluor 594 er kovalent bundet til overflaten av tre mikrometer silikaperler via BSA. Den fluorescensemisjonen fra OBG fluorescein indikerer oksidering av ROS, mens signalet fra fluor Alexa 594 bidrar til å lokalisere perlene og tjener som styring for fluorescens kvantifisering. B) In vitro-test for beleggeffektivitet. H to O to og HRP anvendes for å oksidere de belagte perler in vitro. Under spensjon ved 500 nm, de oksyderte perler viser en betydelig emisjonstopp ved 538 nm i forhold til det av nonoxidized perler, med en intensitetsforhold på minst 11 til 12 ganger.
Figur 2. Prinsipp og bruk av DHE (Dihydroethedium) assay. A) Sammendrag av de biokjemiske reaksjoner i forbindelse med DHE og AUR-analyser. B) i cytosol, har membranen permeant DHE eksitasjon og emisjon topper ved 370/420 nm, hhv. Som et resultat av oksydasjon av superoksid, er i stand til etidium intercalate i atom-og mitokondrisk DNA og har forskjøvet eksitasjon og emisjon topper ved 522/605 nm, hhv. Fluorescens-intensiteten av ethidium tilsvarer mengden av superoksydproduksjon inne i cellene. C) Et representativt eksperiment viser at når stimulert med LPS, den dynamiske superoksyd produksjon fra AX2 cellene er betydelig høyere enn den basale nivå fra nonstimulated AX2 celler, og på bakgrunn av reaksjonen i buffer. Reduksjonen på blå fluorescens og økningen av rød fluorescens er omvendt korrelert som forventet. D) Når behandlet med ulike konsentrasjoner av DEDTC (en membran permeant superoksid dismutase hemmer), skråningen (RFU / min) av Ethidium produksjonen øker i en dose- avhengig måte, mens behandling med katalase (en membran impermeant H 2 O 2 drikk) ikke påvirker superoksydproduksjon. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Prinsipp og bruk av AUR (Amplex UltraRed) analysen. A) Membranen impermeant AUR can oksyderes til sin fluorescerende resorufin form AUR-ox, etter H 2 O 2 i nærvær av en peroksydase (eksitasjon og emisjon topper ved 530 og 590 nm, henholdsvis). Fluorescens-intensiteten av AUR-ox tilsvarer mengden av H to O to produsert utenfor cellene. B) Et representativt eksperiment viser at når stimulert med LPS, O 2-produksjon fra AX2 cellene er betydelig høyere enn den basale den dynamiske H 2 nivå fra nonstimulated AX2 celler og bakgrunnsreaksjon. C) ved behandling med forskjellige konsentrasjoner av DEDTC eller katalase, hellingen (RFU / min) av AUR-ox produksjonen avtar i en doseavhengig måte, på grunn av inhibering av H to O to produksjon fra intracellulær superoksid og uttømming av ekstracellulært H 2 O 2, henholdsvis. Klikk her for å se større versjonfiguren.
Fil S1. Film av dynamisk phagosomal ROS produksjon i Dictyostelium celler. Den time-lapse filmen ble spilt inn for 40 min med levende mikroskopi, ved hjelp av en 60X forstørrelse. I løpet av det første minuttet etter opptak ved fagocytose, fluorescens av OBG fluoriscerende-belagte perler endret fra rød til lys oransje, som indikerer at ROS ble trolig produsert direkte inne i phagosomes. Klikk her for å se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med de tidligere beskrevne metoder, OBG assay dynamisk visualiserer prosessen med phagosomal ROS generering på enkeltcelle-nivå, istedenfor å måle en gjennomsnittlig ROS-signal fra en populasjon av celler. Slike befolkningsGjennomsnitt metoder tendens til å skjule viktig informasjon forårsaket av nonsynchronous fagocytose. Vi vellykket tilpasset DHE og AUR-analyser til Dictyostelium og optimalisert protokollene. Viktigst, vi angitt hvilke typer og subcellulære lokaliseringer av ROS målt ved disse to analysene. Tatt sammen, hele settet med ROS måleprotokoller for Dictyostelium gir et nyttig og kraftig system for å studere ROS-relaterte cellulære mekanismene, for eksempel medfødt immunitet, celledifferensiering og intracellulær signalering.
For OBG analysen, er utarbeidelsen av belagte perler kritisk for å lykkes med forsøket. På grunn av kompleksiteten av reseptor-mediert phagocytic opptak i mammalian celle, at partiklene må være opsonized (f.eks IgGs) for å utløse inntak. Lavt opptak effektivitet i pattedyrceller sterke begrensninger på visualisering av enkelthendelser av phagosomal ROS generasjon. Graden av fagocytose i Dicytostelium har blitt observert til å være 10 til 20 ganger høyere enn i en makrofag 17, og med den foreliggende protokoll vi oppnådd robust og effektiv fagocytose uten å konjugere en hvilken som helst opsonin på perlene. Dette forenkler ikke bare bead coating-prosedyre, men reduserer risikoen for oksydasjon av OBG fluorescein fargestoff under manipulering. Siden OBG fluorescein kan oksyderes av lys og oksygen, må reagenset som skal beskyttes mot eksponering for lys fra omgivelsene og luft så mye som mulig (for eksempel bruke aluminiumsfolie for å dekke røret og fylle røret med nitrogen eller en annen inert gass), spesielt for langtidslagring.
For levende bildebehandling, kan cellene bli belagt på ulike retter med optisk cLear bunner. Mens Dictyostelium fester seg litt bedre å plast, de fleste pattedyrceller (se nedenfor) holder seg like godt til glass. Et annet viktig trinn for optimal avbildning, er å inkubere celler i Dictyostelium LF medium (lav fluorescens bakgrunn) i minst 2 timer før videre til de bildedannende trinn. På grunn av at bakgrunnen grønn fluorescens-signalet fra kulturmediet (HL5C) behøver å bli tømt fra deres endosomal avdelinger for å unngå interferens med det signal som genereres fra oksyderte belagte perler. Vi anbefaler også svært utfører minst én pilotforsøk for å optimalisere innstillingene for mikroskop (f.eks laser intensitet, eksponeringstid, etc.), spesielt for den grønne kanalen. Perlene stadig avgir sterk rød fluorescens i løpet av hele eksperimentet, men den grønne fluorescensen øker ved reaksjon med ROS straks etter fagocytose og platåer innen 5-10 min. Derfor er det bedre å justere innstillingene for grønn kanal nær slutten av forsøket når den grønne fluorescens fra de fleste av perlene kan være fullt visualiseres. Når innstillingene er optimalisert, lagre det for senere eksperimenter for å oppnå reproduserbare resultater.
Under OBG analysen, bør friske celler fortsette sin tilfeldig motilitet og ikke runde opp. Ellers er dette en indikasjon på celleskader, som kan være forårsaket enten ved tørking av agar overlegg eller av overdreven laserintensiteten. Derfor holder nok væske på agar overlegg for varigheten av hele forsøket, og også holde laserintensitet og eksponeringstiden så lav som mulig.
I AUR og DHE assays, helningen av fluorescens lese kurvene viser en doseavhengig forhold til mengden av celler som brukes i hver brønn innenfor et bestemt område. For å oppnå de mest reproduserbare resultater, er det viktig å bruke identisk antall celler for hver tilstand av et eksperiment. I tillegggrunn av forskjeller i cellestørrelse mellom forskjellige celletyper, er det sterkt foreslått at i løpet av pilotforsøk, er forskjellige fortynninger testet for å oppnå en celle monolag etter feste til brønnbunnen. For Dictyostelium AX2 celler, 3 x 10 5 celler danne et monosjikt, og dette celletetthet gjelder også for mange andre Dictyostelium villtype-og mutante stammer. For å oppnå nøyaktige celletall, er det best å telle etter sentrifugering, og ikke før, ettersom sentrifugering og resuspensjon pellet trinn kan forårsake noe celletap. Vi benytter en automatisk celleteller for å telle etter resuspendering cellepelleten (virker best med celletetthet over 6 x 10 6 celler / ml), og deretter nøyaktig fortynne celleprøver til 6 x 10 6 celler / ml.
For de DHE og AUR-analyser, kan lave signaler skyldes bruk av nonoptimal 96-brønners plater, og dermed, anbefaler vi at du bruker hvite ikke-transparent 96 brønners plater. Sammenlignet med sort eller translige plater, blir fanget fluorescerende signal forsterkes ved refleksjon på den hvite overflate, i stor grad øke signal-til-støy-forhold. Ulempen med hvite ikke-transparent plater er, noen ganger kan sterke fluorescerende signaler lekke til nabobrønner. Men ved å bruke 100 ul reaksjonsvolum og den beskrevne probe konsentrasjon, vi gjorde ikke oppdage noen lekker signal i både DHE og AUR-analyser. I tillegg anbefales det å utføre noen piloteksperimenter for å optimalisere følsomheten til fluorescens plateleser. Tar SynergyMX plateleser som et eksempel, følsomhet 100 og 70 fungerer best for DHE og AUR-analysen, henholdsvis. Videre er det viktig å overvåke den spesifikke eksitasjon og emisjonsspektrene i betingelsene for forsøket, med cellene. Faktisk har vi observert en forskyvning av utslipp maksimalt for AUR til 590 nm, sammenlignet med 581 nm som er nevnt av produsenten. Endelig fikk vi litt bedre resultater etter spennende på 530 nm i stedet for 568nm foreslått av produsenten.
Sammenlignet med et AUR stamløsning, er mye mer utsatt for oksydasjon av DHE stock løsning, selv når det er beskyttet mot lys ved -20 ° C. Dermed er det bedre å bruke DHE lager i løpet av 10 dager etter oppløsning av pulver. Hvis fargen på stamløsning skifter fra grått til lilla eller rosa, forkaste det og forberede frisk fra pulver 18.
I AUR-analysen, kan både AUR og HRP tas opp av macropinocytosis. Derfor fluorescerende signal som følge av oksidasjon av H 2 O 2 kan også delvis genereres inne i macropinosomes. Men siden AUR og HPR ikke penetrere cellemembraner, er signalet målt inne i macropinosomes av AUR-analysen likevel topologisk tilsvarende et ekstracellulært signal, i motsetning til et signal som genereres i cytosol.
Basert på en rekke foreløpige tester for både DHE og AUR-analyser,det synes viktig å bruke et enkelt buffer som ikke inneholder glukose eller andre biologiske mediakomponenter, fordi de sterkt forstyrre begge analysene, og resultere i en høy artefactual fluorescerende signal. Derfor bruker vi Sorensen fosfatbuffer supplert med 0,12 M sorbitol, en ikke-fordøyelig osmolyte brukes til å angi en osmolaritet ligner på Dictyostelium kultur medium 19. Legg merke til at det høye saltinnhold i iso-osmotisk buffere som brukes for pattedyrceller, slik som PBS, er skadelig for Dictyostelium.
Protokollene som presenteres her kan ikke måle alt mulig ROS, for eksempel hypokloritt, hydroksyl radikaler og singlet oksygen, og deres subcellulære lokalisasjoner. En mer helhetlig bilde av ROS generasjon er fortsatt begrenset av tilgjengelighet og utvikling av spesifikke prober.
Dette settet av protokoller kan enkelt tilpasses til andre celler, inkludert pattedyr fagocytter, med følgende modifiseringasjon. For eksempel i OBG assay, medium uten FCS og fenolrødt kan brukes for å oppnå en lav bakgrunnsfluorescens. I DHE og AUR-analyser, kan PBS-buffer benyttes i stedet for SS6.4, og antallet av celler belagt i hver brønn for å få et sammenflytende lag kan tilpasses ved prøving og feiling, i henhold til deres størrelse. Konsentrasjonene av HRP, AUR og DHE kan også bli optimalisert i piloteksperimenter for å oppnå de mest følsomme resultater. Imidlertid bør mulige skadelige effekter av DMSO testes ved bruk av økte konsentrasjoner av AUR-og / eller DHE reagenser. Vi har testet DHE og AUR-analysene hell med en annen protozo, Acanthamoeba castellanii og med en mus BV2 mikroglia cellelinje. I tillegg kan DHE og AUR-analyser også brukes til å måle ROS utvikling under vert-patogen interaksjoner, for eksempel ved infeksjon i Dictyostelium eller Acanthamoeba av Mycobacteria marinum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til legene Karl-Heinz Krause og Vincent Jaquet for hjelp og råd til å sette opp disse protokollene, og også takke Christoph Bauer og Jérôme Bosset fra Bioimaging Platform av NCCR og Dr. Navin Gopaldass for deres tekniske støtte. Forskningen er støttet av en ProDoc bevilgning av den sveitsiske National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx | |
References
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. dictyBase and the Dicty Stock Center. Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).
- Basu, S., et al. dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species. Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).
- VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst. Traffic. 10, 372-378 (2009).
- Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals. Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).
- Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods. Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).
- Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays. Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay. Ann. Biomed. Eng. , (2012).
- Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles. J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).
- Guimaraes-Ferreira, L., et al. Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Walk, A., et al. Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells. Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).
- Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).
- Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. Methods in Molecular Biology. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).
- Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species. Proto. Exch. , (2008).
- Neuhaus, E. M., Soldati, T. A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes. J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).
