Summary
Vi anpassade en uppsättning protokoll för mätning av reaktiva syreradikaler (ROS) som kan tillämpas i olika amöba och däggdjurs cellulära modeller för kvalitativa och kvantitativa studier.
Abstract
Reaktiva syreradikaler (ROS) omfattar en rad reaktiva och kortlivade, syreinnehållande molekyler, som dynamiskt interkonverteras eller elimineras antingen katalytiskt eller spontant. På grund av den korta livslängden för de flesta ROS och mångfalden av sina källor och subcellulära lokaliseringar, kan en fullständig bild erhållas endast genom noggranna mätningar med hjälp av en kombination av protokoll. Här presenterar vi en uppsättning av tre olika protokoll att använda OxyBurst Grön (OBG)-belagda kulor, eller dihydroethidium (DHE) och Amplex UltraRed (AUR), för att kvalitativt och kvantitativt övervaka olika ROS i professionella fagocyter såsom Dictyostelium. Vi optimerat Pärlorna beläggningsförfaranden och begagnade OBG-belagda pärlor och live-mikroskopi för att dynamiskt visualisera intraphagosomal ROS generation på enskild cellnivå. Vi identifierade lipopolysackarid (LPS) från E. coli som en potent stimulator för ROS generation i Dictyostelium. Dessutom har vi developed realtid, medel throughput analyser med hjälp av DHE och AUR att kvantitativt mäta intracellulär superoxid och extracellulärt H2O 2 produktion, respektive.
Introduction
Reaktiva syreradikaler (ROS) är involverade i en mängd olika biologiska processer såsom värdförsvar, signalering, vävnadsutveckling och svar på skada samt högt blodtryck och cancer. Den väl studerade phagosomal NADPH-oxidas maskiner är tillägnad snabb ROS generation, kallad oxidativ burst, för att döda bakterier som intas i neutrofiler "phagosomes 1. Dessutom har läckage av elektroner som en biprodukt av den mitokondriella andningskedjan tidigare trott för att vara ansvarig endast för en oreglerad källa till ROS. Men nyligen har det identifierats som en viktig mekanism för att bidra till intraphagosomal dödandet av bakterier i musmakrofager 2. Under de senaste åren har den sociala amöba, Dictyostelium, blir en kraftfull och populär modell för att studera cell inneboende mekanismer i det medfödda immunsvaret. Faktum Dictyostelium och mänskliga fagocyter delar en förvånansvärt hög nivå av bevarande i molecular maskinerier ansvariga för bakterier avkänning, omvälvning och dödar 3,4. De homologer av proteiner och enzymer som rör ROS produktion eller avgiftning, såsom NADPH oxidaser, kata, superoxiddismutaser, kan finnas i både mänskliga och Dictyostelium. Som bäst studerade amöba, Dictyostelium presenterar flera unika fördelar jämfört med däggdjur modellsystem. De växer vid rumstemperatur utan behov av CO 2, med en dubbleringstid av 8-10 timmar. De kan lätt hållas så vidhäftande eller suspensionskulturer. Dessutom, tack vare sin helt sekvense och kommenterad haploidgenom, och till enkel genetisk manipulation, har Dictyostelium blivit en mycket attraktiv experimentell modellorganism.
I tidigare studier, olika klorerade och fluorerade derivat av fluorescein (kollektivt kallas OxyBurst Green, OBG) som avger fluorescens efter oxidation av ROS, har använt som en ROS reporter. Cell-permeant esterified derivat används för att mäta cytoplasma ROS, medan cell impermeant dextran-eller protein-kopplade derivat används för att mäta extracellulära ROS. I synnerhet har OBG BSA-belagda pärlor redan använts för att detektera phagosomal ROS-produktion i däggdjursceller 5. Däremot kan den mikroplattläsare synsätt bara ge ett genomsnitt ROS generation kurva från en population av celler. Med det nuvarande protokollet, med hjälp av Dictyostelium, en professionell phagocyte och optimerade experimentella förhållanden, vi får en stabil och effektiv fagocytos utan att konjugera någon opsonin på pärlorna. DHE har använts i olika modellsystem, såsom däggdjurs neutrofiler och makrofager, för att detektera ROS-produktionen 6-9. Samtidigt finns det en del kontroverser över specificiteten och känsligheten för metoden 8,10. Som en förbättrad version av Amplex Red, fluorescensintensiteten hos AUR är mindre känslig för pH, vilket gör det mer lämpligt för att mätaROS i nonneutral eller svagt sura miljöer. AUR har nyligen tillämpats i flera däggdjurssystem 11,12, men dess användning i nonmammalian modeller, som ofta kräver svagt surt tillväxtmedier, har inte rapporterats ännu. Dessutom finns det inga publicerade protokollet för att kvantitativt och dynamiskt mäta ROS produktion och lokalisering i sociala amöba Dictyostelium.
Målet med den presenterade uppsättning protokoll är att ge en enkel och mångsidig lösning för att övervaka olika ROS och deras lokalisering, och vidare ge insikter i ROS-relaterade cellulära mekanismer. För OBG analysen använde vi lever mikroskopi för att övervaka hela processen med phagosomal ROS generation efter upptag av OBG-belagda kulor av Dictyostelium celler, och som en ny metod för att studera mekanismen för intraphagosomal dödandet av bakterier. Vi har optimerat medel genomströmning DHE och AUR analyser i Dictyostelium, för att mäta intracellulära Superoxide och extracellulär H2O 2 produktion, respektive, genom att använda LPS som en potent ROS stimulator. Observera att LPS nyligen visat sig öka den antibakteriella effekten av Dictyostelium mot fagocyteras bakterier 13. Vidare behandling med DEDTC och katalas uttryckligen bekräftat att dessa två metoder mäter specifikt olika typer och subcellulära lokaliseringar av ROS i Dictyostelium. Slutligen kan OBG analysen anpassas till alla vidhäftande fagocytisk cell, genom att ytterligare opsoniserande pärlorna med ligander för fagocytiska receptorer av djurceller. I princip kan de DHE och AUR analyser också finjusteras för mätningar i fastsittande eller nonadherent cell under lämpliga experimentella förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Visualisering och Kvalitativ Mätning av ROS Produktion i phagosomes
De OBG-belagda kulor bör förberedas i förväg. Pärlorna beläggningsförfaranden och agar overlay teknik är anpassade från publicerade referenser 5,14.
- Tillsätt 1 ml suspension av 3,0 ^ m karboxylerade kiseldioxidpärlor (ca 1,8 x 10 9 pärlor) i ett 1,5 ml rör, tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml PBS genom snabb dragning och virvling.
- Återsuspendera pärlorna i 1 ml PBS innehållande 25 mg / ml cyanamid (för att aktivera de karboxylerade kiselpärlor för att kovalent binda prelabeled BSA), inkubera på ett hjul för 15 min.
- Tvätta 3x med 1 ml kopplingsbuffert (0,1 M natriumborat, pH 8,0) genom snabb centrifugering (centrifug vid full hastighet i en bordsskiva mini-centrifug under 5 sek eller alternativt Centrifugera vid 2000 x g under 1 min i en bordscentrifug) och vortexa att avlägsna överskott cyanamid.
- Blanda de tvättade pärlorna med 500 ^ il coupling buffert innehållande 1 mg OxyBurst Grön (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, fyller röret med kvävgas från en vanlig gas-kan före begränsning, och inkubera på ett hjul för 14 h (över natten) vid RT i mörker.
- Tvätta pärlorna 2x med 1 ml av snabbkylning-buffert (250 mM glycin i PBS) för att avlägsna oreagerad OBG, och två gånger med kopplingsbuffert för att avlägsna härdningsbuffert genom snabb dragning och virvling.
- Tillsätt 1 ml kopplingsbuffert innehållande 50 pg av Alexa Fluor 594 succinimidylestern att böja till BSA. Fyll röret med kvävgas före begränsning, och inkubera på ett hjul i 1,5 h vid rumstemperatur i mörker.
- Tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml av släckning buffert genom snabb dragning och virvling för att stoppa reaktionen, sedan tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml PBS genom snabb dragning och virvling.
- Slutligen resuspendera kulorna i 1 ml PBS med 2 | il av 10% vikt / volym azid för långtidsförvaring. Mät Koncentration av pärlor i suspensionen med en hemocytometer (vanligen cirka 1-2 x 10 9 pärlor / ml), fylla röret med kvävgas före begränsning, och förvara vid 4 ° C i mörker.
- Beläggnings effektivitet OBG fluorescein kan testas genom att kontrollera emissionsspektrumet använder excitering vid 500 nm. När oxideras av H 2 O 2 i närvaro av pepparrotsperoxidas (HRP), fluorescensintensiteten av oxiderade pärlor, vid emissionstopp (538 nm), är 11-12x högre än den för icke-oxiderad belagda kulorna.
- Harvest exponentiellt växande Dictyostelium celler från en 10 cm petriskål, tallrik olika tätheter av celler på 3 cm rätter med en optiskt klar plast eller glas botten, och växa dem över natten. Välj de rätter som är ca 80% sammanflytande för experimentet. Ett detaljerat protokoll för att odla Dictyostelium celler har publicerats 15.
- Byt odlingsmediet med LoFlo medium (LF-medium), inkubera2 tim före försöket i syfte att minska den extracellulära och intraendosomal autofluorescens av HL5C odlingsmediet.
- Parallellt, smälta 10 ml 1,5% Bacto-agar i LF-medium, häll agar på en plan yta (dvs en glasplatta av 10 cm x 10 cm) för att bilda en agar skikt ca 1 mm tjockt, vänta 10-15 min för att stelna. Skär agar lagret i 2 cm x 2 cm fyrkanter och placera i LF-medium för senare användning.
- Under tiden förbereder spinning-disk eller brett fält mikroskop, ställ in temperaturen i klimatkammare vid 22 ° C och justerar inställningarna för detta experiment. (Se ytterligare kommentarer i diskussionen).
- Efter 2 h av inkubation aspirera LF mediet från 3 cm skål, men cellmonoskiktet fortfarande bör vara täckt av en tunn film av medium. Späd de belagda pärlorna till 1,5 x 10 7 pärlor / ml och tillsätt 10 | il på cellskiktet.
- Ta en kvadrat agar ark, dränera överflödig vätska men behålla blöt. Försiktigt sätta the agar kvadrat ovanpå cellskiktet. Flytta inte den agar torget när den ligger på cellerna. Den agar används för att öka kontakten mellan kulor och celler och därigenom förbättra upptag och den också något komprimerar cellerna, att hålla dem bättre i fokalplanet av målet.
- Sätt på locket på skålen, placera den på mikroskop scenen, och automatiskt ta bilder på de röda, gröna och fas-kanaler var 1 min i 2 timmar eller längre.
- Välj och fokusera på cellulära händelser som innehåller hela processen för fagocytos. Slå ihop de optimerade 3 kanaler och montera bilderna i en film med hjälp av professionellt bildbehandlingsprogram. Kvantifiera fluorescensintensiteterna för varje selekterat pärlor i röda och gröna kanaler, och förhållandet av grön / röd kommer att återspegla den dynamiska phagosomal ROS-produktion av cellerna.
2. Kvantitativ och medel genomströmning Mätning av intracellulär superoxidproduktionen
- Samla one 80% sammanflytande maträtt av Dictyostelium i 10 ml HL5C medium. Centrifugera Dictyostelium cellerna vid 850 xg under 5 minuter, noggrant och fullständigt aspirera överflödig medium. Slamma upp cellerna i SS6.4 buffert [0,12 M sorbitol i Sörensen-buffert (14,69 mM KH 2 PO 4 och 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], räkna celler och späd till en slutlig densitet på 6 x 10 6 celler / ml (se ytterligare kommentarer i diskussionen).
- Addera 50 pl av cellsuspensionen i varje brunn i en vit icke-transparent 96-brunnsplatta (se ytterligare kommentarer i diskussionen).
- Späd DHE lager (30 mM i DMSO) 500 gånger med SS6.4, pipett 50 ul av utspädd DHE i varje brunn med en flerkanalig pipett vid behov. Den slutliga koncentrationen av DHE är 30 mikroM. Reaktionen startar omedelbart.
- Stimuli eller hämmare kan läggas vid denna tidpunkt, eller vid andra tidpunkter efter specifika behov.
- Använd slutpunkten "top läsning & #34; läget av ett fluorescensmikroplattläsare, med fluorescensexcitering / emission vid 522 nm/605 nm, läser varje 2 min under 1 h, medium shake 5 sek / min, vid 22 ° C.
3. Kvantitativ och hög kapacitet Mätning av extracellulärt H 2 O 2 Produktion
- Följ samma steg som beskrivs i 2.1 och 2.2.
- Förbered utspädd HRP genom tillsats av 5 pl HRP lager (100 E / ml i destillerat vatten) i 10 ml SS6.4, virvel eller invertera röret för att blanda väl och hålla på is för senare användning. Den utspädda HRP-lösning är på 0,05 U / ml.
- Förbered AUR reaktionsblandning genom att blanda den AUR lager (10 mM AUR i DMSO) och den utspädda HRP-lösning i SS6.4 buffert till slutliga koncentrationer av 6,25 | iM och 0,005 U / ml, respektive. Som ett exempel, för framställning av reaktionsblandningen för 40 reaktioner, blanda 1600 pl SS6.4 med 400 pl av utspädd HRP och 2,5 | il av AUR förrådslösning.
- Lägg 50 pl AUR mixture in i varje brunn med en multikanalpipett om nödvändigt. Nu startar reaktionen.
- Stimuli eller hämmare kan läggas vid denna tidpunkt, eller vid andra tidpunkter efter specifika behov.
- Använd ändpunkten "topp läsning"-läge av ett fluorescensmikroplattläsare, med fluorescensexcitering / emission vid 530 nm/590 nm, läser varje 2 min under 1 h, medium shake 5 sek / min, vid 22 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genereringen av ROS i phagosomes kan visualiseras kvalitativt och dynamiskt genom mikroskopi (File S1). Den röda fluorescens som emitteras av Alexa Fluor 594 är pH-okänslig och förblir konstant i phagosomal miljön, medan oxidation av OBG ökar dess fluorescens i den gröna kanalen. Den emissionsspektra för in vitro-oxiderade och icke-oxiderad OBG-belagda pärlor jämförs i Figur 1B visar en signifikant ökning i intensitet efter oxidation. För att underlätta visualisering av live-evenemang, är de två kanalerna samman och de resulterande ändrar färg från röd till orange under fagocytos av vildtyp AX2 celler inom 1 min av upptag. Ökningen i grön fluorescens indikerar ROS generation möjligen direkt i phagosome. Genom användning av en mikroplattläsare, medium-throughput kvantitativ mätning av intracellulär superoxid och extracellulär H 2 O 2 produktion visas i Figure 2C och Figur 3B, respektive. Basal ROS produktion från AX2 celler, möjligen från vanlig oxido-reduktiv metabolism, kan mätas. När cellerna stimuleras med LPS, är signaler för ROS-produktionen ökade signifikant i båda analyserna. Dessutom, i DHE analysen, minskningen av blå fluorescens (dihydroethidium) och ökningen av röd fluorescens (etidium) signaler är omvänt korrelerade, som förväntat. Lokaliseringen av ROS produktion mätt med både DHE och AUR analyser bekräftas i figur 2D och figur 3C, respektive. Tillsats av DEDTC (ett membrangenomträngande superoxiddismutas (SOD)-hämmare) 16 ökade DHE signal och minskade AUR signal i ett dosberoende sätt, vilket indikerar att DEDTC orsakade ackumuleringen av SOD substratet superoxid och utarmning av SOD produkt H 2 O 2 förväntas från reaktionen som visas i figur 2A. ETTlternatively, genom tillsats av katalas (ett membran impermeant H 2 O 2 quencher), den intracellulära superoxid-signalen från DHE assay påverkades inte, medan den extracellulära H 2 O 2-signal från AUR-analys minskade på ett dosberoende sätt.
Figur 1. Princip och användning av OBG (OxyBurst Grön)-analys. A) OBG fluorescein och Alexa Fluor 594 är kovalent kopplad till ytan av 3 | im silikapartiklar pärlor via BSA. Utsläppen fluorescens från OBG fluorescein anger oxidation av ROS, medan signalen från Alexa Fluor 594 hjälper lokalisera pärlorna och fungerar som kontroll för fluorescens kvantifiering. B) In vitro test för beläggningseffektivitet. H 2 O 2 och HRP används för att oxidera de belagda pärlorna in vitro. Enligt spännanation vid 500 nm, de oxiderade pärlor visar ett signifikant toppemission vid 538 nm jämfört med den för icke-oxiderad pärlor, med en intensitetskvot på minst 11-12 gånger.
Figur 2. Princip och användning av DHE (Dihydroethedium) analys. A) Sammanfattning av de biokemiska reaktioner relaterade till DHE och AUR analyser. B) i cytosolen, har membranet genomträngande DHE excitation och emissionstoppar vid 370/420 nm, respektive. Som ett resultat av oxidation av superoxid, är etidium kan inskjuta i kärn-och mitokondrie-DNA och har skiftat excitations-och emissionstoppar vid 522/605 nm, respektive. Fluorescensintensiteten hos etidium motsvarar mängden av superoxidproduktion inuti cellerna. C) Ett representativt experiment visar att, när det stimuleras med LPS, den dynamiska superoxidproduktion från AX2 celler är signifikant högre än den basala nivån från nonstimulated AX2 celler och bakgrunden av reaktionen i en buffert. Minskningen av blå fluorescens och ökningen av röda fluorescens är omvänt korrelerade som förväntat. D) Vid behandling med olika koncentrationer av DEDTC (ett membran genomträngande superoxiddismutas-hämmare), lutning (RFU / min) av etidium produktionsökningar i ett dos- beroende sätt, medan behandling med katalas (ett membran impermeant H2O 2 släckare) inte påverkar superoxidproduktion. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Princip och användning av AUR (Amplex UltraRed) analys. A) Membran impermeant AUR can att oxideras till sin fluorescerande resorufin form AUR-oxe, av H 2 O 2 i närvaro av en peroxidas (excitations-och emissionstoppar vid 530 och 590 nm, respektive). Fluorescensintensiteten av AUR-ox motsvarar mängden av H 2 O 2 som produceras utanför. B-celler) Ett representativt experiment visar att, när det stimuleras med LPS, O 2 produktion från AX2 celler är den dynamiska H 2 betydligt högre än den basala nivå från nonstimulated AX2 celler och bakgrundsreaktionen. C) När de behandlades med olika koncentrationer av DEDTC eller katalas, lutningen (RFU / min) av AUR-ox produktionen minskar på ett dos-beroende sätt, på grund av hämning av H 2 O 2 produktion från intracellulär superoxid och utarmning av extracellulärt H 2 O 2, respektive. Klicka här för att visa en störrefigur.
Fil S1. Film av dynamisk phagosomal ROS produktion i Dictyostelium celler. Tids-lapse film spelades in under 40 min med live-mikroskopi, med hjälp av en 60X förstoring. Under den första minuten efter upptag genom fagocytos, fluorescens av OBG fluorescein belagda pärlor ändras från rött till ljust orange, vilket indikerar att ROS sannolikt producerades direkt innanför phagosomes. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med de tidigare beskrivna metoderna, OBG-analysen visualiserar dynamiskt processen för phagosomal ROS-generering vid den enda cellnivå, i stället för att mäta en genomsnittlig ROS-signal från en population av celler. Sådana befolkningsmedelvärdes metoder tenderar att skymma viktig information som orsakas av osynkron fagocytos. Vi framgångsrikt anpassat DHE och AUR analyser till Dictyostelium och optimerade protokollen. Viktigast av allt, vi specificerade typerna och subcellulära lokaliseringar av ROS mätt med dessa två analyser. Sammantaget, hela uppsättningen av ROS mätningsprotokoll för Dictyostelium ger ett användbart och kraftfullt system för att studera ROS-relaterade cellulära mekanismer, såsom medfödd immunitet, celldifferentiering och intracellulär signalering.
För OBG analys är beredning av belagda kulor kritisk för framgången av experimentet. På grund av komplexiteten av receptorförmedlad fagocytisk upptagning i mammalian cell, partiklarna måste opsoniserad (t.ex. med IgG) att utlösa förtäring. Låg upptag effektivitet i däggdjursceller begränsar allvarligt visualisering av enskilda händelser av phagosomal ROS generation. Graden av fagocytos i Dicytostelium har observerats vara 10-20 gånger högre än i en makrofag 17, och med det nuvarande protokollet vi fått robust och effektiv fagocytos utan att konjugera någon opsonin på pärlorna. Detta förenklar inte bara den vulst-beläggningsproceduren, men minskar riskerna för oxidation av OBG fluoresceinfärgämnet under manipulation. Eftersom OBG fluorescein kan oxideras av ljus och syre, har reagens skyddas från exponering för omgivande ljus och luft så mycket som möjligt (t.ex. använda aluminiumfolie för att täcka röret och fyll röret med kvävgas eller annan inert gas), särskilt för långtidslagring.
För levande avbildning kan celler pläterade på olika rätter med optiskt clear bottnar. Medan Dictyostelium vidhäftar något bättre till plast, de flesta däggdjursceller (se nedan) vidhäfta lika väl till glas. Ett annat viktigt steg för optimal avbildning är att inkubera Dictyostelium celler i LF medium (låg fluorescens bakgrund) i minst 2 timmar innan du går vidare till avbildningssteg. Eftersom bakgrunden grön fluorescens-signal i odlingsmediet (HL5C) måste vara uttömda från sina endosomala fack för att undvika interferens med den signal som genereras från oxiderade belagda kulor. Vi rekommenderar också starkt att utföra minst en pilotexperiment för att optimera inställningarna för mikroskop (t.ex. laser intensitet, exponeringstid, etc.), särskilt för den gröna kanalen. Pärlorna avger konstant stark röd fluorescens under hela experimentet, men den gröna fluorescensen ökar vid reaktion med ROS omedelbart efter fagocytos och platåer inom 5-10 min. Därför är det bättre att justera inställningarna för green kanal nära slutet av experimentet när den gröna fluorescensen från de flesta av kornen kan fullständigt visualiseras. När inställningarna är optimerade, spara den för framtida experiment för att uppnå reproducerbara resultat.
Under OBG analysen bör friska celler fortsätta sin slumpmässiga rörlighet och inte runda upp. Annars är detta ett tecken på cellskada som kan orsakas antingen av torkning av agar eller av överdriven laser intensitet. Därför håller tillräckligt vätska på agar overlay för varaktigheten av hela experimentet och även hålla laserintensiteten och exponeringstiden så låg som möjligt.
I AUR och DHE assays, lutningen på fluorescensavläsning kurvor visar ett dosberoende förhållande till mängden av celler som används i varje brunn inom ett visst intervall. För att uppnå de mest reproducerbara resultat är det viktigt att använda identiskt antal celler för varje tillstånd av ett experiment. Dessutomberoende på variationer i cellstorlek mellan olika celltyper, är det starkt antydde att under pilotexperiment, olika spädningar testas för att erhålla en cellmonoskikt efter fastsättning vid brunnens botten. För Dictyostelium AX2 celler, 3 x 10 5 celler bildar ett monolager och denna celltäthet gäller även många andra Dictyostelium vildtyp och muterade stammar. I syfte att erhålla exakta kroppar, är det bäst att räkna efter centrifugering, inte före, eftersom centrifugering och pellet resuspension steg kan orsaka viss cellförlust. Vi använder en automatiserad cellräknare för att räkna efter återsuspendering av cellpelleten (fungerar bäst med celldensiteter ovan 6 x 10 6 celler / ml), och sedan exakt späda ut cellprover till 6 x 10 6 celler / ml.
För DHE och AUR analyser, kan låga signaler bero på användningen av icke-optimal 96-hålsplattor, och därför rekommenderar vi att du använder vita ogenomskinliga 96 brunnar. Jämfört med svart eller OHent plattor, är den fångade fluorescerande signal intensifieras genom reflektion på den vita ytan, kraftigt öka signal-till-brus-förhållande. Nackdelen med vita ogenomskinliga plattorna är, ibland, kan en stark fluorescerande signaler läcka in i angränsande brunnar. Men genom att använda 100 pl reaktionsvolym och den beskrivna sondkoncentrationen, vi inte upptäcka någon läckande signal i både DHE och AUR analyser. Dessutom rekommenderar vi att utföra några pilotförsök för att optimera fluorescens känslighet hos plattläsare. Att ta SynergyMX plattläsaren som ett exempel, känslighet 100 och 70 fungerar bäst för DHE och AUR-analys, respektive. Dessutom är det viktigt att övervaka den specifika excitations-och emissionsspektra i villkoren för experimentet med celler. I själva verket har vi observerat en förskjutning av emissionsmaximum för AUR till 590 nm, jämfört med 581 nm som nämns av tillverkaren. Slutligen erhöll vi en aning bättre resultat genom att excitera vid 530 nm istället för 568nm föreslås av tillverkaren.
Jämfört med en AUR-stamlösning, är mycket mer benägna till oxidation DHE stamlösning, även i skydd från ljus vid -20 ° C. Därför är det bättre att använda DHE lager inom 10 dagar efter upplösning av pulvret. Om färgen på stamlösningen ändras från grått till lila eller rosa, kassera den och förbereda färskt från pulver 18.
I AUR-analysen kan både AUR och HRP tas upp av macropinocytosis. Därför den fluorescerande signalen till följd av oxidation av H 2 O 2 kan också delvis genereras inuti macropinosomes. Eftersom emellertid AUR och HPR inte penetrera cellulära membran, är den uppmätta signalen inuti macropinosomes av AUR-analys fortfarande topologiskt ekvivalent med en extracellulär signal, i motsats till en signal som alstras i cytosolen.
Baserat på en serie preliminära tester för både DHE och AUR analyser,det förefaller viktigt att använda en enkel buffert som inte innehåller glukos eller andra biologiska mediakomponenter, eftersom de starkt störa båda analyserna och resultera i en hög artefactual fluorescerande signal. Därför använder vi Sörensen fosfatbuffert kompletterad med 0,12 M sorbitol, en osmältbar osmolyt används för att ställa en osmolaritet som liknar den Dictyostelium odlingsmediet 19. Notera att den höga salthalten i iso-osmotisk buffertar som används för däggdjursceller, såsom PBS, är till förfång för Dictyostelium.
De protokoll som presenteras här kan inte mäta allt möjligt ROS, såsom hypoklorit, hydroxylradikaler och singlettsyre, och deras subcellulära lokaliseringar. En mer heltäckande bild av ROS generation fortfarande begränsas av tillgången och utvecklingen av specifika prober.
Denna uppsättning protokoll kan lätt anpassas till andra celler, inklusive däggdjurs fagocyter, med följande MODIFICation. Till exempel i OBG assay medium utan FCS och fenolrött kan användas för att erhålla en låg bakgrundsfluorescens. I DHE och AUR-analyser, kan PBS-buffert användas istället för SS6.4, och antalet celler utstrukna i varje brunn för att få ett konfluent lager kan anpassas genom försök och misstag, beroende på deras storlek. Koncentrationerna av HRP, AUR och DHE kan också optimeras i pilotförsök för att nå de mest känsliga resultat. Dock bör eventuella negativa effekter av DMSO testas vid användning av ökade koncentrationer av AUR och / eller DHE reagenser. Vi har testat DHE och AUR-analyser framgångsrikt med en annan protozo, Acanthamoeba castellanii och med en mus BV2 mikroglia cellinje. Dessutom kan den DHE och AUR analyser också användas för att mäta ROS generation under värd-patogen interaktioner, till exempel vid infektion av Dictyostelium eller Acanthamoeba av mykobakterier marinum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Dr Karl-Heinz Krause och Vincent Jaquet för hjälp och råd för att ställa in dessa protokoll, och även tacka Christoph Bauer och Jérôme Bosset från Bioimaging plattformen för NCCR och Dr Navin Gopaldass för deras tekniska support. Forskningen stöds av ett Prodoc beviljande av Swiss National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx | |
References
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. dictyBase and the Dicty Stock Center. Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).
- Basu, S., et al. dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species. Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).
- VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst. Traffic. 10, 372-378 (2009).
- Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals. Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).
- Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods. Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).
- Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays. Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay. Ann. Biomed. Eng. , (2012).
- Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles. J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).
- Guimaraes-Ferreira, L., et al. Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Walk, A., et al. Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells. Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).
- Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).
- Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. Methods in Molecular Biology. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).
- Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species. Proto. Exch. , (2008).
- Neuhaus, E. M., Soldati, T. A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes. J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).
