Détection, visualisation et la quantification de la production d'espèces réactives de l'oxygène dans un système modèle Amoeba

Summary

Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives.

Abstract

Espèces réactives de l'oxygène (ROS) comprennent une gamme de molécules contenant de l'oxygène réactif et de courte durée, qui sont dynamiquement interconvertis ou éliminées soit catalytique ou spontanément. En raison de la durée de vie courte de la plupart des ROS et la diversité de leurs sources et localisations subcellulaires, une image complète peut être obtenue que par des mesures précises en utilisant une combinaison de protocoles. Ici, nous présentons un ensemble de trois protocoles différents à l'aide OxyBurst vert (OBG) revêtu perles, ou dihydroethidium (DHE) et Amplex Ultrared (AUR), de suivre qualitativement et quantitativement différents ROS dans les phagocytes professionnels tels que Dictyostelium. Nous avons optimisé les procédures de revêtement de perles et perles occasion OBG-enduits et microscopie en direct de visualiser dynamiquement intraphagosomal génération de ROS au niveau d'une seule cellule. Nous avons identifié le lipopolysaccharide (LPS) de E. coli comme un puissant stimulateur de la production de ROS dans Dictyostelium. En outre, nous Dtemps réel eveloped, essais à moyen débit utilisant DHE et AUR à mesurer quantitativement dismutase intracellulaire et H ₂ O ₂ de production extracellulaire, respectivement.

Introduction

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont impliqués dans une grande variété de processus biologiques tels que la défense de l'hôte, la signalisation, le développement tissulaire et réponse à la lésion, ainsi que l'hypertension artérielle et du cancer. Le mécanisme de la NADPH oxydase phagosome bien étudié est dédié à la génération de ROS rapide, connu sous le burst oxydatif, pour tuer les bactéries ingérées dans les phagosomes de neutrophiles ^1. En outre, les fuites d'électrons comme un sous-produit de la chaîne respiratoire mitochondriale a déjà été pensé pour être responsable que d'une source non réglementée de ROS. Mais récemment, il a été identifié comme un mécanisme important pour contribuer à la mise à mort intraphagosomal de bactéries dans les macrophages de souris ^2. Au cours des dernières années, l'amibe sociale, Dictyostelium, est devenu un modèle puissant et populaire pour étudier les mécanismes intrinsèques cellulaires de la réponse immunitaire innée. En effet, Dictyostelium et phagocytes humains partagent un niveau étonnamment élevé de conservation dans moleculales mécanismes responsables de la détection des bactéries, l'engloutissement et tuer ^3,4 r. Les homologues des protéines et des enzymes liées à la production ou à la détoxification des ROS, tel que NADPH oxydases, les catalases, les superoxyde dismutases, peuvent être trouvés à la fois humaine et de Dictyostelium. Comme l'amibe mieux étudié, Dictyostelium présente plusieurs avantages uniques sur le système de modèle de mammifère. Ils se développent à la température ambiante sans la nécessité pour le CO _2, avec un temps de doublement de 8-10 h. Ils peuvent être facilement conservées sous forme de cultures adhérentes ou en suspension. En outre, grâce à leur génome haploïde entièrement séquencé et annoté, et à la manipulation génétique facile, Dictyostelium est devenu un modèle expérimental très attrayant organisme.

Dans des études antérieures, divers dérivés chlorés et fluorés de fluorescéine (collectivement connu sous le nom OxyBurst Green, OBG) qui émettent une fluorescence après oxydation par ROS, ont été utilisés en tant que reporter ROS. Cellulaire infiltrant intérêtdérivés erified sont utilisés pour mesurer cytoplasmique ROS, alors-ou les dérivés du dextran couplés aux protéines cellulaires imperméant sont utilisés pour mesurer extracellulaire ROS. En particulier, des perles OBG BSA revêtues ont déjà été utilisés pour détecter la production de ROS phagosomale dans les cellules de mammifères ^5. Cependant, l'approche basée sur lecteur microplaque ne peut donner une courbe de génération de ROS moyenne d'une population de cellules. Avec le présent protocole, en utilisant Dictyostelium, un phagocyte professionnel, et les conditions expérimentales optimisées, nous obtenons la phagocytose stable et efficace sans la conjugaison tout opsonine sur les billes. DHE a été utilisée dans divers systèmes modèles, tels que les neutrophiles et les macrophages de mammifères, pour détecter la production de ROS ^9.6. Pendant ce temps, il ya des controverses sur la spécificité et la sensibilité de la méthode ^8,10. Comme une version améliorée de Amplex Red, l'intensité de fluorescence de AUR est moins sensible au pH, ce qui le rend plus approprié pour mesurerROS dans les milieux non-neutres ou faiblement acides. AUR a récemment été appliquée dans plusieurs systèmes de mammifères ^11,12, mais son utilisation dans les modèles non-mammifères, qui nécessitent souvent des milieux de croissance faiblement acide, n'a pas encore été signalé. En outre, il n'existe pas de protocole publié à mesurer quantitativement et dynamiquement la production de ROS et la localisation dans l'amibe sociale Dictyostelium.

Le but du jeu présenté des protocoles est de fournir une solution simple et souple pour surveiller divers ROS et leur localisation, et en outre donner un aperçu des mécanismes cellulaires ROS-liés. Pour le dosage OBG, nous avons utilisé la microscopie en direct pour surveiller l'ensemble du processus de génération de ROS phagosome après absorption de perles OBG revêtues par des cellules Dictyostelium, et proposons une nouvelle approche pour étudier le mécanisme de destruction intraphagosomal de bactéries. Nous avons optimisé moyen débit DHE et AUR essais dans Dictyostelium, pour mesurer superoxyde intracellulaireide et de H ₂ O ₂ extracellulaire production, respectivement, à l'aide de LPS comme un stimulateur puissant de ROS. Notez que le LPS a été récemment montré pour augmenter l'activité bactéricide de Dictyostelium vers bactéries phagocytées ^13. En outre, le traitement par DEDTC et de la catalase a confirmé explicitement que ces deux méthodes mesurent spécifiquement différents types et localisations subcellulaires de ROS dans Dictyostelium. Enfin, le dosage OBG peut être adapté à n'importe quelle cellule phagocytaire adhérente, par opsonisation en outre les perles avec des ligands pour les récepteurs phagocytaires des cellules animales. En principe, les tests DHE et AUR peuvent également être affiné pour les mesures dans une cellule adhérente ou non adhérente dans des conditions expérimentales appropriées.

Protocol

Une. Visualisation et de mesure qualitative de la production de ROS dans phagosomes

Les perles OBG enduits doivent être préparés à l'avance. Les procédures de revêtement de perles et technique de gélose sont adaptés de références publiées ^5,14.

1. Ajouter 1 ml de la suspension de 3,0 um billes de silice carboxylés (environ 1,8 x 10 ⁹ billes) dans un tube de 1,5 ml, laver les billes 3 fois avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et tourbillonnement.
2. Remettre en suspension les billes dans 1 ml de PBS contenant 25 mg / ml de cyanamide (pour activer les perles de silice se lient de manière covalente à carboxylés préalablement marqué BSA), sur une roue incuber pendant 15 min.
3. Laver 3 fois avec 1 ml de tampon de couplage (0,1 borate de sodium M, pH 8,0) par rotation rapide (centrifugeuse à pleine vitesse dans un dessus de table mini-centrifugeuse pendant 5 secondes ou encore centrifuger à 2000 g pendant 1 min dans une centrifugeuse de table) et vortex pour enlever l'excès de cyanamide.
4. Mélanger les billes lavées avec 500 ul de ctampon contenant 1 mg de OxyBurst vert (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA oupling, remplir le tube avec de l'azote gazeux à partir d'une norme gaz peut avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 14 heures (la nuit) à la température ambiante dans l'obscurité.
5. Laver les billes avec 2x 1 ml de tampon de trempe (250 mM de glycine dans du PBS) pour éliminer OBG n'ayant pas réagi, et deux fois avec du tampon de couplage pour éliminer le tampon de trempe par rotation rapide et tourbillonnement.
6. Ajouter 1 ml de tampon de couplage contenant 50 pg de l'Alexa Fluor 594 ester de succinimidyle de conjuguer à la BSA. Remplir le tube avec de l'azote avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 1,5 heure à température ambiante dans l'obscurité.
7. Laver les perles 3x avec 1 ml de tampon trempe par tour rapide et vortex pour arrêter la réaction, puis lavez les perles 3x avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et vortex.
8. Enfin, la remise en suspension des billes dans 1 ml de PBS avec 2 ul de 10% p / v d'azide de stockage à long terme. Mesurer la concentration des perles dans la suspension avec un hématimètre (généralement autour de 1-2 x 10 ⁹ billes / ml), remplir le tube avec de l'azote avant plafonnement, et conserver à 4 ° C dans l'obscurité.
9. L'efficacité du revêtement de la fluorescéine OBG peut être testée en contrôlant le spectre d'émission en utilisant une excitation à 500 nm. Lorsqu'il est oxydé par H ₂ O ₂ en présence de peroxydase de raifort (HRP), l'intensité de fluorescence des billes oxydées, au pic d'émission (538 nm), est de 11-12x plus élevée que celle des billes revêtues non oxydés.
10. Récolte croissance exponentielle des cellules Dictyostelium d'une boîte de 10 cm de Pétri, plaque différentes densités de cellules sur 3 cm plats avec un plastique optiquement transparent ou à fond de verre, et les cultiver pendant la nuit. Choisissez les plats qui sont environ 80% de confluence de l'expérience. Un protocole détaillé pour cultiver des cellules Dictyostelium a été publié ^{le 15.}
11. Remplacez le milieu de culture avec un milieu LoFlo (milieu de LF), incuber pendant2 heures avant l'expérience, afin de diminuer l'auto-fluorescence extracellulaire et intraendosomales du milieu de culture de HL5C.
12. En parallèle, faire fondre bacto agar 10 ml de 1,5% en milieu LF, verser l'agar sur une surface plane (une plaque de verre de 10 cm x 10 cm) pour former une couche d'agar environ 1 mm d'épaisseur, attendre 10-15 min se solidifier. Couper la couche d'agar dans 2 cm x 2 cm carrés et placer dans un milieu LF pour une utilisation ultérieure.
13. Pendant ce temps, préparer le disque tournant ou large microscope de champ, régler la température de la chambre de l'environnement à 22 ° C et ajuster les paramètres de cette expérience. (Voir les commentaires supplémentaires dans la discussion).
14. Après 2 h d'incubation, aspirer le milieu de la LF à partir de 3 cm plat, mais la monocouche cellulaire doit toujours être recouvert d'une mince pellicule de support. Diluer les billes revêtues à 1,5 x 10 ⁷ perles / ml et ajouter 10 ul sur la couche cellulaire.
15. Prenez une feuille agar carré, drainer l'excès de liquide mais garder humide. Placez délicatement ee agar carré sur le dessus de la couche de cellules. Ne pas déplacer le carré agar quand il est couché sur les cellules. La gélose est utilisée pour augmenter le contact entre les billes et les cellules, ce qui améliore l'absorption, et elle comprime légèrement les cellules, en les maintenant mieux dans le plan focal de l'objectif.
16. Placer le couvercle sur le plat, placez-le sur la platine du microscope, et automatiquement prendre des photos dans les canaux rouge, vert et de phase chaque 1 min pendant 2 heures ou plus.
17. Sélectionner et se concentrer sur les événements cellulaires qui contiennent l'ensemble du processus de phagocytose. Fusionner les 3 canaux optimisés et assembler les images dans un film en utilisant un logiciel professionnel de traitement d'image. Quantifier l'intensité de fluorescence de chaque perles choisies dans les canaux rouge et vert, et le rapport de vert / rouge reflète la dynamique phagosome la production de ROS des cellules.

2. Quantitative et moyen débit Mesure de la production de superoxyde intracellulaire

1. Recueillir o80% ne plat confluent de Dictyostelium dans 10 ml de milieu de HL5C. Cellules Centrifugeuse Dictyostélium à 850 g pendant 5 min, avec soin et excès du milieu aspirer complètement. Resuspendre les cellules dans un tampon de SS6.4 [0,12 M de sorbitol dans le tampon Sorensen (14,69 mM KH ₂ PO ₄ et 6,27 mM Na ₂ HPO _4), pH 6,4], compter les cellules et diluer à une densité finale de 6 x 10 ⁶ cellules / ml (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion).
2. Ajouter 50 pi de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits opaque blanc (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion).
3. Diluer DHE actions (30 mM dans le DMSO) 500 fois avec SS6.4, pipette 50 ul de dilution DHE dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux si nécessaire. La concentration finale de la DHE est de 30 uM. La réaction commence immédiatement.
4. Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d'autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques.
5. Utilisez le point final "top lecture & #34, le mode d'un lecteur de microplaques à fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 522 nm nm/605, lire toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C.

3. Quantitatif à haut débit et la mesure de extracellulaire H ₂ O ₂ Production

1. Suivez les mêmes étapes décrites à la section 2.1 et 2.2.
2. Préparer HRP dilué par addition de 5 pi de HRP actions (100 U / ml dans l'eau distillée) dans 10 ml de SS6.4, vortex ou inverser le tube pour bien mélanger et garder sur la glace pour une utilisation ultérieure. La solution HRP dilué est de 0,05 U / ml.
3. Préparer le mélange réactionnel en mélangeant l'AUR AUR magasin (AUR 10 mM dans du DMSO) et la solution HRP dilué dans du tampon de SS6.4 aux concentrations finales de 6,25 uM, et 0,005 U / ml, respectivement. Par exemple, pour préparer le mélange de réaction pendant 40 réactions, mélanger 1 600 pi de SS6.4 avec 400 pi de HRP dilué et 2,5 pi de AUR solution stock.
4. Ajouter 50 ul de mélange AURture dans chaque puits en utilisant une pipette à canaux multiples, si nécessaire. Maintenant, la réaction démarre.
5. Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d'autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques.
6. Utilisez le point le mode de fin "haut de lecture" d'un micro lecteur de plaque de fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 530 nm nm/590, lisez toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C.

Representative Results

La génération de ROS dans les phagosomes peut être visualisé qualitativement et de façon dynamique par microscopie (S1 du fichier). La fluorescence rouge émise par Alexa Fluor 594 est insensible au pH et reste constante dans le milieu de phagosome, tandis que l'oxydation de OBG augmente sa fluorescence dans le canal vert. Les spectres d'émission de oxydé in vitro et non oxydés OBG perles revêtues sont comparées sur la figure 1B, montrant une augmentation significative de l'intensité après l'oxydation. Pour faciliter la visualisation des événements en direct, les deux canaux sont fusionnés et les modifications de la couleur résultant du rouge à l'orange pendant la phagocytose par les cellules de type sauvage dans AX2 1 min de l'absorption. L'augmentation de la fluorescence verte indique que la production des ROS éventuellement directement dans le phagosome. En utilisant un lecteur de microplaques, débit moyen mesure quantitative de la superoxyde intracellulaire et extracellulaire H ₂ O ₂ la production sont présentées dans Figure 2C et la figure 3B, respectivement. Production basale de cellules de ROS AX2, éventuellement à partir de métabolisme oxydo-réductrice régulier, peut être mesurée. Lorsque les cellules sont stimulées avec du LPS, les signaux pour la production de ROS sont significativement augmentés dans les deux essais. En outre, dans l'essai de DHE, la diminution de la fluorescence bleue (dihydroethidium) et de l'augmentation de signaux d'éthidium (fluorescence rouge) sont inversement corrélées, comme prévu. La localisation de la production de ROS mesurée à la fois par DHE et analyses AUR sont confirmés à la figure 2D et la figure 3C, respectivement. L'addition de DEDTC (une membrane de perméation de la superoxyde dismutase (SOD) d'inhibiteur) ^16, a augmenté le signal de DHE et une diminution du signal AUR d'une manière dépendante de la dose, ce qui indique que DEDTC a provoqué l'accumulation de la dismutase de substrat de la SOD et de l'épuisement du produit de SOD H ₂ O ₂ attendu de la réaction représentée sur la figure 2A. Alternatively, par l'addition de catalase (a imperméant de la membrane H ₂ O ₂ quencher), le signal de dismutase intracellulaire de DHE dosage n'a pas été affecté, alors que le H ₂ O ₂ extracellulaire de signal de test AUR a diminué d'une manière dépendant de la dose.

Figure 1. Principe et l'utilisation de l'analyse OBG (OxyBurst vert). A) fluorescéine et de OBG Alexa fluor 594 sont couplés de manière covalente à la surface de 3 um billes de silice par l'intermédiaire de BSA. L'émission de fluorescence de la fluorescéine OBG indique l'oxydation par les ROS, tandis que le signal provenant de l'Alexa Fluor 594 aide à localiser les perles et sert de témoin pour la quantification de fluorescence. B) Test in vitro pour l'efficacité du revêtement. H ₂ O ₂ et HRP sont utilisés pour oxyder les billes revêtues in vitro. Sous passionnanttion à 500 nm, les billes oxydées montrent un pic d'émission à 538 nm significative par rapport à celle des perles non oxydés, avec un rapport d'intensité d'au moins 11 à 12 fois.

Figure 2. Principe et l'utilisation de l'analyse DHE (Dihydroethedium). A) Résumé des réactions biochimiques liés à la DHE et AUR essais. B) dans le cytosol, la membrane de perméation DHE a excitation et d'émission des pics à 370/420 nm, respectivement. À la suite de l'oxydation par le superoxyde, éthidium est capable de s'intercaler dans l'ADN nucléaire et mitochondrial et s'est déplacée excitation et d'émission des pics à 522/605 nm, respectivement. L'intensité de fluorescence de l'éthidium correspond à la quantité de la production de superoxyde dans les cellules. C) Une expérience représentative montre que, lorsqu'ils sont stimulés avec du LPS, le super dynamiquela production d'oxyde à partir de cellules AX2 est significativement plus élevé que le niveau de base à partir de cellules non stimulées et AX2 de l'arrière-plan de la réaction dans le tampon. La diminution de la fluorescence bleue et l'augmentation de la fluorescence rouge sont inversement corrélées comme prévu. D) Lorsqu'ils sont traités avec diverses concentrations de DEDTC (un inhibiteur de la superoxyde dismutase de perméation de la membrane), la pente (RFU / min) d'éthidium augmentation de la production d'une dose- dépendante, tandis que le traitement avec la catalase (un imperméant de membrane H ₂ O ₂ extincteur) n'affecte pas la production de superoxyde. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Principe et l'utilisation de l'analyse AUR (Amplex Ultrared). A) La membrane imperméant AUR can s'oxyder en sa forme fluorescente résorufine, AUR-ox, par H ₂ O ₂ en présence d'une peroxydase (excitation et d'émission des pics à 530 et 590 nm, respectivement). L'intensité de fluorescence de AUR-ox correspond à la quantité de H ₂ O ₂ produit à l'extérieur de la cellule. B) Une expérience représentative montre que, lorsqu'ils sont stimulés avec du LPS, l'H dynamique ₂ O ₂ la production à partir de cellules AX2 est significativement plus élevé que la base niveau de cellules AX2 non stimulées et la réaction d'arrière-plan. C) Lorsqu'ils sont traités avec diverses concentrations de DEDTC ou la catalase, la pente (RFU / min) de AUR-ox production diminue d'une manière dose-dépendante, en raison de l'inhibition de l'H ₂ O ₂ production de superoxyde intracellulaire et extracellulaire épuisement de H ₂ O _2, respectivement. Cliquez ici pour agrandirfigure.

Déposer S1. Film de dynamique de production phagosome ROS dans les cellules Dictyostelium. Le film en time-lapse a été enregistrée pendant 40 minutes par microscopie en temps réel, en utilisant un grossissement 60X. Au cours de la première minute après l'absorption par phagocytose, la fluorescence de la fluorescéine OBG perles enrobées changé du rouge au orange vif, indiquant que les ROS sont probablement produit directement à l'intérieur des phagosomes. Cliquez ici pour voir le film .

Discussion

Par rapport aux procédés décrits précédemment, le dosage OBG visualise dynamiquement le processus de génération de ROS phagosome au niveau de la cellule unique, au lieu de mesurer un signal moyen ROS partir d'une population de cellules. Ces méthodes population moyennes ont tendance à occulter des informations critiques causés par phagocytose non synchrone. Nous avons adapté avec succès DHE et AUR essais de Dictyostelium et optimisé les protocoles. Plus important encore, nous avons précisé les types et localisations subcellulaires de ROS mesurées par ces deux essais. Dans l'ensemble, l'ensemble des protocoles de mesure ROS pour Dictyostelium fournit un système puissant et utile pour étudier les mécanismes cellulaires ROS-connexes, tels que l'immunité innée, la différenciation cellulaire et la signalisation intracellulaire.

Pour le dosage OBG, la préparation de billes revêtues est critique pour le succès de l'expérience. En raison de la complexité de l'absorption phagocytaire médiée par les récepteurs chez les mammifèresn cellules, les particules doivent être opsonisé (par exemple avec des IgG) pour déclencher l'ingestion. Faible efficacité d'absorption dans les cellules de mammifères limite sévèrement la visualisation des événements individuels de production de ROS phagosome. Le taux de phagocytose dans Dicytostelium a été observée à 10-20 fois plus élevée que dans un macrophage ^17, et avec le présent protocole, nous avons obtenu la phagocytose robuste et efficace sans la conjugaison de tout opsonine sur les billes. Ceci non seulement simplifie la procédure de revêtement par bourrelet, mais réduit les risques d'oxydation du colorant de fluorescéine OBG au cours de la manipulation. Depuis OBG fluorescéine peut être oxydé par la lumière et de l'oxygène, le réactif doit être protégé de l'exposition à la lumière ambiante et de l'air autant que possible (par exemple, utiliser une feuille d'aluminium pour couvrir le tube, et remplir le tube avec de l'azote ou un autre gaz inerte), en particulier pour le stockage à long terme.

Pour l'imagerie en temps réel, les cellules peuvent être étalées sur plusieurs plats avec c optiquementfonds Lear. Alors que Dictyostelium adhère un peu mieux au plastique, la plupart des cellules de mammifères (voir ci-dessous) adhèrent aussi bien au verre. Une autre étape importante pour l'imagerie optimale consiste à incuber les cellules dans un milieu de Dictyostelium LF (faible fluorescence de fond) pendant au moins 2 heures avant de procéder aux étapes de formation d'image. Étant donné que le signal de fluorescence verte de l'arrière-plan du milieu de culture (HL5C) doit être appauvri de leurs compartiments endosomiques pour éviter toute interférence avec le signal généré à partir de billes revêtues oxydés. Nous vous recommandons également de réaliser au moins une expérience pilote pour optimiser les réglages du microscope (par exemple de l'intensité laser, temps d'exposition, etc), en particulier pour le canal vert. Les billes émettent constamment forte fluorescence rouge pendant toute l'expérience, la fluorescence verte mais augmente lors de la réaction avec ROS immédiatement après la phagocytose et les plateaux à l'intérieur de 5 à 10 min. Il est donc préférable d'ajuster les paramètres de la gert canal à proximité de la fin de l'expérience lors de la fluorescence verte de la plupart des perles peut être visualisé entièrement. Une fois que les paramètres sont optimisés, enregistrez-le pour de futures expériences afin d'obtenir des résultats reproductibles.

Au cours de l'essai OBG, les cellules saines devraient continuer leur motilité aléatoire et pas arrondir. Dans le cas contraire, il s'agit d'un indicateur d'endommagement de la cellule, qui peut être provoquée soit par le séchage de la couche de gélose ou de l'intensité du laser excessive. Par conséquent, garder suffisamment liquide sur la couche d'agar pour la durée de l'ensemble de l'expérience et également maintenir l'intensité du laser et le temps d'exposition la plus faible possible.

Dans les dosages AUR et DHE, la pente des courbes de fluorescence de lecture indique une relation dose-dépendante de la quantité de cellules utilisée dans chaque puits à l'intérieur d'une certaine plage. Pour atteindre les résultats les plus reproductibles, il est indispensable d'utiliser un nombre identique de cellules pour chaque condition d'une expérience. En outre,due à des variations de la taille des cellules entre différents types cellulaires, il est fortement suggéré que pendant les expériences pilotes, différentes dilutions sont testées afin d'obtenir une monocouche cellulaire après la fixation au fond du puits. Pour les cellules de Dictyostelium AX2, 3 x 10 ⁵ cellules forment une monocouche et cette densité cellulaire s'applique également à beaucoup d'autres de type sauvage et mutantes souches Dictyostelium. Afin d'obtenir le nombre de cellules précises, il est préférable de compter après centrifugation, pas avant, car la centrifugation et à granulés étapes de remise en suspension peuvent causer une certaine perte de cellules. Nous utilisons un compteur de cellules automatisé pour compter, après remise en suspension du culot de cellules (qui fonctionne le mieux avec des densités cellulaires supérieures à 6 x 10 ⁶ cellules / ml), puis diluer avec précision les échantillons cellulaires à 6 x 10 ⁶ cellules / ml.

Pour les essais DHE et AUR, les signaux faibles peuvent être dues à l'utilisation de plaques à 96 puits non optimales, et donc, nous vous recommandons d'utiliser opaques plaques à 96 puits blanches. Par rapport au noir ou transparentdes plaques d'ent, le signal fluorescent est intensifiée capturé par réflexion sur la surface blanche, ce qui augmente considérablement le rapport signal-sur-bruit. L'inconvénient de plaques opaques blancs est, parfois, des signaux fluorescents puissants peuvent s'infiltrer dans les puits voisins. Toutefois, en utilisant 100 pl de volume de réaction et la concentration de la sonde décrite, nous n'avons détecté aucun signal fuyant en tant DHE et dosages AUR. En outre, il est recommandé d'effectuer des expériences pilotes pour optimiser la sensibilité de la fluorescence du lecteur de plaques. Prenant le lecteur de plaque SynergyMX titre d'exemple, sensibilité 100 et 70 fonctionnent le mieux pour le dosage DHE et AUR, respectivement. En outre, il est important de surveiller l'excitation et l'émission des spectres spécifiques dans les conditions de l'expérience, avec les cellules. En effet, nous avons observé un changement du maximum d'émission pour AUR à 590 nm, par rapport à 581 nm mentionnées par le fabricant. Enfin, nous avons obtenu des résultats légèrement meilleurs en excitant à 530 nm au lieu de 568nm suggéré par le fabricant.

Par rapport à une solution stock AUR, la solution stock DHE est beaucoup plus sensible à l'oxydation, même à l'abri de la lumière à -20 ° C. Ainsi, il est préférable d'utiliser le stock DHE dans les 10 jours après la dissolution de la poudre. Si la couleur de la solution de change du gris au violet ou rose, jeter et préparer frais à partir de poudre ^18.

Dans l'essai AUR, tant AUR et HRP pourraient être prises par macropinocytose. Par conséquent, le signal fluorescent résultant de l'oxydation par H ₂ O ₂ peut également être généré en partie à l'intérieur des macropinosomes. Cependant, étant donné que le HPR AUR et ne pénètrent pas dans les membranes cellulaires, le signal mesuré à l'intérieur des macropinosomes par le dosage est toujours AUR topologiquement équivalente à un signal extracellulaire, par opposition à un signal généré dans le cytosol.

Basé sur une série de tests préliminaires pour les deux DHE et analyses AUR,il semble important d'utiliser un tampon simple qui ne contient pas de glucose ou d'autres composants de médias biologiques, parce qu'ils interfèrent fortement avec les deux dosages et conduisent à un signal fluorescent artefact élevé. Par conséquent, on utilise un tampon au phosphate Sorensen complété avec 0,12 M de sorbitol, un osmolyte non digestible utilisé pour définir une osmolarité similaire à celle du milieu de culture de Dictyostelium ^19. A noter que la forte teneur en sel de tampons d'iso-osmotiques utilisés pour les cellules de mammifères, tels que le PBS, est préjudiciable à Dictyostelium.

Les protocoles présentés ici ne peuvent mesurer possible ROS, comme l'hypochlorite, les radicaux hydroxyle et l'oxygène singulet, et leurs localisations intracellulaires. Un tableau plus complet de la production de ROS est toujours limitée par la disponibilité et le développement de sondes spécifiques.

Cet ensemble de protocoles peut être facilement adaptée à d'autres cellules de mammifères, y compris les phagocytes, avec le texte suivant MODIFICation. Par exemple dans le dosage OBG, milieu sans FCS et le rouge de phénol peut être utilisé pour obtenir une faible fluorescence de fond. Dans DHE et AUR dosages, le tampon PBS peut être utilisé à la place de SS6.4, et le nombre de cellules ensemencées dans chaque puits pour obtenir une couche confluente peut être adapté par essai et erreur, en fonction de leur taille. Les concentrations de HRP, AUR et DHE peuvent également être optimisés dans des expériences pilotes afin d'obtenir les résultats les plus sensibles. Cependant, les effets indésirables possibles de DMSO doivent être testées en utilisant des concentrations accrues de AUR et / ou des réactifs de DHE. Nous avons testé DHE et AUR dosages avec succès avec un autre protozoaire, Acanthamoeba castellanii et avec une ligne de cellules BV2 de microglie de la souris. En outre, la DHE essais et AUR peut également être utilisé pour mesurer la production des ROS lors des interactions hôte-pathogène, par exemple lors de l'infection de Dictyostelium ou Acanthamoeba par mycobactéries marinum.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx