Summary
Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von reaktiven und kurzlebigen, sauerstoffhaltigen Moleküle, die dynamisch ineinander oder entweder katalytisch oder spontan eliminiert. Aufgrund der kurzen Lebensdauer der meisten ROS und der Vielfalt ihrer Quellen und subzellulärer Lokalisierungen kann ein vollständiges Bild nur durch sorgfältige Messungen mit einer Kombination von Protokollen erhalten werden. Hier präsentieren wir eine Reihe von drei verschiedenen Protokolle mit OxyBurst Green (OBG)-beschichteten Perlen oder Dihydroethidium (DHE) und Amplex UltraRed (AUR), qualitativ und quantitativ zu überwachen verschiedenen ROS in professionellen Phagozyten wie Dictyostelium. Wir optimierten die Perlen Beschichtungsverfahren und gebrauchten OBG-beschichteten Perlen und Live-Mikroskopie intraphagosomal ROS Generation auf Einzelzellebene dynamisch visualisieren. Wir identifizierten Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli als potenter Stimulator für ROS Generation in Dictyostelium. Darüber hinaus haben wir dntwickelt Echtzeit, Mitteldurchsatz-Assays mit DHE und AUR zur quantitativen Messung der intrazellulären Superoxid-und extrazellulären H 2 O 2-Produktion auf.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in einer Vielzahl von biologischen Prozessen wie der Wirtsabwehr, Signalisierung, Gewebeentwicklung und Reaktion auf eine Verletzung und Bluthochdruck und Krebs beteiligt. Die gut untersuchten phagosomalen NADPH-Oxidase-Maschinen, um eine schnelle ROS Generation, wie die oxidative burst bekannt gewidmet, um Bakterien in Neutrophilen 'Phagosomen 1 aufgenommen zu töten. Darüber hinaus wurde eine Leckage von Elektronen als ein Nebenprodukt der mitochondrialen Atmungskette bisher angenommen lediglich für eine ungeregelte Quelle von ROS sein. Aber vor kurzem wurde es als ein wichtiger Mechanismus, um intraphagosomal Abtötung von Bakterien in Maus-Makrophagen 2 beitragen identifiziert. In den letzten Jahren, die soziale Amöbe Dictyostelium, hat sich zu einem leistungsstarken und beliebten Modell zu Zelle intrinsischen Mechanismen der angeborenen Immunantwort zu untersuchen. Tatsächlich Dictyostelium und Menschenfresszellen teilen sich eine überraschend hohe Niveau der Erhaltung in molecular Maschinen für Bakterien erfassen, Einwirkung und Tötung 3,4 verantwortlich. Die Homologen von Proteinen und Enzymen, um die ROS-Produktion oder Entgiftung, wie NADPH-Oxidase, Katalase, Superoxiddismutasen stehen, kann sowohl in der Human-und Dictyostelium gefunden werden. Als die am besten untersuchten Amöbe Dictyostelium stellt mehrere einzigartige Vorteile gegenüber Säugermodellsystem. Sie wachsen bei Raumtemperatur ohne die Notwendigkeit für CO 2, mit einer Verdopplungszeit von 8-10 Stunden. Sie können leicht als adhärente oder Suspensionskulturen gehalten werden. Darüber hinaus dank ihrer vollständig sequenziert und annotierte haploiden Genom, und einfach genetische Manipulation, Dictyostelium hat sich zu einem sehr attraktiven experimentellen Modellorganismus.
In früheren Studien verschiedene chlorierte und fluorierte Derivate von Fluorescein-Fluoreszenz, die nach der Oxidation durch ROS emittieren (kollektiv als OxyBurst Grün, OBG bekannt), wurden als ROS-Reporter verwendet. Handy-permeant esterified Derivate zur zytoplasmatischen ROS zu messen, während die Zell-impermeante Dextran-oder Protein-gekoppelten Derivate zur extrazellulären ROS messen. Insbesondere haben OBG BSA-beschichteten Kügelchen bereits zur phagosomalen ROS-Produktion in Säugerzellen 5 zu erkennen. Allerdings kann die Mikroplatten-Reader-Ansatz geben nur eine gemittelte ROS Erzeugungskurve aus einer Population von Zellen. Mit der vorliegenden Protokolls unter Verwendung Dictyostelium, eine professionelle Phagozyten und optimierte Versuchsbedingungen erhalten wir stabile und effiziente Phagozytose ohne jede Konjugation Opsonin auf die Perlen. DHE in verschiedenen Modellsystemen, wie Säuger Neutrophilen und Makrophagen verwendet worden, um zu erkennen ROS 6-9. Inzwischen gibt es einige Kontroversen über die Spezifität und Sensitivität der Methode 8,10. Als verbesserte Version Amplex Red, der Fluoreszenzintensität von AUR weniger empfindlich auf pH-Wert, die es geeignet macht, um zu messenROS in nicht neutrale oder schwach sauren Milieus. AUR wurde kürzlich in mehreren Säugetiersystemen 11,12 aufgebracht, aber ihre Verwendung in Säuger-Modelle, die ziemlich oft erforderlich schwach sauren Wachstumsmedien, wurde noch nicht berichtet worden. Darüber hinaus gibt es keine veröffentlichten Protokoll quantitativ und dynamisch zu messen ROS-Produktion und Lokalisierung in der sozialen Amöbe Dictyostelium.
Das Ziel der dargestellte Satz von Protokollen ist, eine einfache und vielseitige Lösung für verschiedene ROS und deren Lokalisation überwachen und weitere Einblicke in ROS bezogenen zellulären Mechanismen. Für die OBG-Test, haben wir Live-Mikroskopie, um den gesamten Prozess der phagosomalen ROS Generation nach Aufnahme von OBG-beschichtete Beads Dictyostelium-Zellen zu überwachen, und ein neuer Ansatz, den Mechanismus der intraphagosomal Abtötung von Bakterien zu untersuchen. Wir haben mittel-Durchsatz DHE und AUR-Assays in Dictyostelium optimiert, um die intrazelluläre Superoxid messenide und extrazellulären H 2 O 2-Produktion, bzw. mit Hilfe LPS als potenter Stimulator ROS. Beachten Sie, dass LPS wurde kürzlich gezeigt, dass die bakterizide Aktivität von Dictyostelium Richtung Phagozytose Bakterien 13 zu erhöhen. Zusätzlich Behandlung mit DEDTC und Katalase ausdrücklich bestätigt, dass diese beiden Methoden speziell messen verschiedene Typen und subzellulärer Lokalisierungen von ROS in Dictyostelium. Schließlich kann der Test zur OBG anhaftendem phagozytische Zelle ferner opsonisierender der Kügelchen mit Liganden für die phagozytische Rezeptoren von tierischen Zellen angepasst werden. Im Prinzip können die DHE und AUR-Assays auch fein abgestimmt für Messungen in anhaftendem oder nicht-adhärenten Zell unter geeigneten experimentellen Bedingungen.
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Protocol
1. Visualisierung und qualitative Messung der ROS-Produktion in Phagosomen
Die OBG-beschichteten Kügelchen sollten im Voraus vorbereitet werden. Die Perlen Beschichtungsverfahren und Agar Overlay-Technik werden die veröffentlichten Referenzen 5,14 angepasst.
- 1 ml Suspension von 3,0 um carboxylierten Silica-Kügelchen (ca. 1,8 x 10 9 Perlen) in ein 1,5-ml-Röhrchen, waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex.
- Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 25 mg / ml Cyanamid (die carboxylierten Silicakügelchen aktivieren kovalent vormarkiert BSA zu binden), Inkubation auf einem Rad 15 min.
- 3x Waschen mit 1 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natrium-Borat, pH 8,0) durch schnelle Runde (Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für Mini 5 Sekunden oder alternativ Zentrifuge bei 2000 g für 1 min in einer Tischzentrifuge) und Vortexen, um überschüssige Cyanamid zu entfernen.
- Mischen Sie die gewaschenen Perlen mit 500 ul coupling Puffer mit 1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas aus einer Standard-Gas-Dose vor der Deckelung und Inkubation auf einem Rad 14 Stunden (über Nacht) bei RT im Dunkeln.
- Waschen Sie die Beads 2x mit 1 ml Löschpuffer (250 mM Glycin in PBS), um nicht umgesetzte OBG zu entfernen, und zweimal mit Kupplungspuffer, um den Löschpuffer durch schnelle Drehung und Verwirbelung zu entfernen.
- 1 ml Kopplungspuffer, enthaltend 50 &mgr; g des Alexa Fluor 594 Succinimidylester an BSA konjugiert. Das Rohr wird vor dem Verschließen mit Stickstoff und Inkubieren auf einem Rad für 1,5 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml Puffer Abschrecken durch schnelle Drehung und Wirbeln, um die Reaktion zu stoppen, dann waschen die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex.
- Schließlich Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 2 &mgr; l 10% w / v Azid für langfristige Lagerung. Messen Sie die concentration der Raupen in der Suspension mit einer Zählkammer (in der Regel etwa 1-2 x 10 9 Perlen / ml), füllen Sie das Rohr mit Stickstoff vor der Deckelung, und bei 4 ° C im Dunkeln.
- Die Beschichtungseffizienz des OBG Fluorescein kann durch Prüfen des Emissionsspektrums mit einer Anregung bei 500 nm getestet werden. Wenn H 2 O 2 in Gegenwart von Meerrettichperoxidase (HRP) oxidiert, die Fluoreszenzintensität des oxidierten Perlen, bei Emissionspeaks (538 nm), ist die 11-12-fach höher als die der nicht-oxidierten beschichteten Perlen.
- Ernte exponentiell wachsenden Dictyostelium-Zellen aus einer 10 cm Petrischale, Platten unterschiedlicher Dichte der Zellen auf 3 cm Gerichte mit einer optisch klaren Kunststoff-oder Glasboden, und wachsen sie über Nacht. Wählen Sie die Gerichte, die etwa 80% konfluent für das Experiment sind. Ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung von Dictyostelium-Zellen wurde veröffentlicht 15.
- Ersetzen Sie das Kulturmedium mit LoFlo Medium (LF-Medium), Inkubation2 h vor dem Experiment, um die extrazellulären und intraendosomal Autofluoreszenz des HL5C Kulturmedium zu verringern.
- Parallel Schmelze 10 ml 1,5% Bacto Agar in LF Medium, gießen Sie die Agar auf eine flache Oberfläche (dh eine Glasplatte von 10 cm x 10 cm), um eine Agar-Schicht etwa 1 mm Dicke zu bilden, warten Sie 10-15 min verfestigt. Schneiden Sie die Agar-Schicht in 2 cm x 2 cm große Quadrate und in LF Medium für die spätere Verwendung.
- Unterdessen bereiten die Spinnplatte oder Weitfeldmikroskop, stellen Sie die Temperatur der Klimakammer bei 22 ° C und die Einstellungen für dieses Experiment. (Siehe weitere Kommentare in der Diskussion).
- Nach 2 Stunden Inkubation absaugen LF Medium von der 3 cm Schale, aber die Zellmonoschicht sollte noch mit einem dünnen Film des Mediums erfasst werden. Verdünnen Sie die beschichteten Kügelchen bis 1,5 x 10 7 Perlen / ml, und fügen Sie 10 ul auf die Zellschicht.
- Nehmen Sie ein Quadrat Agar Blatt, abtropfen überschüssige Flüssigkeit aber feucht halten. Sanft legte the-Agar Quadrat auf der Oberseite der Zellschicht. Den Agar-Quadrat nicht, wenn er sich auf den Zellen liegen. Die Agar-Overlay wird verwendet, um den Kontakt zwischen Perlen und Zellen zu erhöhen, wodurch die Verbesserung der Aufnahme, und es auch leicht komprimiert die Zellen, halten sie besser in der Brennebene des Objektivs.
- Setzen Sie den Deckel auf die Schüssel, legen Sie es auf den Mikroskoptisch, und automatisch Bilder in den Rot-, Grün-und Phasen Kanäle alle 1 min für 2 Stunden oder länger.
- Wählen und konzentrieren sich auf die zelluläre Ereignisse, die den gesamten Prozess der Phagozytose enthalten. Zusammenführen der drei Kanäle optimiert und montieren Sie die Bilder in einen Film mit professionellen Bildbearbeitungssoftware. Quantifizieren Fluoreszenzintensitäten von jeweils ausgewählten Perlen in rot und grün-Kanälen, und das Verhältnis von Grün / Rot wird die dynamische phagosomalen ROS-Produktion der Zellen reflektieren.
2. Quantitative und Medium-Throughput-Messung der intrazellulären Superoxid-Produktion
- Sammeln one 80% konfluent Gericht aus Dictyostelium in 10 ml HL5C Medium. Centrifuge Dictyostelium-Zellen bei 850 g für 5 min, sorgfältig und vollständig absaugen überschüssiges Medium. Die Zellen in SS6.4 Puffer [0,12 M Sorbitol in Sorensen-Puffer (14,69 mM KH 2 PO 4 und 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], zählen Zellen und zu verdünnen, um eine endgültige Dichte von 6 x 10 6 Zellen / ml (siehe weitere Kommentare in der Diskussion).
- In 50 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung einer undurchsichtigen weißen 96-Well-Platte (siehe zusätzliche Kommentare in der Diskussion).
- Verdünnen DHE Lager (30 mM in DMSO) 500-fach mit SS6.4, Pipette 50 ul verdünnte DHE in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Die Endkonzentration von DHE 30 uM. Die Reaktion beginnt sofort.
- Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten.
- Verwenden Sie den Endpunkt "top Lesen & #34; Modus eines Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 522 nm nm/605, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C
3. Quantitative und High Throughput Messung der extrazellulären H 2 O 2-Produktion
- Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in 2.1 und 2.2 beschrieben.
- Bereiten verdünnten HRP durch Zugabe von 5 ul HRP Lager (100 U / ml in destilliertem Wasser) in 10 ml SS6.4, Vortex oder das Röhrchen gut mischen und auf Eis für die spätere Verwendung zu halten. Die verdünnte Lösung ist HRP bei 0,05 U / ml.
- Bereiten Sie die AUR Reaktionsgemisch durch Mischen der AUR Lager (10 mM AUR in DMSO) und die verdünnte Lösung in HRP SS6.4 Puffer, um die endgültigen Konzentrationen von 6,25 uM und 0,005 U / ml. Als ein Beispiel, um das Reaktionsgemisch für 40 Reaktionen vorzubereiten, mischen Sie 1600 ul SS6.4 mit 400 ul der verdünnten HRP und 2,5 ul AUR-Stammlösung.
- In 50 ul AUR-Mixtur in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Nun ist die Reaktion beginnt.
- Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten.
- Verwenden Sie den Endpunkt "top Lesen"-Modus eines Fluoreszenz-Mikroplattenleser, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 530 nm nm/590, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C
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Representative Results
Die Erzeugung von ROS in Phagosomen qualitativ und dynamisch durch Mikroskopie (File S1) visualisiert werden. Die rote Fluoreszenz von Alexa Fluor 594 emittiert ist pH-unempfindlich und bleibt in der Umgebung phagosomalen konstant, während die Oxidation von OBG erhöht die Fluoreszenz im grünen Kanal. Die Emissionsspektren von in vitro oxidiert und oxidierte OBG-beschichteten Kügelchen sind in Fig. 1B verglichen wird, zeigt eine deutliche Erhöhung der Intensität nach der Oxidation. Zur Visualisierung der Live-Veranstaltungen zu erleichtern, werden die beiden Kanäle von Wildtyp AX2 Zellen innerhalb 1 min der Aufnahme zusammengeführt und die resultierende Farbe von rot auf orange während der Phagozytose. Die Zunahme der grünen Fluoreszenz zeigt ROS Generation möglicherweise direkt in der Phagosom. Durch die Verwendung eines Mikroplatten-Reader-, mittel-Durchsatz quantitative Messung der intrazellulären Superoxid-und extrazellulären H 2 O 2-Produktion in Figu gezeigtWieder 2C und 3B sind. Basal ROS-Produktion von AX2 Zellen, möglicherweise von regelmäßigen Oxido-reduktiven Stoffwechsel, kann gemessen werden. Wenn die Zellen mit LPS stimuliert, werden die Signale für die ROS-Produktion signifikant in beiden Assays erhöht. Zusätzlich ist in der DHE-Assay wird die Abnahme der blauen Fluoreszenz (Dihydroethidium) und die Zunahme der roten Fluoreszenz (Ethidiumbromid) Signale invers korreliert, wie erwartet. Die Lokalisation der ROS-Produktion sowohl von DHE und AUR-Assays gemessen in 2D und 3C bestätigt sind. Zugabe DEDTC (eine Membran permeierenden Superoxid-Dismutase (SOD)-Inhibitor) 16, erhöht die DHE Signal und verringert die AUR Signal in einer dosisabhängigen Weise, was darauf hinweist, dass DEDTC verursacht die Akkumulation des SOD Substrat Superoxid und die Erschöpfung des SOD-Produkt H 2 O 2 aus der in Fig. 2A gezeigten Reaktion erwartet. Alternativ durch Zugabe von Katalase (eine Membran impermeant H 2 O 2-Quencher), die intrazelluläre Superoxid-Signal von DHE-Test wurde nicht beeinflusst, während die extrazelluläre H 2 O 2-Signal von AUR-Test nahm in einer dosisabhängigen Weise.
Fig. 1 ist. Prinzip und Einsatz der OBG (OxyBurst Grün)-Assay. A) OBG Fluorescein und Alexa Fluor 594 sind kovalent an die Oberfläche von 3 um Silica-Kügelchen über BSA gekoppelt. Die Fluoreszenzemission von OBG Fluorescein zeigt die Oxidation durch ROS, während das Signal von Alexa Fluor 594 hilft lokalisieren die Perlen und dient als Kontrolle für Fluoreszenz Quantifizierung. B) In-vitro-Test für die Beschichtungseffizienz. H &sub2; O &sub2; und HRP werden die beschichteten Kügelchen in vitro zu oxidieren. Unter spannendeation bei 500 nm, die oxidierten Perlen zeigen eine deutliche Emissionsmaximum bei 538 nm im Vergleich zu der nicht-oxidierte Perlen, mit einem Intensitätsverhältnis von mindestens 11 bis 12 fache.
2. Prinzip und die Nutzung der DHE (Dihydroethedium)-Assay. A) Zusammenfassung der biochemischen Reaktionen zu DHE und AUR-Assays. B) im Cytosol Zusammenhang weist die Membran permeierenden DHE Anregungs-und Emissionspeaks bei 370/420 nm bestimmt. Als Ergebnis der Oxidation von Superoxid ist Ethidium Lage, in Kern-und Mitochondrien-DNA interkalieren und hat Anregungs-und Emissionspeaks bei 522/605 nm verschoben sind. Die Fluoreszenzintensität der Ethidium entspricht der Menge an Superoxid-Produktion in den Zellen. C) Ein repräsentatives Experiment zeigt, daß, wenn sie mit LPS stimuliert, die dynamische Super-Produktion von AX2 Zellen signifikant höher ist als das Grundniveau von nicht stimulierten Zellen AX2 und dem Hintergrund der Reaktionspuffer. Die Abnahme der blauen Fluoreszenz und die Zunahme der roten Fluoreszenz invers korreliert, wie erwartet. D) bei mit verschiedenen Konzentrationen von DEDTC (eine Membran permeierenden Superoxiddismutase-Inhibitor), der Steigung (RFU / min) Ethidium Produktionssteigerung in einer Dosis behandelten abhängig, während der Behandlung mit Katalase (ein Membran impermeante H 2 O 2 Quencher) hat keinen Einfluss auf die Produktion von Superoxid. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
3. Prinzip und Einsatz des AUR (Amplex UltraRed)-Assay. A) Die Membran impermeante AUR ca.n in ihre fluoreszierenden Resorufin Form AUR-ox, mit H 2 O 2 in Gegenwart einer Peroxidase (Anregungs-und Emissionspeaks bei 530 und 590 nm) oxidiert werden. Die Fluoreszenzintensität von AUR-ox entspricht der Menge an H 2 O 2 außerhalb der Zellen B). Produziert Ein repräsentatives Experiment zeigt, daß, wenn sie mit LPS stimuliert, O 2-Produktion von Zellen AX2 ist die dynamische H 2 deutlich höher als die basale Pegel von nicht stimulierten Zellen AX2 und die Hintergrundreaktion. C) Wenn mit verschiedenen Konzentrationen von DEDTC oder Katalase, die Steigung (RFU / min) von AUR-ox Produktion sinkt in einer Dosis-abhängigen Weise, durch die Hemmung der H 2 O 2 behandelt Produktion von intrazellulären Superoxid und Erschöpfung der extrazellulären H 2 O 2. Klicken Sie hier, um zu vergrößernFigur.
Datei S1. Film von dynamischen phagosomalen ROS-Produktion in Dictyostelium-Zellen. Die Zeitraffer-Film wurde für 40 min mit dem Live-Mikroskopie aufgenommen, mit einem 60X Vergrößerung. In der ersten Minute nach der Aufnahme durch Phagozytose, die Fluoreszenz von Fluorescein OBG-beschichteten Perlen geändert von rot zu hell orange, die anzeigt, dass ROS wurden wahrscheinlich direkt in den Phagosomen produziert. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
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Discussion
Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Verfahren, das OBG-Assay visualisiert dynamisch den Prozess der phagosomalen ROS auf Einzelzellebene, anstelle der Messung einer durchschnittlichen ROS Signal von einer Population von Zellen. Solche Bevölkerungs-Mittelungsverfahren neigen dazu, wichtige Informationen von nicht-synchronen Phagozytose verursacht verschleiern. Wir haben erfolgreich DHE und AUR Assays Dictyostelium angepasst und optimiert die Protokolle. Am wichtigsten ist, wir die angegebenen Typen und subzellulärer Lokalisierungen von ROS durch diese beiden Assays gemessen. Zusammengenommen, die ganze Reihe von ROS Messprotokolle für Dictyostelium bietet einen nützlichen und leistungsfähiges System zur ROS-bezogenen zellulären Mechanismen, wie der angeborenen Immunität, Zelldifferenzierung und intrazelluläre Signal studieren.
Zur OBG Assay ist die Herstellung von beschichteten Kügelchen für den Erfolg des Experiments. Aufgrund der Komplexität der Rezeptor-vermittelten Phagozytose in Säugetierenn-Zelle, müssen die Teilchen (zB mit IgG) opsonisiertes der Einnahme auszulösen. Low Aufnahmeeffizienz in Säugerzellen schränkt die Visualisierung der einzelnen Ereignisse des phagosomalen ROS-Generation. Die Rate der Phagozytose in Dicytostelium beobachtet worden zu sein, 10 bis 20-fach höher als in einem Makrophagen-17, und mit der vorliegenden Protokoll erhalten wir robuste und effiziente Phagozytose ohne jede Konjugation Opsonin auf die Perlen. Dies vereinfacht nicht nur den Wulst-Beschichtungsverfahren, sondern reduziert die Risiken der Oxidation des OBG Fluorescein-Farbstoff während der Manipulation. Seit OBG Fluorescein kann durch Licht und Sauerstoff oxidiert werden kann, hat das Reagenz Einwirkung von Umgebungslicht und Luft so weit wie möglich geschützt werden (z. B. Aluminiumfolie verwenden, um das Rohr zu decken, und füllen Sie das Rohr mit Stickstoff oder einem anderen Inertgas), insbesondere für die Langzeitlagerung.
Für die Live-Darstellung können die Zellen auf verschiedene Gerichte mit optisch c plattiert werdenLear Böden. Während Dictyostelium haftet etwas besser aus Kunststoff, die meisten Säugetierzellen (siehe unten) halten genauso gut auf Glas. Ein weiterer wichtiger Schritt für eine optimale Bildgebung ist es, Dictyostelium-Zellen für mindestens 2 Stunden, bevor Sie mit der Abbildungs Schritte Inkubation in LF-Medium (niedrige Fluoreszenzhintergrund). Da der Hintergrund grün Fluoreszenzsignal des Kulturmediums (HL5C) muss von ihrem Endosomen aufgebraucht werden, um Interferenzen mit dem von oxidierten beschichteten Perlen erzeugte Signal zu vermeiden. Wir empfehlen, die Durchführung mindestens einer Pilotversuch, um die Einstellungen des Mikroskops (zB Laserintensität, Belichtungszeit, etc.) zu optimieren, vor allem für den grünen Kanal. Die Perlen emittieren ständig starke rote Fluoreszenz während des gesamten Experiments, aber die grüne Fluoreszenz erhöht bei der Reaktion mit ROS unmittelbar nach Phagozytose und Hochebenen innerhalb von 5-10 min. Daher ist es besser, die Einstellungen für die g einzustellenrüne Kanal am Ende des Experiments, wenn die grüne Fluoreszenz von den meisten der Perlen kann vollständig dargestellt werden. Sobald die Einstellungen optimiert sind, speichern Sie sie für zukünftige Experimente, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Während der OBG-Assay, sollten gesunde Zellen ihre Zufalls Motilität und nicht weiter abrunden. Ansonsten ist dies indikativ für Zellschäden, die entweder durch die Trocknung des Agar oder übermäßige Laserintensität verursacht werden können. Halten Sie deshalb genügend Flüssigkeit auf dem Agar-Overlay für die Dauer des gesamten Experiments und halten die Laserintensität und die Belichtungszeit so gering wie möglich auch.
In den AUR und DHE-Assays, die Steigung der Fluoreszenzmesskurven zeigt eine Dosis-abhängige Beziehung zu der Menge an Zellen in jeder Vertiefung innerhalb eines bestimmten Bereiches verwendet. Um die am besten reproduzierbaren Ergebnisse zu erzielen, ist es wesentlich, identische Anzahl von Zellen für jede Bedingung des Experiments verwendet. Zusätzlichaufgrund von Schwankungen der Zellengröße zwischen verschiedenen Zelltypen, ist es sehr empfohlen, daß in den Pilotversuchen verschiedenen Verdünnungen getestet, um eine Zellmonoschicht nach der Befestigung am Vertiefungsboden zu erhalten. Für Dictyostelium Zellen AX2, 3 x 10 5 Zellen eine Monoschicht bilden, und das Zelldichte gilt auch für viele andere Dictyostelium Wildtyp-und Mutantenstämmen. Um eine genaue Zellzahl zu erhalten, ist es am besten, nach dem Zentrifugieren zählen, nicht vor, da die Zentrifugation und Resuspension Pellet Schritte können einige Zellverlust führen. Wir verwenden eine automatische Zellzähler nach Resuspendieren des Zellpellets count (funktioniert am besten mit Zelldichten von über 6 x 10 6 Zellen / ml) und dann genau die Zellproben zu verdünnen, um 6 x 10 6 Zellen / ml.
Für die DHE und AUR-Assays könnten niedrige Signale aufgrund der Verwendung von nicht optimalen 96-Well-Platten sein und daher empfehlen wir die Verwendung nicht-transparenten weißen 96-Well-Platten. Im Vergleich zu schwarz oder transparentHNO Platten wird die aufgenommenen Fluoreszenzsignal durch Reflexion auf der weißen Oberfläche verstärkt, eine starke Erhöhung des Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Der Nachteil der nicht-transparenten weißen Platten, manchmal können starke Fluoreszenz-Signale in benachbarten Vertiefungen austreten. Allerdings mit 100 ul Reaktionsvolumen und der beschriebenen Sondenkonzentration, wir hatten keine undichten Signal sowohl DHE und AUR Assays. Darüber hinaus empfehlen wir die Durchführung einige Pilotversuche, um die Empfindlichkeit der Fluoreszenz-Plattenlesegerät zu optimieren. Unter der SynergyMX Plattenlesegerät als Beispiel, Empfindlichkeit 100 und 70 am besten für den DHE und AUR-Assay auf. Darüber hinaus ist es notwendig, die spezifische Anregungs-und Emissionsspektren in den Bedingungen des Experiments, mit Zellen zu überwachen. Tatsächlich haben wir eine Verschiebung des Emissionsmaximums für AUR bis 590 nm, verglichen mit den 581 vom Hersteller genannten nm beobachtet. Schließlich erhalten wir etwas bessere Ergebnisse durch Anregung bei 530 nm statt 568nm vom Hersteller vorgeschlagen.
Im Vergleich zu einem AUR-Stammlösung ist die DHE-Stammlösung viel anfälliger für Oxidation, auch wenn sie von Licht bei -20 ° C geschützt So ist es besser, die DHE Lager innerhalb von 10 Tagen nach der Auflösung verwenden aus Pulver. Wenn die Farbe der Stammlösung wechselt von grau auf lila oder pink, entsorgen Sie sie und bereiten frisch aus Pulver 18.
Im AUR-Assay kann sowohl AUR und HRP von Makropinozytose genommen werden. Somit das Fluoreszenzsignal infolge Oxidation durch H 2 O 2 kann auch teilweise in den macropinosomes erzeugt werden. Da die AUR und HPR nicht Zellmembranen zu durchdringen, ist jedoch das Signal von der AUR-Assay innerhalb der macropinosomes gemessen noch topologisch äquivalent zu einem extrazellulären Signal, im Gegensatz zu einer im Cytosol erzeugte Signal.
Basierend auf einer Reihe von Vorversuchen für beide DHE und AUR-AssaysEs erscheint wichtig, eine einfache Puffer, der nicht Glucose oder anderen biologischen Medien-Komponenten enthält, zu verwenden, da sie stark mit beiden Assays stören und zu einer hohen Artefaktfluoreszenzsignal. Daher verwenden wir Sorensen Phosphat-Puffer mit 0,12 M Sorbit, einem unverdaulichen Osmolyt verwendet werden, um eine Osmolarität ähnlich der Dictyostelium Kulturmedium 19 ergänzt. Beachten Sie, dass der hohe Salzgehalt der iso-osmotischen Puffer für Säugerzellen verwendet werden, wie beispielsweise PBS, beeinträchtigt Dictyostelium.
Die hier vorgestellten Protokolle nicht messen können alle möglichen ROS, wie Hypochlorit, Hydroxyl-Radikale und Singulett-Sauerstoff, und ihre subzelluläre Lokalisationen. Ein umfassenderes Bild der ROS-Generation wird immer noch von der Verfügbarkeit und der Entwicklung von spezifischen Sonden begrenzt.
Dieser Satz von Protokollen kann leicht auf andere Zellen, einschließlich Säuger Phagozyten angepasst werden, mit der folgenden modification. Beispielsweise in der OBG-Assay-Medium ohne FCS und Phenolrot verwendet werden, um eine niedrige Hintergrund-Fluoreszenz zu erhalten. In DHE und AUR-Assays können PBS-Puffer anstelle von SS6.4 verwendet werden, und die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung plattiert, um eine konfluente Schicht erhalten kann empirisch angepaßt werden, je nach ihrer Größe. Die Konzentrationen von HRP, AUR und DHE kann auch in Pilotversuche, um die empfindlichsten Ergebnisse zu erzielen optimiert werden. Allerdings sollten mögliche Nebenwirkungen bei der Verwendung von DMSO erhöhte Konzentrationen von AUR und / oder DHE Reagenzien getestet werden. Wir haben getestet und DHE AUR-Tests erfolgreich mit einem anderen Protozoen, Acanthamoeba castellanii und mit einer Maus BV2 Mikroglia-Zelllinie. Darüber hinaus kann der DHE und AUR-Assays auch zur ROS-Erzeugung während Wirt-Pathogen-Interaktionen zu messen, beispielsweise während der Infektion von Dictyostelium oder Acanthamoeba durch Mykobakterien marinum werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Dr. Karl-Heinz Krause und Vincent Jaquet um Hilfe und Rat, diese Protokolle einzurichten, und danke auch Christoph Bauer und Jérôme Bosset vom Bioimaging Plattform des NFS und Dr. Navin Gopaldass für ihre technische Unterstützung. Die Forschung wird von einem ProDoc Erteilung des Schweizerischen Nationalfonds unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx | |
References
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